本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種狂犬病毒裂解液及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染引起的一種病癥嚴(yán)重、病死率極高的自然疫源性人獸共患傳染病，死亡率幾乎100％，目前尚無有效的治療措施。野生動(dòng)物是RV的主要儲(chǔ)存宿主，人一旦被攜帶狂犬病毒的此類動(dòng)物咬傷，就會(huì)感染發(fā)病，其病死率為100％。根據(jù)衛(wèi)生部最新公布的傳染病疫情統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，顯示近年來狂犬病繼續(xù)呈現(xiàn)兇險(xiǎn)的跡象。但是狂犬病沒有特殊有效的治療手段，注射狂犬病疫苗是唯一有效手段。目前市場上的狂犬病毒疫苗基本都是采用轉(zhuǎn)瓶工藝傳代細(xì)胞培養(yǎng)的，大規(guī)模生產(chǎn)需要大量的物力人力資源，成本較高，并且批間差異大，質(zhì)量不穩(wěn)定。高效的疫苗生產(chǎn)需要大量的以高產(chǎn)量從宿主系統(tǒng)中生產(chǎn)出病毒。病毒株生長的培養(yǎng)條件對(duì)于獲得該株系的可接受的高產(chǎn)量來說具有重大意義。因此，為了最大化所想要的病毒的產(chǎn)量，系統(tǒng)和培養(yǎng)條件都必須特定地適合于提供對(duì)于產(chǎn)生所想要的病毒來說有利的環(huán)境。
狂犬病疫苗大部分是用于暴露后的免疫，就要求疫苗在更高的效力前提下還要保證安全?，F(xiàn)有狂犬病疫苗無論采用何種病毒培養(yǎng)體系，最終均是經(jīng)適宜方法制成含全病毒顆粒的疫苗。這類疫苗的缺點(diǎn)就在于無法進(jìn)一步增加抗原含量從而在人體中產(chǎn)生更快、更高的免疫應(yīng)答反應(yīng)、提供更久的免疫保護(hù)。其原因?yàn)檫M(jìn)一步增加病毒抗原含量時(shí)，病毒顆粒中與抗原無關(guān)的成分特別是那些變態(tài)反應(yīng)原物質(zhì)，如病毒雜蛋、病毒核酸及脂質(zhì)以及培養(yǎng)病毒的組織或細(xì)胞的殘余蛋白也隨之增加，因此疫苗副反應(yīng)就加大。
已證實(shí)，存在于狂犬病病毒外膜刺突地G糖蛋白是唯一能產(chǎn)生中和抗體的抗原，能使病毒吸附在宿主細(xì)胞上并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，G糖蛋白決定病毒毒力和免疫原性及病毒的復(fù)制、是狂犬病毒主要的活性成分，基質(zhì)蛋白對(duì)G糖蛋白的抗原性有增強(qiáng)效應(yīng)。
目前現(xiàn)有的裂解液裂解狂犬病毒的方法存在很多缺點(diǎn)，裂解試劑體系單一，樣本處理耗時(shí)長，狂犬病毒裂解效果不佳，裂解不完全，病毒外膜片段獲得率低，純度低；上述缺點(diǎn)的存在勢必會(huì)因狂犬病毒裂解液的選擇而導(dǎo)致對(duì)后續(xù)的狂犬病毒抗原的效果造成影響。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為克服現(xiàn)有狂犬病病毒裂解液存在的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明提供了一種狂犬病毒裂解液，該裂解液裂解效率高、使用安全。
本發(fā)明還提供了一種上述狂犬病毒裂解液在制備狂犬病毒抗原中的應(yīng)用。
一種狂犬病毒裂解液，該裂解液包括裂解液A和裂解液B，其中所述的裂解液A含有以下組分：N-月桂酰肌氨酸鈉 1-2g/100ml、Triton X-100 0.2-1.0g/100ml、糖元1mg-5mg/100ml，pH為6-6.5；
所述裂解液B含有以下組分：氯化鈉 0.7-1.0g/100ml、EDTA 1-1.5g/100ml，pH為7-7.5。
上述狂犬病毒裂解液在制備狂犬病毒抗原中的應(yīng)用。
利用上述狂犬病毒裂解液制備狂犬病毒抗原的方法為：
（1）制備狂犬病病毒液；
