本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及抗氟喹諾酮類藥物簇特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單抗和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：氟喹諾酮類藥物作為人工合成抗生素類藥物，以抗菌能力強(qiáng)、機(jī)體利用率高、與其它種類抗生素對(duì)細(xì)菌無(wú)交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)(作為一線抗菌藥應(yīng)用于臨床)、農(nóng)副水產(chǎn)品(作為畜禽水產(chǎn)動(dòng)物的重要抗菌藥用于預(yù)防以及治療細(xì)菌性疾病)生產(chǎn)中，當(dāng)前氟喹諾酮類抗菌藥在食品樣本中呈多組分混合高殘留趨勢(shì)，更為憂慮的是相關(guān)制藥企業(yè)、醫(yī)院和農(nóng)副水產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)中上述抗生素在環(huán)境中擴(kuò)散造成土壤和地表水源中極微量殘留對(duì)人類健康夠成巨大潛在威脅，因此對(duì)氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)、監(jiān)控不僅有待測(cè)樣本面多量廣的需求(要求對(duì)待測(cè)樣本高通量快速定性篩查)，同時(shí)有經(jīng)快速定性檢測(cè)定性為陽(yáng)性樣本精確定量分析需求，更有ppt(pg/ml(g))級(jí)的極微量殘留待測(cè)樣本經(jīng)高倍富集后的精確定量測(cè)定需求。綜合各領(lǐng)域氟喹諾酮類藥物使用情況目前需檢測(cè)殘留主要對(duì)象以恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、雙氟沙星(達(dá)氟沙星)等。依據(jù)目前多種氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)技術(shù)特點(diǎn)與應(yīng)用范圍，免疫檢測(cè)方法已成為其殘留高通量快速定性篩查或半定量分析不可替代的技術(shù)手段。目前對(duì)氟喹諾酮類藥物殘留快速定性篩查以及半定量分析主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA和免疫金標(biāo)卡二種檢測(cè)模式，二種模式中盡管免疫金標(biāo)卡靈敏度略低于間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)靈敏度(綜合現(xiàn)有文獻(xiàn)：免疫金標(biāo)卡檢測(cè)限(T線完全消失)約為間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的IC50值5-10倍)，但免疫金標(biāo)卡以便于保存、試驗(yàn)時(shí)間短(5-10min可判讀結(jié)果)、試驗(yàn)結(jié)果直觀(可用肉眼直接觀察，無(wú)需借助任何儀器設(shè)備分析)等優(yōu)點(diǎn)備受基層檢測(cè)用戶青睞，占氟喹諾酮藥物快檢市場(chǎng)大部分份額。目前商業(yè)化氟喹諾酮類藥物快檢金標(biāo)卡存在二大缺陷：1、檢測(cè)限偏低:商品化金標(biāo)卡氟喹諾酮藥物單組分檢測(cè)限(T線完全消失)約為10ppb，而農(nóng)業(yè)部對(duì)上述8種藥物最低殘留標(biāo)準(zhǔn)為：30-100ppb，以該標(biāo)準(zhǔn)用5-10×體積緩沖液制備待測(cè)樣本勻漿上清，不對(duì)目標(biāo)物富集前提下，其含量極有可能已低于該檢測(cè)限，無(wú)法對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行有效定性篩查，改用小于5×體積緩沖液制備待測(cè)樣本勻漿上清不僅不利于待測(cè)樣本中目標(biāo)物充分釋放影響檢測(cè)準(zhǔn)確性出現(xiàn)假陰性導(dǎo)致漏檢，同時(shí)極有可能因樣本基質(zhì)含量過(guò)高干擾抗體對(duì)目標(biāo)物識(shí)別影響檢測(cè)特異性出現(xiàn)假陽(yáng)性導(dǎo)致錯(cuò)檢，因而免疫金標(biāo)卡單組分檢測(cè)限應(yīng)小于等于3ppb才能充分滿足用戶實(shí)際需求；2、通用性不強(qiáng):趙銀麗等在文獻(xiàn)中報(bào)道利用自主制備恩諾沙星強(qiáng)特異性單克隆抗體作標(biāo)記抗體研制金標(biāo)卡其對(duì)恩諾沙星的檢測(cè)限(T線完全消失)小于等于3ppb，并以雞肌肉作模式基質(zhì)恩諾沙星外標(biāo)摻入回收試驗(yàn)獲得了良好的回收結(jié)果，但因與其他喹諾酮藥物無(wú)交叉反應(yīng)，僅能作恩諾沙星單組分殘留強(qiáng)特異性分析，更為不利的是恩諾沙星經(jīng)體內(nèi)代謝部分轉(zhuǎn)化為環(huán)丙沙星，利用該免疫金標(biāo)卡無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定恩諾沙星給藥后體內(nèi)恩諾沙星和環(huán)丙沙星混合殘留，其他氟喹諾酮藥物如諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星等目標(biāo)物的免疫檢測(cè)產(chǎn)品亦有一些零星報(bào)道，但多以對(duì)其目標(biāo)物強(qiáng)特異性等特點(diǎn)更適合單組分測(cè)定。而食品樣本中氟喹諾酮藥物的殘留呈多組分混合殘留的趨勢(shì)，因而無(wú)法用單一抗體免疫檢測(cè)產(chǎn)品對(duì)多組分殘留同時(shí)作定性或半定量分析。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供抗氟喹諾酮類藥物簇特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生的單抗，使得所述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)具有更高的靈敏度。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生的單抗，使得所述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的簇特異性單克隆抗體對(duì)多種氟喹諾酮類藥物識(shí)別與結(jié)合有良好免疫交叉性，能夠同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星等。本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生的單抗在檢測(cè)氟喹諾酮類藥物殘留樣本的ELISA檢測(cè)以及制備氟喹諾酮類藥物殘留免疫檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，保藏編號(hào)為CCTCCNO.C2015221，命名為雜交瘤細(xì)胞株11F10，并于2015年12月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)內(nèi)。同時(shí)，本發(fā)明還提供一種抗氟喹諾酮類藥物簇特異性單克隆抗體，由保藏編號(hào)為CCTCCNO.C2015221的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。制備抗氟喹諾酮類藥物簇特異性單克隆抗體可采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)方法，如用雜交瘤細(xì)胞株通過(guò)體內(nèi)誘生方式獲取小鼠腹水來(lái)大量生產(chǎn)高濃度該單抗蛋白樣本，具體可參照如下方法：從液氮罐中取凍存雜交瘤細(xì)胞株-11F10，用10％FBS+RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液復(fù)蘇于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于5％CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3d按1：3-5分瓶傳代，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收集細(xì)胞，低速離心去除培養(yǎng)液，用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞用于小鼠接種；按0.5ml/只降植烷腹腔注射Balb/c八周齡雄鼠，致敏7天后，再按1-2×106/只雜交瘤細(xì)胞腹腔注射上述致敏鼠，7-10天后采集腹水，1000r/min離心10min去除腹水中細(xì)胞，取上清12000r/min離心30min以去除腹水中細(xì)胞碎片，取上清以O(shè)D280和OD260值初步標(biāo)定總蛋白含量，取少許作單抗的評(píng)估、一部分用于下一步抗體純化，其余部分分裝-80℃凍存?zhèn)溆谩１景l(fā)明按照上述方法獲得的誘生腹水樣本經(jīng)proteinGresin一步法過(guò)濾洗脫等步驟獲純化抗體蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果顯示：腹水純化物僅有含50Kd(抗體重鏈)和25Kd(抗體輕鏈)二條明顯蛋白條帶，無(wú)其他雜蛋白帶，表明通過(guò)本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株誘生腹水樣本經(jīng)親和層析法可獲得高純度單抗蛋白(純度大于等于99％),可以滿足制備實(shí)用型免疫金標(biāo)卡和免疫親和層析膠中檢測(cè)抗體需求。