本發(fā)明涉及一種發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞產(chǎn)重組蛋白PCV2的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)(insect baculovirus expression vector system，IBEVS)是基于昆蟲桿狀病毒及其宿主細胞建立起來的表達體系，是將外源基因整合到桿狀病毒基因組上形成重組桿狀病毒，在昆蟲細胞或蟲體中可表達外源蛋白的一種真核表達系統(tǒng)。是繼大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)之后建立起來的，現(xiàn)已成為基因工程四大表達系統(tǒng)之一。利用該系統(tǒng)獲得的重組蛋白可用于藥物開發(fā)、疫苗生產(chǎn)、生物殺蟲劑等多個領(lǐng)域?，F(xiàn)在商業(yè)上的桿狀病毒產(chǎn)品仍是通過培養(yǎng)昆蟲幼蟲感染病毒獲得。這種生產(chǎn)方式受時間季節(jié)的制約，很難大規(guī)模生產(chǎn)，而最有效的辦法則是大規(guī)模懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞來大量生產(chǎn)桿狀病毒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種通過發(fā)酵培養(yǎng)昆蟲細胞來大量生產(chǎn)桿狀病毒的方法。

所述方法包括昆蟲細胞的搖瓶懸浮培養(yǎng)、昆蟲細胞的發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)。

所述昆蟲細胞的搖瓶懸浮培養(yǎng)，是將原代細胞經(jīng)過靜止培養(yǎng)復蘇后，經(jīng)過傳代培養(yǎng)，傳代細胞密度不低于1.0×10⁶個/ml。

所述昆蟲細胞的發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)，是將種子以初始細胞密度不低于10×10⁵個/ml的接種量接入5L發(fā)酵罐中，以無血清培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM為發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為70％，采用螺旋槳式攪拌器攪拌通氣，發(fā)酵溫度27℃(+-0.5℃)，pH 6.2(+-0.1)，攪拌轉(zhuǎn)速100-200rpm，培養(yǎng)過程中溶解氧DO控制在50％-80％，通氣量0.5-1vvm。

所述昆蟲細胞是Sf9細胞。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述昆蟲細胞的搖瓶懸浮培養(yǎng)是將原代細胞經(jīng)過靜止培養(yǎng)復蘇后，經(jīng)過傳代培養(yǎng)，以傳代細胞密度不低于1.0×10⁶個/ml的接種量接入1000ml三角瓶中，三角瓶裝液量400ml，細胞密度生長至2.0×10⁶個/ml時進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度27℃，搖床轉(zhuǎn)速120rpm。

本發(fā)明還提供一種重組蛋白PCV2的制備方法，是在發(fā)酵罐中懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞，并以重組桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染昆蟲細胞。

所述方法，具體是在昆蟲細胞的發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)進行到細胞密度達到30×10⁵個/ml時，利用脂質(zhì)體法對昆蟲細胞進行轉(zhuǎn)染，27℃連續(xù)培養(yǎng)72h左右。

本發(fā)明方法發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)束后，細胞產(chǎn)率約為10g/L。采用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)在5L發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，并成功表達重組蛋白PCV2。

附圖說明

圖1 Sf9搖瓶懸浮培養(yǎng)生長曲線

圖2 Sf9細胞在5L發(fā)酵罐中的生長曲線

圖3不同接種密度時的生長曲線

圖4感染病毒前、后的細胞形態(tài)圖，4(1)感染病毒前細胞形態(tài)圖，4(2)感染病毒后48h細胞形態(tài)

圖5 SDS-PAGE及WB檢測結(jié)果；其中，Lane 1＝蛋白Marker，Lane 2＝細胞上清液，Lane 3-4＝全細胞沉淀物，Lane 5＝未感染的細胞對照