（2）對(duì)步驟（1）所述的狂犬病病毒液進(jìn)行濃縮、純化；
（3）在步驟（2）所述的純化后的狂犬病病毒液中加入病毒裂解液A，渦旋震蕩，待徹底混勻后，在9-12℃下水浴30-40min；
（4）在步驟（3）所述的裂解混合液中加入病毒裂解液B，渦旋震蕩，待徹底混勻后，在15-20℃下水浴18-25min；
（5）步驟（4）處理后的裂解混合液進(jìn)行純化，用25%蔗糖、40%蔗糖和55%蔗糖作為蔗糖密度梯度，以20000-25000rpm/min的速度離心0.5-1小時(shí)，收集病毒外膜片段部分；
（6）在步驟（5）收集的病毒外膜片段部分中加入磷酸緩沖鹽溶液至pH7.2，靜置30-40min，經(jīng)50-60KD濾膜超濾濃縮，透析脫糖后回收病毒外膜片段原液，即為狂犬病毒抗原。
優(yōu)選地，所述步驟（3）中病毒裂解液A和狂犬病病毒液的體積比為1-2：3；所述步驟（3）中病毒裂解液B和狂犬病病毒液的體積比為1-2:3。
優(yōu)選地，步驟（5）中純化的具體過程為：當(dāng)區(qū)帶離心轉(zhuǎn)速達(dá)到3000rpm/min時(shí)，泵入病毒液、25%蔗糖、40%蔗糖和55%蔗糖，并加入PBS作為封閉液，進(jìn)樣完畢，再調(diào)節(jié)機(jī)器轉(zhuǎn)速至20000-25000rpm/min，離心0.5-1小時(shí)。
本發(fā)明所用的狂犬病病毒固定毒株為：CTN-1V，aGV株。中國藥品生物制品檢定所負(fù)責(zé)制備和發(fā)放上述病毒毒種。
有益效果
使用本發(fā)明中提供的狂犬病毒裂解液，可有效裂解狂犬病毒顆粒，有利于提取含有刺突和基質(zhì)蛋白的病毒外膜片段。本發(fā)明提供的裂解液可在制備狂犬病毒抗原中應(yīng)用，該應(yīng)用方法簡單快速，且裂解完全，裂解液容易去除，獲得的狂犬病毒抗原純度高。
具體實(shí)施方式
結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
實(shí)施例1
1.狂犬病毒裂解液及其配制方法：
裂解液A的配制：稱取N-月桂酰肌氨酸鈉5g、Triton X-100 5.0g、糖元5mg，加入無菌水定容至500ml，充分混勻溶解，使用氫氧化鈉或鹽
酸溶液調(diào)節(jié)pH值至pH為6，高壓滅菌10min；
裂解液B的配制：稱取氯化鈉3.5g、EDTA 7.5g，加入無菌水定容至500ml，充分混勻溶解，使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為7，高壓滅菌10min。
2.狂犬病毒裂解液的應(yīng)用：
將Vero細(xì)胞于37℃培養(yǎng)，并經(jīng)連續(xù)傳4代。第4代細(xì)胞培養(yǎng)3-5天后，用磷酸緩沖液淋洗，接種病毒滴度為不低于7.5LgLD50/ml的狂犬病病毒固定毒CTN-1V株。并加入細(xì)胞維持液于35℃培養(yǎng)24小時(shí)。換入新鮮細(xì)胞維持液，按照上述條件繼續(xù)培養(yǎng)2-4天，當(dāng)細(xì)胞病變CPE達(dá)到++～+++時(shí)，收獲、合并病毒液。按照1∶4000加入β-丙內(nèi)酯，置于22℃、8天滅活病毒。經(jīng)滅活試驗(yàn)驗(yàn)證合格后，用100KD濾膜超濾濃縮。于濃縮后的病毒液中加入10mg/ml的硫酸魚精蛋白，使其終濃度為0.1mg/ml，8000rpm離心后，上清液除菌過濾，再經(jīng)Sepharose4FF凝膠柱層析，收集得到純化后的狂犬病病毒液。根據(jù)收集的純化狂犬病病毒液體積，加入病毒裂解液A，渦旋震蕩，待徹底混勻后，在9℃下水浴40min后，加入病毒裂解液B，渦旋震蕩，待徹底混勻后，在15℃下水浴25min，使狂犬病毒顆粒充分徹底裂解；其中病毒裂解液A和狂犬病毒液的體積比為1:3；病毒裂解液B和狂犬病毒液的體積比為2：3。
裂解后的病毒液進(jìn)行二次純化，當(dāng)區(qū)帶離心轉(zhuǎn)速達(dá)到3000rpm/min時(shí)，泵入病毒液、25%蔗糖、40%蔗糖和55%蔗糖，并加入PBS作為封閉液，進(jìn)樣完畢，再調(diào)節(jié)機(jī)器轉(zhuǎn)速至20000rpm/min，離心1小時(shí)，收集病毒外膜片段部分。