針對(duì)現(xiàn)有氟喹諾酮類藥物免疫檢測(cè)金標(biāo)卡檢測(cè)靈敏度低(單組分T線消失約10ppb)、通用性差不能充分滿足現(xiàn)有食品等待測(cè)樣本快速定性篩查需求技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明從恩諾沙星作半抗原制備的幾株單克隆雜交瘤細(xì)胞株中通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)遴選出一株細(xì)胞株-11F10，其分泌針對(duì)氟喹諾酮類藥物簇特異性單抗具有高靈敏度、強(qiáng)通用性。具體地，所述單抗對(duì)諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星有極高檢測(cè)靈敏度(IC50：0.292-0.561ng/ml),其它四種藥物與原始半抗原-恩諾沙星有良好免疫交叉性(交叉率大于50％)。不僅如此，該單抗還對(duì)食品和醫(yī)藥領(lǐng)域使用頻率極高另一種氟喹諾酮藥物-氧氟沙星有較高親和力(IC50為1.592ng/ml)，可部分作為氧氟沙星專用檢測(cè)試劑盒替代品用于氧氟沙星初步篩查；該單克隆抗體對(duì)洛美沙星、沙拉沙星有一定親和力(IC50分別為6.573，7.321ng/ml)。由此可知，本發(fā)明所述單抗在極高靈敏度下可同時(shí)測(cè)定五種氟喹諾酮藥物、在高靈敏度下可同時(shí)測(cè)定六種氟喹諾酮藥物，在一般靈敏度下可同時(shí)測(cè)定八種氟喹諾酮藥物?；谝陨媳景l(fā)明所述抗氟喹諾酮類藥物簇特異性單克隆抗體的有益效果，本發(fā)明提供了所述雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單克隆抗體在檢測(cè)氟喹諾酮類藥物的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒以及制備檢測(cè)氟喹諾酮類藥物的其他免疫檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用；其中，所述氟喹諾酮類藥物優(yōu)選為恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、洛美沙星和/或沙拉沙星。本發(fā)明所述檢測(cè)氟喹諾酮類藥物的其他免疫檢測(cè)產(chǎn)品優(yōu)選為免疫金標(biāo)卡、免疫親和層析色譜膠或由此預(yù)填裝的免疫親和層析色譜柱。在免疫金標(biāo)卡制備中，本發(fā)明優(yōu)選通過(guò)碳二亞胺法或混合酸酐法二種偶聯(lián)方式將恩諾沙星標(biāo)樣與陽(yáng)離子化高純度牛血清白蛋白(cBSA)偶聯(lián)制備出偶聯(lián)物作為包被抗原做測(cè)試線(T線)，以山羊抗小鼠IgG二抗包被作質(zhì)控線，即對(duì)照線(C線)，供裝配免疫金標(biāo)卡選擇使用；同時(shí)，將本發(fā)明所述單抗以膠體金作標(biāo)記并噴涂于結(jié)合墊(膠金墊)上。本發(fā)明采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金顆粒，并采用系列稀釋濃度單抗蛋白加固定量膠體金微孔孵育法進(jìn)行優(yōu)化標(biāo)記配比。其他諸如樣品墊、層析膜(NC膜)、吸收墊、支持底板等均可以參照現(xiàn)有常規(guī)金標(biāo)卡的制備，本發(fā)明所述免疫金標(biāo)卡結(jié)構(gòu)示意圖參見圖1。在免疫親和層析色譜膠的制備中，本發(fā)明通過(guò)純化單抗蛋白樣本與CNBr-activatedSepharose-4B化學(xué)交聯(lián)-即固相化抗體而獲得，而所述免疫親和層析色譜柱IAC(immunoaffinitychromatographycartri-dges)是將所述免疫親和層析色譜膠預(yù)填充于層析專用柱床中而獲得。由于本發(fā)明經(jīng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)所述單克隆抗體所具備的上述優(yōu)異特性，使得本發(fā)明所述的免疫金標(biāo)卡、免疫親和層析色譜膠以及由此預(yù)填裝的免疫親和層析色譜柱同樣具有較優(yōu)的性能。本發(fā)明免疫金標(biāo)卡對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星單組分標(biāo)樣檢測(cè)限(T線完全消失)小于等于3ppb,對(duì)氧氟沙星檢測(cè)限小于等于20ppb，對(duì)洛美沙星、沙拉沙星檢測(cè)限小于等于100ppb，同時(shí)用上述檢測(cè)限小于等于3ppb五種藥物的三組分隨機(jī)組合混標(biāo)物(單組分均為1ppb，總濃度為3ppb)均能使T線消失說(shuō)明該單抗對(duì)上述藥物之間識(shí)別以及與之結(jié)合無(wú)干擾效應(yīng)，同時(shí)有對(duì)基質(zhì)強(qiáng)抗干擾力(以豬肉作模式基質(zhì)作單組分外標(biāo)與單組分標(biāo)樣有良好相關(guān)性)等特點(diǎn)。所述免疫親和層析色譜膠或由此填裝免疫親和層析色譜柱具有目標(biāo)物高選擇性(于溫和液相反應(yīng)體系中強(qiáng)選擇性將目標(biāo)物固相化實(shí)現(xiàn)與待測(cè)樣本中液相基質(zhì)高效分離)、目標(biāo)物強(qiáng)富集性(利用對(duì)目標(biāo)物高親和力的固相化抗體將大體積液相樣本中極微量目標(biāo)物迅速固相化實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物高倍率富集)、針對(duì)多種目標(biāo)物的強(qiáng)通用性(在結(jié)合容量范圍內(nèi)固相化抗體能同時(shí)結(jié)合多種，至少是本發(fā)明提及8種氟喹諾酮類藥物)；獲取免疫親和層析色譜膠或由此填裝成免疫親和層析色譜柱產(chǎn)品后，根據(jù)待測(cè)樣本中目標(biāo)物初步估計(jì)含量以及HPLC-FLD有效檢測(cè)范圍，分裝出二種規(guī)格產(chǎn)品供用戶選擇使用:1、針對(duì)小體積高含量目標(biāo)物殘留(目標(biāo)物單組分達(dá)ppb級(jí))樣本：采用待測(cè)樣本勻漿上清與免疫親和層析膠共同孵育結(jié)合-離心洗滌-加等體積或小于原體積但能滿足上機(jī)體積的洗脫液孵育洗脫-離心獲取洗脫液樣本直接上機(jī)測(cè)定等步驟。該處理方式主要發(fā)揮免疫親和層析膠對(duì)目標(biāo)物強(qiáng)大選擇性，以固-液二相分離方式將待測(cè)樣本中基質(zhì)去除，獲取高純度目標(biāo)物供機(jī)測(cè)。該方式主要適用于食品待測(cè)樣本或其他氟喹諾酮類藥物高殘留樣本(ppb級(jí))的測(cè)定；2、針對(duì)大體積極低含量目標(biāo)物殘留(目標(biāo)物單組分為ppt級(jí))樣本：采用大體積待測(cè)樣本上清上免疫親和層析膠柱(IACcartridges)過(guò)濾結(jié)合-充分洗滌-取下層析膠加小體積洗脫液孵育洗脫-離心獲取洗脫液上清樣本-上機(jī)測(cè)定等步驟。該處理方式主要是發(fā)揮IAC對(duì)目標(biāo)物強(qiáng)大親和力，將大體積樣本中極微量目標(biāo)物充分富集于親和層析膠中，再用小體積洗脫液將結(jié)合目標(biāo)物充分洗脫，獲取高富集倍率高純度目標(biāo)物樣本供機(jī)測(cè)，該方式主要適用于環(huán)境(地表水、地下水、土壤等)中極微量氟喹諾酮類樣本的檢測(cè)。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株可穩(wěn)定分泌氟喹諾酮類藥物簇特異性單克隆抗體，所述抗體與環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星等藥物結(jié)合具有高靈敏度和強(qiáng)通用性，可應(yīng)用于氟喹諾酮類藥物檢測(cè)產(chǎn)品如免疫金標(biāo)卡、免疫親和層析色譜膠/免疫親和層析預(yù)裝柱的制備中，所制備的檢測(cè)產(chǎn)品對(duì)目標(biāo)物結(jié)合同樣具有高靈敏度、高選擇性、強(qiáng)富集性和強(qiáng)通用性，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品以及環(huán)境領(lǐng)域中主要氟喹諾酮類藥物痕量殘留定性以及半定量分析。