本申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求于2008年9月9日提交的美國臨時專利申請第61/095,548號和于2008年6月26日提交的美國臨時專利申請第61/076,098號的優(yōu)先權(quán)，將這些(兩篇)臨時申請的全部內(nèi)容通過引用的方式并入本文。

關(guān)于序列表的陳述

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發(fā)明背景

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明通常涉及甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)多肽、包含該多肽的組合物、和使用該多肽的方法。

相關(guān)技術(shù)的描述

在翻譯過程中，催化tRNA分子氨?；陌滨?tRNA合成酶對于遺傳信息的解碼是必不可少的。每個真核生物的tRNA合成酶都由核心酶和附加于該核心酶氨基末端或羧基末端的另外的結(jié)構(gòu)域組成，所述核心酶與tRNA合成酶的原核生物對應(yīng)部分密切相關(guān)。例如，人酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)具有的羧基末端結(jié)構(gòu)域不是原核生物和低等真核生物TyrRS分子的一部分。

已經(jīng)證實，數(shù)種氨酰tRNA合成酶具有不同于其參與翻譯的非常規(guī)功能。例如，小酪氨酰tRNA合成酶(mini-tyrosyl tRNA)(小TyrRS)，即對應(yīng)于氨基酸殘基1-364并且被多形核細(xì)胞彈性蛋白酶和纖維蛋白溶酶切割的TyrRS的N末端結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)出在全長蛋白中未發(fā)現(xiàn)的非常規(guī)生物活性。在體外，小TyrRS表現(xiàn)出刺激嗜中性粒細(xì)胞活化和趨化作用、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，并且在雞胚絨毛尿囊膜(CAM)和小鼠基質(zhì)膠分析中促進(jìn)血管生成。小TyrRS具有ELR基序，所述ELR基序與諸如IL-8的CXC趨化因子相似，參與多種其趨化因子或血管生成活性。與其它包含ELR的細(xì)胞因子一樣，該基序的突變抑制小TyrRS結(jié)合并刺激白細(xì)胞和血管生成。

此外，已經(jīng)證實，TrpRS的截短形式具有抗血管生成的特性。在正常的人細(xì)胞中，可以檢測到兩種形式的TrpRS：由全長分子(氨基酸殘基1-471)構(gòu)成的主要形式和次要的截短形式。所述次要形式是通過前體mRNA的其它剪接使氨基末端結(jié)構(gòu)域缺失而產(chǎn)生的并且被稱為小TrpRS。已經(jīng)確定，小TrpRS的氨基末端是位于全長TrpRS分子的位置48處的蛋氨酸殘基?？蛇x擇地，可以通過蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生截短的TrpRS。例如，牛TrpRS在胰腺中高表達(dá)并被分泌進(jìn)胰液中，由此產(chǎn)生截短的TrpRS分子。其它的研究表明，小TrpRS抑制VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移(Wakasugi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.99:173-177(2002))。尤其是，雞CAM分析表明，小TrpRS阻斷VEGF的血管生成活性。相比之下，全長TrpRS不抑制血管生成。因此，移除前48個氨基酸殘基可以暴露TrpRS的抗血管生成的活性。因此，與TyrRS一樣，某些形式的TrpRS具有除tRNA的氨?；獾幕钚?。

鑒于對于其他形式的TyrRS和TrpRS相關(guān)的非常規(guī)活性和治療相關(guān)活性的這些發(fā)現(xiàn)，有必要鑒定其它氨酰tRNA合成酶蛋白的生物學(xué)相關(guān)的形式，從而開發(fā)出該蛋白家族的全部治療潛能。因此，本發(fā)明滿足這些需要并且提供其他相關(guān)的優(yōu)勢。

發(fā)明概述

本發(fā)明源于下述發(fā)現(xiàn)：甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)和衍生于GlyRS的某些多肽具有治療相關(guān)的非常規(guī)生物活性。因此，一方面，本發(fā)明提供具有至少一種非常規(guī)生物活性的分離的GlyRS多肽，以及基本上保留所述非常規(guī)活性的所述多肽的活性片段和變體。本文使用的“非常規(guī)活性”通常是指本發(fā)明的GlyRS多肽所具有的、除了將甘氨酸添加至tRNA^Gly分子以外的活性。如本文詳述，在某些實施方案中，本發(fā)明GlyRS多肽表現(xiàn)出的非常規(guī)生物活性可以包括，但不限于，細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、凋亡的調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌的調(diào)節(jié)。在更具體的實施方案中，所述活性包括Akt介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、Erk1/2介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)和GPCR介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、內(nèi)皮細(xì)胞成管的調(diào)節(jié)和細(xì)胞結(jié)合的調(diào)節(jié)。在其他的具體的實施方案中，所述活性包括CD71和/或CD80的調(diào)節(jié)。在其他的具體的實施方案中，所述活性包括細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或釋放的調(diào)節(jié)，其中所述細(xì)胞因子選自TNF-α、IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MIP1-α、MIP-1β、GRO-α、MCP-1和IL-1ra。