在收集的病毒外膜片段部分中加入磷酸緩沖鹽溶液至pH7.2，靜置30min，經(jīng)60KD濾膜超濾濃縮，透析脫糖后回收病毒外膜片段原液，即為狂犬病毒抗原。
3．動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)及病毒攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)：
將收集的狂犬病毒抗原與等體積油佐劑混合試制疫苗，在小白鼠上進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。0.5ml/只經(jīng)肌肉或口服途徑各免疫20只小白鼠，另設(shè)10只小白鼠不注射任何東西為對(duì)照組。一個(gè)月后，用致死性狂犬病毒cvs標(biāo)準(zhǔn)攻毒株經(jīng)腦內(nèi)攻擊，結(jié)果試驗(yàn)組獲得70%的保護(hù)，而對(duì)照組全部發(fā)病。
本實(shí)施例所制備的抗原無論注射還是口服的動(dòng)物80-90%都產(chǎn)生保護(hù)性抗體。
實(shí)施例2
1.狂犬病毒裂解液及其配制方法：
裂解液A的配制：稱取N-月桂酰肌氨酸鈉10g、Triton X-100 1g、糖元25mg，加入無菌水定容至500ml，充分混勻溶解，使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至pH為6.5，高壓滅菌10min；
裂解液B的配制：稱取氯化鈉5.0g、EDTA 5g，加入無菌水定容至500ml，充分混勻溶解，使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為7.5，高壓滅菌10min。
2.狂犬病毒裂解液的應(yīng)用：
將Vero細(xì)胞于37℃培養(yǎng)，并經(jīng)連續(xù)傳4代。第4代細(xì)胞培養(yǎng)3-5天后，用磷酸緩沖液淋洗，接種病毒滴度為不低于7.5LgLD50/ml的狂犬病病毒固定毒CTN-1V株。并加入細(xì)胞維持液于35℃培養(yǎng)24小時(shí)。換入新鮮細(xì)胞維持液，按照上述條件繼續(xù)培養(yǎng)2-4天，當(dāng)細(xì)胞病變CPE達(dá)到++～+++時(shí)，收獲、合并病毒液。按照1∶4000加入β-丙內(nèi)酯，置于22℃、8天滅活病毒。經(jīng)滅活試驗(yàn)驗(yàn)證合格后，用100KD濾膜超濾濃縮。于濃縮后的病毒液中加入10mg/ml的硫酸魚精蛋白，使其終濃度為0.1mg/ml，8000rpm離心后，上清液除菌過濾，再經(jīng)Sepharose4FF凝膠柱層析，收集得到純化后的狂犬病病毒液。根據(jù)收集的純化狂犬病病毒液體積，加入病毒裂解液A，渦旋震蕩，待徹底混勻后，在12℃下水浴30min后，加入病毒裂解液B，渦旋震蕩，待徹底混勻后，在20℃下水浴18min，使狂犬病毒顆粒充分徹底裂解。病毒裂解液A和狂犬病毒液的體積比為2:3；病毒裂解液B和狂犬病毒液的體積比為1:3。
裂解后的病毒液進(jìn)行二次純化，當(dāng)區(qū)帶離心轉(zhuǎn)速達(dá)到3000rpm/min時(shí)，泵入病毒液、25%蔗糖、40%蔗糖和55%蔗糖，并加入PBS作為封閉液，進(jìn)樣完畢，再調(diào)節(jié)機(jī)器轉(zhuǎn)速至25000rpm/min，離心0.5小時(shí)，收集病毒外膜片段部分。
在收集的病毒外膜片段部分中加入磷酸緩沖鹽溶液至pH7.2，靜置40min，經(jīng)50KD濾膜超濾濃縮，透析脫糖后回收病毒外膜片段原液，即為狂犬病毒抗原。
3．動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)及病毒攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)：