生物保藏信息說(shuō)明用于保藏的雜交瘤細(xì)胞株-11F10的分類命名為：氟喹諾酮藥物簇特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。保藏單位全稱：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位簡(jiǎn)稱：CCTCC保藏單位地址：武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)內(nèi)；保藏日期：2015年12月7日；保藏編號(hào)：CCTCCNO.C2015221。附圖說(shuō)明圖1所示為本發(fā)明所述免疫金標(biāo)卡結(jié)構(gòu)示意圖；圖2所示為本發(fā)明中單抗純化后的SDS-PAGE電泳圖；圖中泳道1為蛋白分子量Marker；泳道2為雜交瘤細(xì)胞株-11F10誘生腹水；泳道3為3×稀釋的雜交瘤細(xì)胞株-11F10誘生腹水；泳道4為純化單抗蛋白；圖3所示為兩種偶聯(lián)法合成恩諾沙星偶聯(lián)物紫外檢測(cè)圖；圖4所示為八種氟喹諾酮藥物間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的抑制曲線，各曲線從左到右依次為諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星；圖5所示為膠體金顆粒紫外可見連續(xù)掃描圖；圖6所示為膠體金顆粒透射電鏡觀察圖；圖7所示為膠體金粒徑分布柱形圖；圖8所示為免疫金標(biāo)卡對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星的單組分標(biāo)樣檢測(cè)結(jié)果圖；圖中1-7分別表示0、0.03、0.1、0.3、1、3、10ppb濃度；圖9所示為免疫金標(biāo)卡對(duì)氧氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星的單組分標(biāo)樣檢測(cè)結(jié)果圖；圖10所示為免疫金標(biāo)卡對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星五種氟喹諾酮類藥物三組分等濃度混標(biāo)物檢測(cè)結(jié)果圖；圖中第一組為空白對(duì)照，第2-11組依次為如下組合：恩諾沙星+環(huán)丙沙星+諾氟沙星；恩諾沙星+環(huán)丙沙星+培氟沙星；恩諾沙星+環(huán)丙沙星+依諾沙星；恩諾沙星+諾氟沙星+培氟沙星；恩諾沙星+諾氟沙星+依諾沙星；恩諾沙星+培氟沙星+依諾沙星；環(huán)丙沙星+諾氟沙星+培氟沙星；環(huán)丙沙星+諾氟沙星+依諾沙星；諾氟沙星+培氟沙星+依諾沙星；環(huán)丙沙星+培氟沙星+依諾沙星；圖11所示為不同儲(chǔ)存期的免疫金標(biāo)卡對(duì)恩諾沙星檢測(cè)結(jié)果圖；圖中1-4分別表示0、1、3、10ng/ml濃度；圖12所示為25、50、100ng/ml環(huán)丙沙星經(jīng)免疫親和層析洗脫樣本的HPLC-FLD檢測(cè)圖；圖13所示為25、50、100ng/ml恩諾沙星經(jīng)免疫親和層析洗脫樣本的HPLC-FLD檢測(cè)圖；圖14所示為25、50、100ng/ml諾氟沙星經(jīng)免疫親和層析洗脫樣本的HPLC-FLD檢測(cè)圖；圖15所示為25、50、100ng/ml沙拉沙星經(jīng)免疫親和層析洗脫樣本的HPLC-FLD檢測(cè)圖；圖16所示為環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星和沙拉沙星免疫親和層析回收率曲線圖，圖中4種藥物的回收率為三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)而獲得；圖17所示為恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星摻入胎牛血清樣本免疫親和層析回收率柱形圖，圖中5種藥物的回收率為三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)而獲得；圖18所示為恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星標(biāo)樣以及同處理?yè)饺?％胎牛血清樣本經(jīng)免疫親和層析洗脫液的HPLC-FLD檢測(cè)圖；圖19所示為濃度分別為50pg/ml恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星藥物100ml混合液經(jīng)免疫親和層析柱濃縮后洗脫樣本的HPLC-FLD檢測(cè)圖；圖20所示為恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星五種混標(biāo)物經(jīng)免疫親和層析高倍富集后的回收率。具體實(shí)施方式：本發(fā)明公開了抗氟喹諾酮類藥物簇特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生的單抗和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明在免疫金標(biāo)卡的制備中，優(yōu)選通過(guò)碳二亞胺偶聯(lián)法或混合酸酐法二種偶聯(lián)方式將恩諾沙星標(biāo)樣與高純度陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(cBSA)偶聯(lián)制備出偶聯(lián)物為包被抗原作測(cè)試線(T線)，兩種方法參考如下：1、碳二亞胺偶聯(lián)法先將乙二胺(EDA)與牛血清白蛋白混合溶解于0.01MPBS(pH7.0)液中，在化學(xué)偶聯(lián)劑-二環(huán)乙基碳二亞胺(EDC)作用下，封閉牛血清白蛋白分子中-COOH殘基，經(jīng)透析去除過(guò)量的EDA和EDC，獲得陽(yáng)離子化的牛血清白蛋白(cBSA)作為蛋白載體。將恩諾沙星(EF)標(biāo)樣溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、EDC室溫條件下避光反應(yīng)過(guò)夜，形成活化酯；低速離心取上清與上述cBSA液混合，混合液保持33％DMF，室溫避光振蕩反應(yīng)過(guò)夜，高速離心取上清置于透析袋中，冰水浴(0–4℃)下在33％DMF/0.01MPBS(pH7.0)溶液中進(jìn)行透析。每4小時(shí)換一次透析液，每換一次DMF濃度遞減5％，重復(fù)六次后，加無(wú)DMF0.01MPBS(pH7.0)繼續(xù)透析過(guò)夜后，將反應(yīng)液從透析袋中小心轉(zhuǎn)移至樣品瓶中封口，于-80℃預(yù)冷凍后并冷凍干燥得白色固體粉末EF-cBSA。紫外可見光譜測(cè)定偶聯(lián)比。2、混合酸酐法精確稱取一定量恩諾沙星(EF)標(biāo)樣，溶于一定量DMF中，室溫下加正三丁胺，搖勻后加氯甲酸異丁酯,室溫避光攪拌反應(yīng)1h，得恩諾沙星反應(yīng)液，精確稱取一定量BSA溶于碳酸鹽緩沖液CBS(pH9.6)。將恩諾沙星反應(yīng)液滴加至BSA液中，室溫下攪拌反應(yīng)3h，分別用100×CBS透析24h，每4h換液一次，再用PBS透析2d，取少許進(jìn)行紫外分光(測(cè)200-400nm峰)，其余部分制備成凍干粉，并估算出鹽份比。本發(fā)明采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金顆粒，即在氯金酸(HAuCl4.3H2O)水溶液中滴加檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H2O)溶液經(jīng)還原獲取膠體金顆粒，再經(jīng)0.22μm微孔膜過(guò)濾去除大顆粒，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件獲取粒徑約為20nm均一膠體金顆粒，離心取沉淀備用。本發(fā)明采用系列稀釋單抗蛋白加固定量膠體金微孔孵育法，并以反應(yīng)孔不出現(xiàn)蛋白聚沉同時(shí)膠體金仍保持紅色不變的最高稀釋度為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定待標(biāo)單抗蛋白與膠體金最適標(biāo)記濃度，以上述蛋白與膠體金合適的比例按實(shí)際需要進(jìn)行單抗與膠體金標(biāo)記，標(biāo)記后的單抗膠體金探針懸浮于膠體金緩沖液中。本發(fā)明在免疫親和層析色譜膠以及由此預(yù)裝色譜柱的制備中，所需用于交聯(lián)的高純度單克隆抗體蛋白可通過(guò)如下方式獲得：雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞株-11F10體內(nèi)誘生腹水作樣本，經(jīng)proteinGresin純化獲取洗脫部分收集液，各加1/10×體積1MTris-Cl(pH8.5)中和后，蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度大于等于2mg/ml以及經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定抗體純度大于等于99％(蛋白電泳圖譜中僅有50kd和25kd二條蛋白帶)作為合格單抗蛋白純品，合并上述合格收集液樣本，經(jīng)0.01MPBS(pH7.4)反透析24h后，再用0.1MNaHCO3,0.5MNaCl(pH8.3)反透析24h，該樣本作單抗樣本準(zhǔn)備液與CNBr-activatedSepharose-4B化學(xué)交聯(lián)。