具體實施方式

材料：

細胞：Sf9細胞昆蟲細胞株、昆蟲細胞草地夜蛾(Spodoptera frugierda)卵巢組織細胞購自Invitrogen生物公司。

轉(zhuǎn)染所用重組桿狀病毒pfastBacDuel_PCV2的構(gòu)建方法參加文獻Improved Production Efficiency of Virus-Like Particles by the Baculovirus Expression Vector System.PLOS ONE|DOI:10.1371/journal.pone.0140039 October 12,2015。

培養(yǎng)基及試劑：Sf9無血清培養(yǎng)基；Grace’s Insect Medium培養(yǎng)基、Sf-900ⅡSFM無血清培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑Cell Fectin、Bac PAK qPCR Titration Kit、Bac PAK Baculovirus Rapid Titer Kit、Chromogenic Western Blot Immunodetection Kit購Invitrogen公司。

實驗設(shè)備：NBS Innova 4300恒溫搖床；生物反應器為無錫匯森5L攪拌式生物反應器，細胞計數(shù)儀為羅氏醫(yī)用細胞計數(shù)儀。AKTAFPLC快速蛋白純化液相。安捷倫LC-MS質(zhì)譜分析儀。

方法：

細胞計數(shù)，通過血球計數(shù)板結(jié)合胎盤藍染色用細胞計數(shù)儀計數(shù)測定細胞活性及細胞大小并觀察細胞狀態(tài)。

實施例1

(1)Sf9細胞的搖瓶懸浮培養(yǎng)

原代細胞在Sf-900II SFM培養(yǎng)基中經(jīng)過靜止培養(yǎng)復蘇后，經(jīng)過傳代培養(yǎng)，傳代細胞密度不低于1.0×10⁶個/ml的接種量接入1000ml三角瓶中，三角瓶裝液量400ml，細胞密度生長至2.0×10⁶個/ml時進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度27℃，搖床轉(zhuǎn)速120rpm。每隔一定時間取樣檢測細胞密度等參數(shù)。結(jié)果如圖1所示。細胞培養(yǎng)前40h細胞生長緩慢，這可能與細胞接種密度有關(guān)，40h后細胞生長速度加快，至112h時細胞密度達到11.2×10⁶個/ml，112h后由于營養(yǎng)成分的消耗等，細胞逐漸進入衰老期，細胞密度開始下降。

(2)Sf9細胞的發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)

使用無血清培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM，分別以低密度5×10⁵個/ml、中等密度10×10⁵個/ml、高密度20×10⁵個/ml接種于5L發(fā)酵罐中，裝液量為70％，采用螺旋槳式攪拌器攪拌通氣，發(fā)酵溫度27℃，pH 6.2，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，培養(yǎng)過程中溶解氧DO控制在50％，通氣量：0.5vvm。

當初始接種細胞密度不低于1×10⁶個/ml時，每隔一定時間取樣檢測細胞密度，細胞活性及細胞平均直徑等參數(shù)。如圖2所示，細胞培養(yǎng)前20h細胞生長緩慢，這可能與細胞接種密度有關(guān)，30h后細胞生長速度加快，至96h時細胞密度達到7.325×10⁶個/ml。整個培養(yǎng)過程中，細胞活性都高于90％，說明用通氣攪拌式發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)Sf9細胞是可行的。細胞的平均直徑基本穩(wěn)定在16μm左右，沒有出現(xiàn)明顯變化。整個發(fā)酵過程中pH值呈現(xiàn)先降后升的趨勢，可能是由于發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗引起的，培養(yǎng)后期發(fā)酵液出現(xiàn)大量泡沫，可能與營養(yǎng)物質(zhì)消耗及細胞產(chǎn)生大量蛋白有關(guān)。