將收集的狂犬病毒抗原與等體積油佐劑混合試制疫苗，在小白鼠上進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。0.5ml/只經(jīng)肌肉或口服途徑各免疫20只小白鼠，另設(shè)10只小白鼠不注射任何東西為對(duì)照組。一個(gè)月后，用致死性狂犬病毒cvs標(biāo)準(zhǔn)攻毒株經(jīng)腦內(nèi)攻擊，結(jié)果試驗(yàn)組獲得80%的保護(hù)，而對(duì)照組全部發(fā)病。
本實(shí)施例所制備的抗原無論注射還是口服的動(dòng)物80-90%都產(chǎn)生保護(hù)性抗體。
實(shí)施例3
1.狂犬病毒裂解液及其配制方法：
裂解液A的配制：稱取N-月桂酰肌氨酸鈉8g、Triton X-100 3g、糖元18mg，加入無菌水定容至500ml，充分混勻溶解，使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至pH為6.5，高壓滅菌10min；
裂解液B的配制：稱取氯化鈉4g、EDTA 6g，加入無菌水定容至500ml，充分混勻溶解，使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為7.5，高壓滅菌10min。
2.狂犬病毒裂解液的應(yīng)用：
將Vero細(xì)胞于37℃培養(yǎng)，并經(jīng)連續(xù)傳4代。第4代細(xì)胞培養(yǎng)3-5天后，用磷酸緩沖液淋洗，接種病毒滴度為不低于7.5LgLD50/ml的狂犬病病毒固定毒CTN-1V株。并加入細(xì)胞維持液于35℃培養(yǎng)24小時(shí)。換入新鮮細(xì)胞維持液，按照上述條件繼續(xù)培養(yǎng)2-4天，當(dāng)細(xì)胞病變CPE達(dá)到++～+++時(shí)，收獲、合并病毒液。按照1∶4000加入β-丙內(nèi)酯，置于22℃、8天滅活病毒。經(jīng)滅活試驗(yàn)驗(yàn)證合格后，用100KD濾膜超濾濃縮。于濃縮后的病毒液中加入10mg/ml的硫酸魚精蛋白，使其終濃度為0.1mg/ml，8000rpm離心后，上清液除菌過濾，再經(jīng)Sepharose4FF凝膠柱層析，收集得到純化后的狂犬病病毒液。根據(jù)收集的純化狂犬病病毒液體積，加入病毒裂解液A，渦旋震蕩，待徹底混勻后，在10℃下水浴35min后，加入病毒裂解液B，渦旋震蕩，待徹底混勻后，在18℃下水浴22min，使狂犬病毒顆粒充分徹底裂解。病毒裂解液A和狂犬病毒液的體積比為1.5:3；病毒裂解液B和狂犬病毒液的體積比為1.5:3。
裂解后的病毒液進(jìn)行二次純化，當(dāng)區(qū)帶離心轉(zhuǎn)速達(dá)到3000rpm/min時(shí)，泵入病毒液、25%蔗糖、40%蔗糖和55%蔗糖，并加入PBS作為封閉液，進(jìn)樣完畢，再調(diào)節(jié)機(jī)器轉(zhuǎn)速至25000rpm/min，離心0.6小時(shí)，收集病毒外膜片段部分。
在收集的病毒外膜片段部分中加入磷酸緩沖鹽溶液至pH7.2,靜置40min，經(jīng)50KD濾膜超濾濃縮，透析脫糖后回收病毒外膜片段原液，即為狂犬病毒抗原。
3．動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)及病毒攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)：
將收集的狂犬病毒抗原與等體積油佐劑混合試制疫苗，在小白鼠上進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。0.5ml/只經(jīng)肌肉或口服途徑各免疫20只小白鼠，另設(shè)10只小白鼠不注射任何東西為對(duì)照組。一個(gè)月后，用致死性狂犬病毒cvs標(biāo)準(zhǔn)攻毒株經(jīng)腦內(nèi)攻擊，結(jié)果試驗(yàn)組獲得90%的保護(hù)，而對(duì)照組全部發(fā)病。
本實(shí)施例所制備的抗原無論注射還是口服的動(dòng)物95-98%都產(chǎn)生保護(hù)性抗體。