單克隆抗體純化蛋白與一定量CNBr-activatedSepharose-4B按GE公司提供標(biāo)準(zhǔn)方法將抗體蛋白化學(xué)交聯(lián)于Sepharose-4B小珠上，具體如下：稱取適量CNBr-activatedSepharose-4Bpowder,經(jīng)1mMHCl溶脹-淘洗等步驟后，用0.1MNaHCO3/0.5MNaCl(pH8.3)淘洗一次，低速離心去除上清液按2mg單抗純化蛋白/ml膠用上述的單抗樣本準(zhǔn)備液與該膠進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，交聯(lián)后離心取上清測(cè)定蛋白含量分析交聯(lián)效果，交聯(lián)后膠體再經(jīng)-封閉-二種緩沖液交替淘洗等步驟后，最終將交聯(lián)膠懸浮于10×體積0.1MTris-HCl/0.5MNaCl(pH8.3)液中，于4℃保存?zhèn)溆谩Ｏ旅婢捅景l(fā)明提供的抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單抗和應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1：本發(fā)明所述單克隆抗體樣本的體內(nèi)誘生1、雜交瘤細(xì)胞株-11F10復(fù)蘇與增殖從液氮罐中取雜交瘤細(xì)胞株-11F10凍存管，于37℃水浴中迅速融化，600r/min離心5min,棄上清，加新鮮15％FBS/RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，各補(bǔ)加上述培養(yǎng)液至5ml后，種植于50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至30％密度后半換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)60％左右(處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)傳代，每隔2-3天按1:3-4傳代一次。2、單抗蛋白的體內(nèi)誘生與腹水獲取在體內(nèi)種植雜交瘤細(xì)胞前7-10d，取12只8周齡雄性BALB/c鼠按0.5ml/只腹腔注射降植烷，注射后精心飼養(yǎng)備用。取上述處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)瓶，輕輕拍打細(xì)胞瓶壁使細(xì)胞脫落，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至50ml離心管中，600r/min離心12min,棄培養(yǎng)液，加等體積無(wú)血清RPMI-1640重懸細(xì)胞，再離心一次棄RPMI-1640，按1～2x106/0.5ml用無(wú)血清RPMI-1640重懸細(xì)胞備用。致敏7-10天后，按1～2×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞/只腹腔注射上述致敏鼠，7～10天后采集腹水，1000rpm離心10min，以去除腹水中細(xì)胞，取上清后12000rpm離心30min，以去除腹水中細(xì)胞碎片，再取上清，紫外分光光度計(jì)分別測(cè)OD280和OD260值，按1.51×OD280-0.73×OD260公式粗估其總蛋白量，并將上述腹水分成三份，一分用作間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定，一分用于抗體蛋白的純化，其余-20℃凍存?zhèn)溆谩Ｗ⑸潆s交瘤細(xì)胞株-11F107～10天后，從12只誘生鼠中共采集腹水約30ml，經(jīng)紫外分光光度計(jì)分別測(cè)OD280和OD260值，按1.51×OD280-0.73×OD260公式其總蛋白含量約為50mg/ml。實(shí)施例2：本發(fā)明所述單克隆抗體蛋白的純化冰水浴預(yù)冷0.01MPBS(pH8.0)4×稀釋腹水作準(zhǔn)備液。按50mg總蛋白：1mlProteinGResin將該膠填充于層析用小柱(10ml)中，用50×于柱床體積的預(yù)冷0.01MPBS(pH8.0)平衡層析柱后，室溫下準(zhǔn)備液經(jīng)ProteinGResin柱自然流速過(guò)濾五次，使腹水中的單克隆抗體蛋白充分與蛋白G特異性結(jié)合，再用50×于柱床體積的預(yù)冷0.01MPBS(pH8.0)液充分淋洗層析柱，以去除粘附于層析膠中的雜蛋白。每1.5mlEP管預(yù)加入100μl1MTris-Cl(pH9.6)，上述處理層析柱中加入冰冷0.1MGlycine-HCl(pH2.7)洗脫，濾液按0.9ml/管分部收集，收集管各取少許濾液用測(cè)量OD280蛋白峰，合并蛋白峰管，合并液置于透析袋中，于冰冷0.01MPBS(pH7.4)液中透析過(guò)夜。再取少許SDS-PAGE電泳鑒定，其余部分分裝-80℃凍存?zhèn)溆?。按照上述方法，?0ml11F10株誘生腹水作原料，經(jīng)5次proteinGresin一步法純化共獲23.5ml純化蛋白洗脫液，經(jīng)0.01MPBS(pH7.4)透析后獲得25.8ml蛋白懸液，經(jīng)Bradford法鑒定其蛋白含量為3.05mg/ml，即共獲得78.6mg單克隆抗體純化蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定(見圖2)，結(jié)果顯示腹水純化物僅有含50Kd(抗體重鏈)和25Kd(抗體輕鏈)二條明顯蛋白條帶，無(wú)其他雜蛋白帶，表明本發(fā)明已經(jīng)獲得高純度單抗蛋白(純度大于等于99％),可以滿足制備實(shí)用型免疫金標(biāo)卡和免疫親和層析膠中檢測(cè)抗體需求。實(shí)施例3：用于免疫膠體金檢測(cè)卡(金標(biāo)卡)和建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的包被抗原(EF-cBSA偶聯(lián)物)制備1、恩諾沙星與牛血清白蛋白偶聯(lián)(碳二亞胺偶聯(lián)法，用于間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA包被抗原)載體蛋白的封閉：將20μl乙二胺，23.6mgBSA，25.6mgEDC，依次溶于1mL0.01MPBS(pH7.0)中，振蕩過(guò)夜(20℃，110r/min)，0.01MPBS(pH7.0)透析24h備用。偶聯(lián)：稱取15.3mgEF(恩諾沙星)，5.2mgNHS，9.3mgEDC溶于500μlDMF，室溫避光振蕩過(guò)夜(20℃，110r/min)，3000r/min離心5min，取100μl上清加入2ml含5mg上述蛋白中(含33％DMF/0.01PBS(pH7.0)配制)，室溫避光振蕩過(guò)夜(20℃，110r/min)，3000r/min離心5min，取上清于透析袋中，分別用100×體積冰冷33％、28％、23％、18％、13％DMF/PBS各透析4h后，再用0.01MPBS(pH7.0)透析過(guò)夜。取少許進(jìn)行紫外分光(測(cè)200-400nm峰)和SDS-PAGE電泳鑒定，其余部分制備成凍干粉。2、恩諾沙星與牛血清白蛋白偶聯(lián)(混合酸酐法，于免疫金標(biāo)卡中作包被抗原)精確稱取10.8mgEF標(biāo)樣，溶于600μlDMF中，室溫下加入9μl正三丁胺，搖勻后加入6μl氯甲酸異丁酯,室溫避光攪拌反應(yīng)1h，得恩諾沙星反應(yīng)液，精確稱取19.8mgBSA溶于6mlCBS(0.05MNa2CO3/NaHCO3(pH9.6))。將恩諾沙星反應(yīng)液滴加BSA液中，室溫下攪拌反應(yīng)3h，分別用100×CBS透析24h，每4h換液一次，再用PBS透析2d，取少許進(jìn)行紫外分光(測(cè)200-400nm峰)和SDS-PAGE電泳鑒定，其余部分制備成凍干粉，并估算出鹽份比。3、恩諾沙星與牛血清白蛋白偶聯(lián)物紫外分析通過(guò)1中的碳二亞胺偶聯(lián)法，共獲得約100mg(以蛋白含量計(jì))恩諾沙星與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的凍干粉，經(jīng)波長(zhǎng)240-400nm紫外連續(xù)檢測(cè)，偶聯(lián)物在278nm處(與純蛋白峰對(duì)比前置)和330-350nm處均有明顯的吸收峰，見圖3的碳二亞胺法偶聯(lián)物紫外檢測(cè)曲線；通過(guò)2中的混合酸酐法共獲得約20mg(以蛋白含量計(jì))恩諾沙星與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的凍干粉，經(jīng)連續(xù)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)，偶聯(lián)物在278nm處(與純蛋白比前置)和330-350nm處均有明顯的吸收峰，見圖3的混合酸酐法偶聯(lián)物紫外檢測(cè)曲線；陽(yáng)離子化BSA在330-350nm處無(wú)有明顯恩諾沙星特征吸收峰在278nm處有明顯的蛋白特征峰級(jí)，見圖3的牛血清白蛋白檢測(cè)線；而二種偶聯(lián)方式獲偶聯(lián)物均有恩諾沙星特征吸收峰；該結(jié)果表明通過(guò)上述二種偶聯(lián)法恩諾沙星均已成功偶聯(lián)在蛋白分子上，經(jīng)[OD278/BSA分子量]/[OD334/(3.4×ENF分子量)]公式計(jì)算：二種偶聯(lián)法獲得偶聯(lián)物的恩諾沙星與BSA摩爾比分別為13:1和15：1，已滿足后續(xù)免疫試驗(yàn)包被抗原的需求。