如圖3所示，以低密度5×10⁵個/ml接種5L發(fā)酵罐中，細胞生長比較緩慢，細胞生長延遲期長達40h，后期細胞生長也比較緩慢，細胞密度不高；以中等密度10×10⁵個/ml接種5L發(fā)酵罐中時，細胞生長比較迅速，細胞延遲期相對于低密度接種時明顯縮短，至30h，培養(yǎng)結(jié)束時細胞密度達到60×10⁵個/ml；以高密度15×10⁵個/ml接種5L發(fā)酵罐中時，細胞生長延遲期縮短至20h，至培養(yǎng)結(jié)束時細胞密度達到73×10⁵個/ml。發(fā)酵時接種密度為15×10⁵個/ml比較好。

(3)重組桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染Sf9細胞

待Sf9細胞密度達到30×10⁵個/ml時利用脂質(zhì)體法對Sf9細胞進行轉(zhuǎn)染，27℃連續(xù)培養(yǎng)72h左右。發(fā)酵液離心后收集細胞，通過特異性抗體WB檢測PCV2的表達情況。

如圖4所示，Sf9細胞感染病毒后細胞密度基本上不會增加，轉(zhuǎn)染后24h，細胞體積比感染前細胞體積增大變圓；轉(zhuǎn)染后48h，細胞明顯停止生長，細胞核明顯增大；轉(zhuǎn)染后72h，細胞內(nèi)出現(xiàn)較多顆粒狀物質(zhì)；整個培養(yǎng)過程中細胞活性逐漸降低，至培養(yǎng)結(jié)束時活性降至80％。培養(yǎng)結(jié)束后，收集發(fā)酵液7000rpm，4℃離心30min，共收獲細胞25g，細胞產(chǎn)率約為10g/L。

為分析重組蛋白的表達，取全細胞樣、全細胞沉淀樣、上清液，通過SDS-PAGE及WB檢測。重組PCV2的理論分子量為27KDa，SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖5所示，在27KD處有單一目的條帶，為重組PCV2。

實施例2

在實施例1的基礎(chǔ)上，

步驟(2)的發(fā)酵條件調(diào)整為：使用無血清培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM，裝液量為70％，接種量為初始細胞密度不低于10×10⁵個/ml，采用螺旋槳式攪拌器攪拌通氣，發(fā)酵溫度27℃，pH6.2，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)過程中溶解氧DO控制在80％，通氣量：1vvm。

實施例3

在實施例1的基礎(chǔ)上，

步驟(2)的發(fā)酵條件調(diào)整為：使用無血清培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM，裝液量為70％，接種量為初始細胞密度不低于10×10⁵個/ml，采用螺旋槳式攪拌器攪拌通氣，發(fā)酵溫度27℃，pH 6.2，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)過程中溶解氧DO控制在50％，通氣量：1vvm。

實施例4

在實施例1的基礎(chǔ)上，

步驟(2)的發(fā)酵條件調(diào)整為：使用無血清培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM，在5L發(fā)酵罐中懸浮培養(yǎng)，裝液量為70％，接種量為初始細胞密度不低于10×10⁵個/ml，采用螺旋槳式攪拌器攪拌通氣，發(fā)酵溫度27℃，pH 6.2，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，培養(yǎng)過程中溶解氧DO設(shè)置并自動控制在80％，通氣量：0.5vvm。待細胞密度達到30×10⁵個/ml時利用脂質(zhì)體法對Sf9細胞進行轉(zhuǎn)染，27℃連續(xù)培養(yǎng)72h左右觀察Sf9細胞是否出現(xiàn)系列病毒感染現(xiàn)象。

實施例5

在實施例1的基礎(chǔ)上，步驟(2)的發(fā)酵條件調(diào)整為：使用無血清培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM，在5L發(fā)酵罐中懸浮培養(yǎng)，接種量為初始細胞密度不低于10×10⁵個/ml，采用螺旋槳式攪拌器攪拌通氣，發(fā)酵溫度27℃，pH 6.2，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，培養(yǎng)過程中溶解氧DO控制在50％，通氣量：1vvm。

待細胞密度達到30×10⁵個/ml時利用脂質(zhì)體法對Sf9細胞進行轉(zhuǎn)染，27℃連續(xù)培養(yǎng)72h左右。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。