實(shí)施例4：誘生腹水樣本對(duì)恩諾沙星親和力以及對(duì)恩諾沙星類似物免疫交叉性分析1、棋盤ELISA(checker-boardELISA)標(biāo)定包被抗原工作濃度和腹水工作稀釋度(1)包被緩沖液:0.05MNa2CO3/NaHCO3(pH9.6):1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3加三蒸水至1000ml。(2)抗原包被：EF-cBSA(碳二亞胺合成法合成偶聯(lián)比為13:1)用包被液稀釋成9，3，1，0.333，0.111，0.037，0.012μg/ml后并分別包被于ELISA板的A-Gline(100μl/well)，同法將3μg/mLcBSA包被于該板的Hline作對(duì)照，于37℃濕孵1-1.5h后，置4℃冰箱濕孵過(guò)夜。(3)0.01MPBS(pH7.4)：2.9009gNa2HPO4.12H2O，0.2964gNaH2PO4.2H2O，8.5gNaCl加三蒸水至1000ml。(4)封閉液：1％OVA/0.01MPBS(pH7.4)。(5)洗滌：取包被板甩干，PBST洗滌3次(300μl/well)，拍干。(6)封閉：按340μl/well加封閉液，于37℃濕孵2.5h。(7)PBST：0.01MPBS(pH7.4)加入0.05％Tween20，混勻。(8)一抗稀釋液：0.1％OVA/PBS。(9)抗體稀釋：用一抗稀釋液將腹水樣本分別稀釋成：1:10000，20000，40000，80000，160000五個(gè)稀釋度，同時(shí)設(shè)1:10000溴泊特羅單抗誘生腹水(由本?；瘜W(xué)化工材料學(xué)院鄧安平教授提供)平行對(duì)照，分別加于ELISA板的1-2，3-4，5-6，7-8，9-10，11-12列中。(10)將板取出，甩干，用PBST洗滌3次，拍干。(11)加入100μl/well一抗孵育液，37℃濕孵2h。(12)二抗孵育液：用0.1％OVA/PBS液按1：500稀釋酶標(biāo)二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗)。(13)取出板，甩干，用PBST洗滌5次，拍干。(14)按100μl/well加二抗孵育液，37℃濕孵1.5h。(15)ELISA顯色液：4.86ml0.1MCitricacid液與5.14ml0.2MNa2HPO4液混合，加6mgOPD充分溶解后再加20μlH2O2，避光備用。(16)取出板，甩干，4次PBST洗滌+2次PBS洗滌。(17)顯色：甩干后，按100ul/well加上述顯色液，避光顯色3min，每孔加50μl2MH2SO4終止反應(yīng)。2、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定腹水樣本對(duì)恩諾沙星親和力以及對(duì)恩諾沙星結(jié)構(gòu)類似物免疫交叉率(1)碳酸鹽緩沖溶液的配制：同1中；(2)抗原包被：以上述間接ELISA試驗(yàn)標(biāo)定工作濃度的EF-cBSA再包被于4塊酶標(biāo)板的A-Gline孔中(100μl/well)。包被抗原對(duì)照：同濃度cBSA包被酶標(biāo)板的Hline(100μl/well),37℃濕孵1-1.5h再置4℃濕孵過(guò)夜。(3)洗滌、封閉、再洗滌同上。(4)抗體與游離半抗原的預(yù)結(jié)合：A:0.2％OVA/PBS將腹水樣本稀釋成1/2×標(biāo)定稀釋度作為工作濃度抗體備用。B:精確稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星等八種標(biāo)樣，用0.03MNaOH分別稀釋成100μg/ml作為儲(chǔ)存液備用。C:取5×6支1.5mlEP管，上述儲(chǔ)存液用0.01MPBS(pH7.4)將前五種藥物分別稀釋成0.2、0.6、1.8、5.4、16.2、48.6ng/ml六個(gè)稀釋度；再取3×6支1.5mlEP管,并將上述儲(chǔ)存液用0.01MPBS(pH7.4)將后三種藥物分別稀釋成1.8、5.4、16.2、48.6、145.8、437.4ng/ml六個(gè)稀釋度；每種藥各濃度點(diǎn)按0.35ml/管分別加上述6支EP管中，另取一支15ml離心管中加5.5ml0.01MPBS(pH7.4),加完后每支離心管中均加等體積的上述工作稀釋度抗體。D:上述的離心管于室溫振蕩(50-100r/min)孵育一小時(shí)。(5)一抗孵育：將上述含游離上述8種藥物單組分競(jìng)爭(zhēng)抗原一抗孵育液的六支試管一一對(duì)應(yīng)加上述酶標(biāo)板的A-Fline(100μl/well)×(1-6列或7-12列)的孔中(每個(gè)處理6個(gè)復(fù)孔),酶標(biāo)板的G\Hline孔中加PBS液處理一抗孵育液。37℃濕孵2h。(6)一抗孵育后的洗滌、二抗孵育、洗滌、顯色同上述間接ELISA方法。結(jié)果分析：酶標(biāo)儀讀每孔OD490值，按同欄的6個(gè)復(fù)孔求平均值(注：異常值予以剔除)，A-G欄的平均值均減去H欄(調(diào)零孔)平均值后作為各欄去除本底值后的實(shí)際值，將競(jìng)爭(zhēng)抗原各濃度點(diǎn)處理欄實(shí)際值命名為B，無(wú)競(jìng)爭(zhēng)抗原G欄實(shí)際值命名為B0，每欄的抑制率按:(B0-B)/B0×100％計(jì)算，再以每欄競(jìng)爭(zhēng)抗原的濃度作自變量，每欄的抑制率作因變量繪制抑制曲線，插入法求出IC20，IC50，IC80三個(gè)關(guān)鍵濃度點(diǎn)，其中IC50代表抗體對(duì)待測(cè)競(jìng)爭(zhēng)樣本的檢測(cè)靈敏度，IC20代表抗體對(duì)待測(cè)競(jìng)爭(zhēng)樣本的最高檢測(cè)限，IC20-IC80代表該抗體對(duì)待測(cè)競(jìng)爭(zhēng)樣本的有效檢測(cè)濃度范圍，再按(IC50ofenrofloxacin)/(IC50ofenrofloxacinanalog)×100％求其他7種藥物與恩諾沙星免疫交叉率，待測(cè)競(jìng)爭(zhēng)樣本主要技術(shù)參數(shù)見表1，相關(guān)抑制曲線圖見圖4。表1八種氟喹諾酮藥物間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)主要技術(shù)參數(shù)競(jìng)爭(zhēng)物IC20-IC80(ng/ml)IC50(ng/ml)與恩諾沙星免疫交叉率諾氟沙星0.064±0.003--2.35±0.1210.293±0.009121.16％恩諾沙星0.083±0.004--2.53±0.1350.355±0.011100％環(huán)丙沙星0.095±0.005--2.73±0.1310.451±0.01678.71％培氟沙星0.098±0.006--2.83±0.1380.473±0.01975.05％依諾沙星0.099±0.006--2.71±0.1360.561±0.02363.28％氧氟沙星0.283±0.031--23.55±1.5871.592±0.08922.30％洛美沙星1.55±0.126--71.34±3.1266.573±0.3685.40％沙拉沙星1.83±0.154--80.68±4.1387.321±0.4534.85％在棋盤ELISA中，以恩諾沙星與陽(yáng)離子化牛血清白蛋白偶聯(lián)物(碳二亞胺合成法)作包被抗原，陽(yáng)離子化牛血清白蛋白作包被抗原陰性對(duì)照；11F10細(xì)胞誘生腹水作試驗(yàn)一抗，溴布特羅單抗雜交瘤細(xì)胞誘生腹水作陰性一抗對(duì)照，其結(jié)果顯示：1μg/ml牛血清白蛋白包被抗原對(duì)照組與1:10000溴布特羅的誘生腹水作一抗對(duì)照組的OD490均小于等于0.05，該結(jié)果表明試驗(yàn)系統(tǒng)無(wú)非特異性反應(yīng)，其他試驗(yàn)組的OD490值與包被抗原以及一抗的稀釋度均呈強(qiáng)濃度依賴性，原始數(shù)據(jù)限于篇幅未詳細(xì)列出，從中選取OD490值為2.0-2.5的包被抗原濃度與一抗稀釋度分別為：0.111μg/ml和1：80000作工作濃度和一抗稀釋度用于競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)。以上述工作濃度包被抗原包被酶標(biāo)板，用1：80000腹水做一抗與上述系列濃度的八種氟喹諾酮藥物標(biāo)樣分別孵育后作競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)后得各濃度OD490平均值(三次獨(dú)立試驗(yàn))，按(B0-B)/B0×100％公式得每種藥物各濃度點(diǎn)抑制率，以濃度作橫坐標(biāo)，抑制率作縱坐標(biāo)得每種競(jìng)爭(zhēng)物標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線結(jié)果見圖4；按插入法得每種藥物20％-80％抑制率(IC20-IC80)的有效抑制濃度范圍，得每種藥物半抑制濃度(IC50代表系統(tǒng)對(duì)該藥物檢測(cè)靈敏度)，以(IC50ofenrofloxacin/IC50ofenrofloxacinanalog)×100％得七種氟喹諾酮藥物與恩諾沙星免疫交叉率，上述三大技術(shù)參數(shù)指標(biāo)見上表1，從表1和圖4得出：1.該單克隆抗體對(duì)諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星有極高檢測(cè)靈敏度(IC50從0.292-0.561ng/ml)，該四種藥物與恩諾沙星有良好免疫交叉性(交叉率大于50％)，該結(jié)果為下一步研制高靈敏度上述幾種氟喹諾酮類藥物強(qiáng)通用性其他形式免疫檢測(cè)產(chǎn)品提供了極其重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。2.該單克隆抗體對(duì)食品和醫(yī)藥領(lǐng)域使用頻率極高另一種氟喹諾酮藥物-氧氟沙星有較高親和力(IC50為1.592ng/ml)可部分作為氧氟沙星專用檢測(cè)試劑盒替代品用于氧氟沙星初步篩查。3.該單克隆抗體對(duì)洛美沙星、沙拉沙星有一定親和力(IC50分別為6.573，7.321ng/ml)。4.該單抗檢測(cè)通用性較高：極高靈敏度可同時(shí)測(cè)定五種氟喹諾酮藥物、高靈敏度可同時(shí)測(cè)定六種氟喹諾酮藥物，一般靈敏度可同時(shí)測(cè)定八種氟喹諾酮藥物。實(shí)施例5：膠體金的制備與質(zhì)量分析1、膠體金的制備取1％HAuCl4(由氯金酸加三蒸水配制)溶液0.5ml加入到49.5mL超純水中，所得氯金酸溶液濃度為0.01％，置于帶冷凝裝置(避免由于水的蒸發(fā)導(dǎo)致氯金酸溶液濃度降低)的三角燒瓶中加熱至沸騰，在磁力恒溫?cái)嚢杵骷訜釘嚢柘驴焖偌尤?％的檸檬酸三鈉溶液1.25mL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色。冷卻后置于棕色瓶中4℃冰箱保存。2、膠體金的質(zhì)量評(píng)估制備出的膠體金顆粒是膠體性質(zhì)，大小在15—30nm之間，微小的金顆粒穩(wěn)定均勻地分散在液體中，成為膠體金溶液，見清涼透明膠體金顆粒懸液。在遴選出一種優(yōu)質(zhì)單抗作檢測(cè)抗體以及合適半抗原蛋白偶聯(lián)物作檢測(cè)抗原后，免疫檢測(cè)金標(biāo)卡的穩(wěn)定性和檢測(cè)靈敏度取決于另一個(gè)重要因素即制備膠體金粒徑和顆粒均一性，本發(fā)明采用粒徑約為20nm作為原料制備單克隆抗體金標(biāo)探針，按100ml0.01％HAuCl4加1.5ml1％檸檬酸鈉比例經(jīng)經(jīng)典還原法得膠體金取少許進(jìn)行400-900nm可見光連續(xù)掃描結(jié)果見圖5，透射電鏡鑒定見圖6，不同粒徑相對(duì)數(shù)量見圖7，掃描圖顯示該膠體金液在522nm處有明顯吸收峰初步說(shuō)明膠體金液中大多數(shù)顆粒的粒徑在20nm,透射電鏡顯示金顆粒飽滿均勻，粒徑統(tǒng)計(jì)分析粒徑20nm顆粒數(shù)約占60％，粒徑為18nm和22nm顆粒數(shù)之和大約占30％，粒徑為16nm和24nm顆粒數(shù)之和大約占10％。通過(guò)圖5-7表明本發(fā)明已獲得了粒徑合適，大小較均一膠體金的顆粒，滿足了下一步單克隆抗體膠體金探針的制備。實(shí)施例6：金標(biāo)抗體的制備1、純化抗體蛋白的預(yù)處理取本發(fā)明純化單抗蛋白于透析袋(7500-14000MW)中，于5mMNaCl(pH7.0)溶液4℃透析過(guò)夜(每4-6h換液一次)，透析后的蛋白用0.22μM微孔濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后于4℃保存?zhèn)溆谩?、最佳標(biāo)記量的確定取8支EP管各加1ml實(shí)施例5膠體金懸液后，將上述單克隆抗體蛋白用5mMNaCl(pH7.0)溶液分別稀釋成0、10、15、20、25、30、35、40μg/ml,各取蛋白稀釋液0.1ml分別加入膠體金液EP管中，5min后加入0.1ml10％NaCl溶液，混勻后靜置2h觀察，并以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該單抗蛋白的最低用量。3、單抗蛋白的膠體金標(biāo)記用0.1MK2CO3調(diào)節(jié)金溶膠pH至8.2,取10ml已調(diào)pH值的金溶膠中加入最佳標(biāo)記量的單抗蛋白液(體積約20μL)，攪拌15min,4℃孵育過(guò)夜后，加入0.5ml5％BSA溶液封閉,3000r/min離心30min，去除粒徑較大的顆粒,取上清14000r/min離心30min后取沉淀，將沉淀物重懸為原體積的十分之一制成探針，4℃保存待用。實(shí)施例7：免疫金標(biāo)卡的組裝實(shí)用型免疫金標(biāo)卡組件包括：(1)樣品墊、(2)結(jié)合墊(膠體金墊)、(3)層析膜(硝酸纖維素膜)、(4)吸收墊、(5)支持底板(PVC底板)、(6)外包裝塑料盒(1)樣品墊：選用了上海杰一生物有限公司提供的Ahlstrom8964(25×30cm)型玻璃纖維，用試紙條展開劑將樣品墊37℃封閉2-3h,干燥備用。(2)結(jié)合墊(膠體金墊)：選用上海杰一生物有限公司公司提供的Ahlstrom8964(25×30cm)型玻璃纖維，將上述膠體金標(biāo)記的單克隆抗體蛋白液均勻地噴涂在4mm寬的玻璃纖維膜上,室溫干燥，干燥后至密封塑料中，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?3)層析膜(硝酸纖維素膜)：選用Whatman公司提供硝酸纖維素膜(ImmunoporeRP,25mm×50m)作試驗(yàn)用膜。0.01MNa2CO3/NaHCO3(pH9.6)分別將恩諾沙星牛血清白蛋白偶聯(lián)物(混合酸酐法合成)和山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體稀釋成1mg/ml,置BioDotXYZ3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，用BioJetQuanti300非接觸微量噴頭將上述二種試液均勻平行地噴灑在NC膜上并分別標(biāo)記為T/C線。37℃培養(yǎng)箱干燥后，放至密封塑料中，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?4)吸收墊：選用上海杰一生物有限公司提供(H5072,20×30cm)吸收墊，用試紙條切割機(jī)切成寬度為5mm長(zhǎng)型小條，放至密封塑料中。(5)支持底板：選用上海杰一生物有限公司公司提供DB—6免疫金標(biāo)卡專用PVC板作支持底板(6cm×30cm)。(6)外包裝塑料盒：選用上海捷寧生物有限公司提供C-9-1型免疫金標(biāo)卡專用包裝塑料盒作外包裝。將上述各部件按照?qǐng)D1所示進(jìn)行有序安裝。實(shí)施例8：免疫金標(biāo)卡對(duì)氟喹諾酮藥物單組分檢測(cè)靈敏度的分析分別精確稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星各1mg，用0.03MNaOH分別配制1mg/ml儲(chǔ)存液，并于4℃保存?zhèn)溆?有效期為1個(gè)月)。分別取一部分用0.03MNaOH再分別配制500ng/ml作工作儲(chǔ)存液，再用0.01MPBS(pH7.4)液將每種藥工作儲(chǔ)存液分別配制成：0、0.1、0.3、1、3、10、30、100ng/ml(ppb)七個(gè)稀釋度分別滴加于制備的免疫金標(biāo)卡加樣孔中(200μl/孔)，用實(shí)施例7免疫金標(biāo)卡對(duì)每個(gè)濃度點(diǎn)藥物進(jìn)行層析測(cè)定，10min后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并拍照記錄，結(jié)果見圖8和圖9。以本發(fā)明單抗純化蛋白與膠體金交聯(lián)制備的金標(biāo)抗體作測(cè)試抗體，以混合酸酐法合成的恩諾沙星與牛血清白蛋白偶聯(lián)物作檢測(cè)抗原，以山羊抗小鼠IgG二抗作質(zhì)控包被物組裝實(shí)用型金標(biāo)檢測(cè)卡對(duì)八種氟喹諾酮藥物單組分檢測(cè)靈敏度測(cè)試顯示：濃度為3ng/ml的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星的單組分競(jìng)爭(zhēng)物均能使檢測(cè)線(T線)完全消失，說(shuō)明該免疫金標(biāo)卡對(duì)上述五種藥物的檢測(cè)限均小于等于3ng/ml，其中諾氟沙星檢測(cè)靈敏度最高，1ng/ml諾氟沙星作競(jìng)爭(zhēng)物能使檢測(cè)線完全消失說(shuō)明該金標(biāo)卡對(duì)諾氟沙星的檢測(cè)限已達(dá)到小于等于1ng/ml，結(jié)果見圖8。30ng/ml沙拉沙星作競(jìng)爭(zhēng)物檢測(cè)線完全消失說(shuō)明該卡對(duì)沙拉沙星的檢測(cè)限小于等于30ng/ml；10和100ng/ml的氧氟沙星和洛美沙星分別作競(jìng)爭(zhēng)物檢測(cè)線大部分和完全消失說(shuō)明該卡對(duì)氧氟沙星的檢測(cè)限在10-100ng/ml，結(jié)果見圖9。實(shí)施例9：免疫金標(biāo)卡對(duì)幾種氟喹諾酮藥三組分混標(biāo)藥物檢測(cè)靈敏度的分析將恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星中作三種藥物等濃度任意組合(共計(jì)10種組合)混合，每個(gè)組合按總濃度計(jì)為3ng/ml，每個(gè)組合中單個(gè)組分濃度為1ng/ml，按實(shí)施例8同樣的方法進(jìn)行層析測(cè)定與記錄，結(jié)果見圖10。由圖10可見，未加競(jìng)爭(zhēng)物的空白對(duì)照組(第一組)免疫金標(biāo)卡的T線和C線均有明顯的雜交信號(hào)說(shuō)明該金標(biāo)卡工作正常，單克隆抗體的金標(biāo)探針能捕捉到恩諾沙星與牛血清白蛋白偶聯(lián)物同時(shí)亦能被山羊抗小鼠IgG二抗所捕捉。各試驗(yàn)組(共十種組合，第2-11組)的競(jìng)爭(zhēng)物均能完全競(jìng)爭(zhēng)金標(biāo)抗體探針與恩諾沙星偶聯(lián)物的結(jié)合使T線完全消失，該結(jié)果說(shuō)明該金標(biāo)卡總濃度為3ng/ml的上述五種氟喹諾酮藥物三組分等濃度混標(biāo)物的檢測(cè)線小于等于3ng/ml，結(jié)合實(shí)施例8單組份試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該金標(biāo)卡對(duì)上述五種氟喹諾酮藥物的識(shí)別不存在相互干擾效應(yīng)而為疊加效應(yīng)，且靈敏度極高。實(shí)施例10：免疫金標(biāo)卡抗基質(zhì)干擾能力的分析以豬肉和豬尿?yàn)槟Ｊ交|(zhì)，恩諾沙星標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)摻入物通過(guò)回收率分析該金標(biāo)卡的抗基質(zhì)干擾能力，結(jié)果見表2。表2金標(biāo)卡對(duì)恩諾沙星外標(biāo)豬肉豬尿樣本的檢測(cè)表2顯示：以豬肉、豬尿?yàn)榛|(zhì)，恩諾沙星外標(biāo)后，其檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度與外標(biāo)目標(biāo)物呈強(qiáng)濃度依賴性，與標(biāo)準(zhǔn)液中同濃度點(diǎn)外標(biāo)目標(biāo)物抑制信號(hào)強(qiáng)度基本一致，該結(jié)果表明免疫金標(biāo)卡有強(qiáng)抗基質(zhì)干擾力，為免疫金標(biāo)卡的實(shí)際應(yīng)用提供了有力試驗(yàn)依據(jù)。實(shí)施例11：免疫金標(biāo)卡穩(wěn)定性檢測(cè)取4℃干燥保存一、三個(gè)月后的免疫金標(biāo)卡按實(shí)施例8同樣的方法中的恩諾沙星系列濃度競(jìng)爭(zhēng)物進(jìn)行層析測(cè)定并與實(shí)施例8中對(duì)應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，分析金標(biāo)卡的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖11。圖11顯示儲(chǔ)存1、3月的金標(biāo)卡與現(xiàn)裝配金標(biāo)卡檢測(cè)靈敏度無(wú)明顯差異說(shuō)明該金標(biāo)卡有良好的穩(wěn)定性。實(shí)施例12：?jiǎn)慰寺】贵w蛋白與SepharoseTM4B化學(xué)交聯(lián)1、交聯(lián)前單克隆抗體蛋白預(yù)處理取約40mg上述單克隆抗體蛋白純化物(濃度大于等于2mg/ml,純度大于等于99％)置于透析袋(7500-14000MW)中，于100-200×0.1MNaHCO3/0.5MNaCl(pH8.3)溶液4℃透析過(guò)夜(每4-6h換液一次)，透析后蛋白用0.22μM微孔濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后于4℃保存?zhèn)溆?2、交聯(lián)前CNBr-activatedSepharose4B預(yù)處理分別稱取二份3gCNBr-activatedSepharose4B凍干粉于2支50ml離心管(corning公司產(chǎn)品)，每支離心管加30ml1mMHCl室溫于擺床中輕輕擺動(dòng)溶脹1h,室溫2000r/min10min棄上清，同法離心洗滌重復(fù)8-10次充分去除該膠中未交聯(lián)的其他小分子化學(xué)試劑，30ml0.1MNaHCO3/0.5MNaCl(pH8.3)離心洗滌一次，取沉淀膠備用。3、單抗蛋白與Sepharose4B化學(xué)交聯(lián)將上述預(yù)處理的單抗蛋白液分成二等份分別加入含處理Sepharose4B膠的2支50ml離心管中，蓋好蓋并用parafilm膜封口，置于擺床中室溫?cái)[動(dòng)孵育1h,室溫2000r/min10min棄上清,從該上清中取少許以Bradford蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其蛋白濃度分析單抗蛋白與Sepharose4B膠化學(xué)交聯(lián)的效果。每支離心管加30ml0.1MNaHCO3/0.5MNaCl(pH8.3)溶液,置于擺床中室溫?cái)[動(dòng)孵育10min,室溫2000r/min10min棄上清,再用該液重復(fù)上述步驟離心洗滌5-6次以充分去除未交聯(lián)的蛋白，取沉淀膠。取上述沉淀膠，每支離心管加入30ml0.1MTris-HCl(pH8.0)置于擺床中室溫?cái)[動(dòng)孵育2h以充分封閉Sepharose4B膠中未與蛋白交聯(lián)的活化基團(tuán)，室溫2000r/min離心10min,取沉淀膠。取沉淀膠，每支離心管分別用30ml0.1MHAC-NaAC/0.5MNaCl(pH4.0)和0.1MTris-HCl/0.5MNaCl(pH8.0)二種緩沖液交替離心洗滌三個(gè)循環(huán)后，將膠重懸于30ml0.1MTris-HCl/0.5MNaCl(pH8.0)液補(bǔ)加0.02％NaN3，于4℃保存?zhèn)溆?。?shí)施例13：免疫親和層析膠對(duì)4種氟喹諾酮藥物單組分結(jié)合測(cè)定取上述恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星儲(chǔ)存液，用0.01MPBS(pH7.2)將每種藥物分別稀釋成：25、50、100ng/ml三個(gè)濃度點(diǎn)于1.5mlEP管中(1ml/管)，另取4×3支1.5mlEP管，每管均加入500μl免疫親和層析膠懸液(免疫親和層析膠實(shí)際體積約為50μl)，0.01MPBS(pH7.2)離心洗滌二次盡量吸干殘液，分別將每種藥物各濃度點(diǎn)的稀釋管液一一對(duì)應(yīng)移入含免疫層析膠EP管中，各濃度點(diǎn)結(jié)合膠輕輕懸浮后于擺床室溫?cái)[動(dòng)孵育1h，1000r/min離心10min棄上清，0.01MPBS(pH7.2)離心洗滌5-6次后，0.9％NaCl離心洗滌2次,盡量吸干膠中殘液，每只EP管中分別加1ml0.1MHAC-HCl(pH2.3)重懸結(jié)合膠并于擺床室溫?cái)[動(dòng)孵育15min,1000r/min離心10min,另取4×3支1.5mlEP管，各取上述離心洗脫液850μl一一對(duì)應(yīng)移入的新EP管，每管補(bǔ)加150μl色譜級(jí)乙腈充分混勻，作待測(cè)樣本直接上HPLC-FLD定量測(cè)定驗(yàn)證每種藥物各濃度點(diǎn)回收率。經(jīng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA證實(shí)本發(fā)明單抗能有效識(shí)別八種氟喹諾酮藥物后，本實(shí)施例選用食品(尤其是畜禽水產(chǎn)品)樣本中出現(xiàn)殘留頻率較高的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、沙拉沙星等四種氟喹諾酮藥物作目標(biāo)物驗(yàn)證本發(fā)明免疫親和層析膠對(duì)氟喹諾酮藥物單組分的結(jié)合性能。以不同濃度上述四種藥物單組分免疫親和層析洗脫物作樣本，通過(guò)目前公認(rèn)檢測(cè)精確度和靈敏度俱佳的高效液相色譜法(配熒光檢測(cè)器)HPLC-FLD加以驗(yàn)證，結(jié)果顯示：1、四種藥物單組分標(biāo)樣的免疫親和層析洗脫樣本經(jīng)HPLC-FLD檢測(cè)其目標(biāo)峰明確清晰、無(wú)其他非相關(guān)分子雜峰，其中環(huán)丙沙星、諾氟沙星和沙拉沙星樣本中檢測(cè)到少量或極少量的恩諾沙星特征峰(初步懷疑標(biāo)樣中混有少量的恩諾沙星)，見四種藥物回收樣本的色譜圖，即圖12-15，該結(jié)果表明免疫親和層析膠對(duì)上述四種藥物均有良好選擇性捕捉能力。2、25、50、100ng/ml的諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星三種藥物樣本回收率均大于等于65％，其中諾氟沙星的回收率最高分別為82.17％、77.69％、75.79％,而沙拉沙星回收率最低分別為：54.15％、47.98％、45.58％結(jié)果見圖16(注：考慮到洗滌等處理等過(guò)程中免疫親和層析膠有少部分損失，實(shí)際的回收率高于測(cè)得的回收率)，該結(jié)果與本發(fā)明間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定的該單克隆抗體對(duì)四種藥物的親和力相吻合。實(shí)施例14：免疫親和層析膠抗基質(zhì)干擾能力的測(cè)定用0.01MPBS(pH7.4)將胎牛血清作10×稀釋后分別加至二支1.5EP管中(0.5ml/支)，用0.01MPBS(pH7.4)將恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星等五種藥物儲(chǔ)存液稀釋成濃度均為100ng/ml的混合液，取0.5ml混合液加至含0.5ml10×稀釋胎牛血清液的一支EP管中作氟喹諾酮藥物摻入胎牛血清試液；取0.5ml混合液加等體積0.01MPBS(pH7.4)于一支EP管中作氟喹諾酮藥物標(biāo)準(zhǔn)混合試液；另一支含0.5ml胎牛血清10×稀釋液EP管中加等體積0.01MPBS(pH7.4)作空白對(duì)照試液；于擺床上室溫?cái)[動(dòng)孵育1h。另新取三支EP管分別加入1ml上述IAC膠懸液，0.01MPBS(pH7.4)離心淘洗三次，盡量吸盡殘液，分別將上述三種試液加入該三支EP管中，于擺床上室溫?cái)[動(dòng)孵育1h,離心去除試液，0.01MPBS(pH7.4)離心淘洗膠五次，0.9％NaCl離心淘洗膠二次后盡量吸盡殘液，分別加入1ml0.1MHAC-HCl(pH2.2)液，于擺床上室溫?cái)[動(dòng)孵育15min,1000r/min離心5min，分別取850μl上清一一對(duì)應(yīng)加至新的三支1.5EP管中，每管分別補(bǔ)加150μl色譜級(jí)乙腈混勻，過(guò)0.22μm濾膜后分別進(jìn)樣作HPLC-FLD定量分析。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明的免疫親和層析膠對(duì)氟喹諾酮類藥物多組分混標(biāo)物結(jié)合力以及該層析膠抗基質(zhì)干擾能力，發(fā)明人以單組分均為50ng/ml的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星(上述五種氟喹諾酮藥物多以單組分或多組分的形式殘留于動(dòng)物源食品樣本中，具有很強(qiáng)代表性)的五組份混標(biāo)物作目標(biāo)物，再以5％胎牛血清作模式基質(zhì)摻入上述五組份混標(biāo)物，通過(guò)五組份藥物的0.01MPBS緩沖液組的各組份回收率作指標(biāo)分析免疫層析膠對(duì)氟喹諾酮藥物混標(biāo)物捕捉力，再比較0.01MPBS組與5％胎牛血清組的各種藥物回收率分析免疫層析膠抗干擾能力，二組處理洗脫物經(jīng)HPLC-FLD檢測(cè)顯示(見圖17和圖18)：1、二組試樣洗脫物的各組分均能被色譜柱有效分離，各組分信號(hào)響應(yīng)良好，目標(biāo)峰明確清晰、無(wú)其他非相關(guān)分子雜峰，見五種藥物回收樣本色譜圖，而空白對(duì)照組無(wú)任何的目標(biāo)藥物信號(hào)峰。該結(jié)果表明免疫親和層析膠對(duì)上述五種藥物混標(biāo)物的單組分均有選擇性捕捉能力。2、0.01MPBS組中的諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星三種藥物的回收率大于等于55％，其中諾氟沙星的回收率最高為63.32％，沙拉沙星的回收率為25.39％，達(dá)氟沙星回收率僅為5.29％，該結(jié)果與本發(fā)明中的間接ELISA測(cè)得對(duì)各種藥物的親和力以及上述四種藥物單組分免疫親和層析回收率的試驗(yàn)結(jié)果有良好的相關(guān)性。3、與0.01MPBS組相比，5％胎牛血清組的五種藥物回收率均有顯著地提高：諾氟沙星由63.32％提高到82.97％二者相比回收率提高了30.31％；恩諾沙星由55.73％提高到70.50％二者相比回收率提高了26.53％；環(huán)丙沙星由54.76％提高到70.16％二者相比回收率提高了28.12％；沙拉沙星由25.39％提高到31.83％二者相比回收率提高了25.36％；達(dá)氟沙星由5.29％提高到6.37％二者相比回收率提高了20.42％；該結(jié)果表明：5％胎牛血清作模式基質(zhì)不僅沒有干擾免疫親和層析膠對(duì)氟喹諾酮類藥物目標(biāo)物識(shí)別與捕捉，反而顯著提高了該層析膠/珠對(duì)目標(biāo)物識(shí)別與捕捉能力，初步推測(cè)牛血清對(duì)免疫親和層析膠有良好封閉作用，可能有大大降低了固相抗體分子空間排阻效應(yīng)，從而提高了抗體對(duì)目標(biāo)抗原的識(shí)別與結(jié)合力。更為重要的是，通過(guò)牛血清對(duì)免疫親和層析膠預(yù)封閉處理，將恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等三種食品樣本重要?dú)埩裟繕?biāo)物的回收率提高到大于等于70％，可慮到樣本洗滌時(shí)部分結(jié)合膠丟失，實(shí)際回收率接近甚至超過(guò)80％，為該免疫親和層析膠由試驗(yàn)型轉(zhuǎn)化為實(shí)際應(yīng)用型提供了良好的優(yōu)化方法。實(shí)施例15：免疫親和層析柱對(duì)目標(biāo)物富集能力的測(cè)定取一支5ml親和層析專用柱床，用Tdwater充分洗滌后，將3ml免疫親和層析膠懸液裝柱于柱床中，100ml0.01MPBS(pH7.4)平衡柱后備用，用0.01MPBS(pH7.4)液將恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星等五種藥物儲(chǔ)存液稀釋成濃度均為50pg/ml的100ml混合液作試液，將該液于層析柱中過(guò)濾五次，再用100ml0.01MPBS(pH7.4)洗滌該柱，再用0.01MPBS(pH7.4)將膠懸浮全部收集于5ml離心管中，用0.9％NaCl離心淘洗膠二次，盡量吸干殘液，加1.5ml0.1MHAC-HCl(pH2.3)重懸結(jié)合膠并于擺床室溫?cái)[動(dòng)孵育15min,1000r/min離心10min,取850μl洗脫液于一支1.5mlEP管中，補(bǔ)加150μl色譜級(jí)乙腈充分混勻，過(guò)0.22μm濾膜進(jìn)樣作HPLC-FLD定量分析。隨著氟喹諾酮類藥物在地表水和土壤中pg/ml(g)級(jí)極微量殘留構(gòu)成對(duì)人體與動(dòng)植物潛在危害越來(lái)越受到各國(guó)政府與相關(guān)部門關(guān)注，盡管對(duì)其殘留限目前沒有統(tǒng)一國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，而瑞典等發(fā)達(dá)國(guó)家有一定標(biāo)準(zhǔn)并規(guī)定單組分不得超過(guò)50pg/ml(g)，國(guó)內(nèi)地表水與土壤中氟喹諾酮類藥物殘留狀況更不容樂觀。應(yīng)用HPLC-FLD檢測(cè)技術(shù)對(duì)其精確定量測(cè)定勢(shì)在必行，如何將大體積樣本中極微量氟喹諾酮藥物目標(biāo)物富集至HPLC-FLD儀信號(hào)響應(yīng)水平(其檢測(cè)限約為500pg/ml)成為開展該工作最大技術(shù)瓶頸，為此本發(fā)明在證實(shí)上述免疫親和層析膠/珠能同時(shí)捕捉幾種氟喹諾酮藥物(見實(shí)施例14)的基礎(chǔ)上，以濃度分別為50pg/ml(該濃度是依據(jù)瑞典的地表水氟喹諾酮?dú)埩粝薅?上述五種氟喹諾酮藥物的100ml混標(biāo)物作模式樣本，經(jīng)上述免疫親和層析柱凝膠過(guò)濾-收集結(jié)合膠-加小體積洗脫液洗脫獲取上述五種藥物洗脫樣本，再經(jīng)HPLC-FLD檢測(cè)結(jié)果顯示(見圖19和20)：經(jīng)該免疫層析柱(IACCartridge)富集：五種藥物均達(dá)到HPL-FLD儀信號(hào)響應(yīng)水平，目標(biāo)峰明確清晰、無(wú)其他非相關(guān)分子雜峰，表明本發(fā)明免疫親和層析柱對(duì)HPLC-FLD儀信號(hào)響應(yīng)水平低于10×左右的五種氟喹諾酮藥物的混標(biāo)物。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3