在某些實施方案中，本發(fā)明的GlyRS多肽是全長哺乳動物GlyRS蛋白的連續(xù)片段。在更具體的實施方案中，GlyRS多肽是SEQ ID NO:1所示的人GlyRS蛋白序列的連續(xù)片段。作為說明，所述片段基本上可以為任何長度，只要其保留至少一種目的非常規(guī)生物活性。在某些示例性實施方案中，本發(fā)明GlyRS多肽的大小在長度上為約50-100、50-200、50-300、50-400、50-500或50-600個氨基酸。在其他的實施方案中，本發(fā)明GlyRS多肽的大小在長度上為約100-200、100-300、100-400、100-500或100-600個氨基酸。在其他的示例性實施方案中，本發(fā)明GlyRS多肽的大小在長度上為約200-300、200-400、200-500或200-600個氨基酸。

在本發(fā)明的其他實施方案中，GlyRS多肽包含GlyRS蛋白序列的片段的活性變體(即，保留至少一種目的非常規(guī)生物活性)，所述GlyRS蛋白序列例如SEQ ID NO:1所示的人GlyRS蛋白序列。在更具體的實施方案中，所述活性變體是這樣的多肽，該多肽沿其長度與SEQ ID NO:1所示的人甘氨酰-tRNA合成酶序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性。

本發(fā)明的其他實施方案提供了天然存在的或非天然存在的GlyRS剪接變體和突變體，其具有如本文所描述的一種或多種非常規(guī)活性。

在本發(fā)明更具體的實施方案中，GlyRS多肽包含GlyRS序列(例如，SEQ ID NO:1)的片段，所述片段基本上由氨基酸殘基57-685、214-685、239-685、311-685、439-685、511-658、214-438、367-438、214-420、214-338、85-127或25-56、1-213、1-61、85-214、333-685、128-685、265-685或483-685、或以上的活性片段或變體組成，所述活性片段或變體基本上保留至少一種目的非常規(guī)生物活性。

在其他具體的實施方案中，所述GlyRS多肽不是NCBI#CR594947、U09587和/或U09510任一項所示的多肽。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了包含至少一種如本文所述的GlyRS多肽和異源融合伴侶的融合蛋白。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了編碼本文所述的多肽和融合蛋白的分離的多核苷酸、以及包含這些多核苷酸的表達(dá)載體和包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了組合物，例如藥學(xué)組合物，其包含生理可接受的載體和至少一種本文所述的本發(fā)明的分離的多肽、融合蛋白、抗體、分離的多核苷酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞等。

在其它方面，本發(fā)明還提供了通過將細(xì)胞或組織與本文所述的本發(fā)明的組合物接觸而調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的方法，其中所述待調(diào)節(jié)的細(xì)胞活性選自細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌的調(diào)節(jié)。在更具體的實施方案中，所述細(xì)胞活性選自Akt介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、Erk1/2介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、GPCR介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、內(nèi)皮細(xì)胞成管的調(diào)節(jié)、和細(xì)胞結(jié)合的調(diào)節(jié)。在其他具體的實施方案中，所述細(xì)胞活性選自CD71和/或CD80的調(diào)節(jié)。在其他具體的實施方案中，所述細(xì)胞活性選自細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或釋放的調(diào)節(jié)，例如，其中所述細(xì)胞因子選自TNF-α、IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MIP1-α、MIP-1β、GRO-α、MCP-1和IL-1ra。

另一方面，本發(fā)明提供了通過給予本發(fā)明的組合物來治療需要治療的個體的疾病、病癥或其他的疾病狀態(tài)。作為示例，所述疾病、病癥或疾病狀態(tài)可以包括，但不限于，癌癥、炎性疾病、免疫疾病(包括自身免疫性疾病)、異常造血活性相關(guān)的疾病、需要神經(jīng)形成或神經(jīng)保護(hù)的疾病、代謝性病癥和/或異常血管生成相關(guān)的疾病狀態(tài)。

另一方面，所述多核苷酸、多肽、抗體和/或本發(fā)明的其他組合物基本上可以用于本領(lǐng)域內(nèi)已知的并且可用的任何類型的篩查分析。例如，本發(fā)明的組合物(例如，多肽、多核苷酸和/或抗體)可以與已知的篩查方法聯(lián)合使用，從而鑒定出適合于本發(fā)明的治療的合適的細(xì)胞類型和/或疾病狀態(tài)。在其他的實例中，本發(fā)明的組合物(例如，多肽、多核苷酸和/或抗體)可以與已知的篩查方法聯(lián)合使用，從而鑒定出直接或間接地介導(dǎo)或調(diào)節(jié)本文組合物的非常規(guī)活性的激動劑、拮抗劑、結(jié)合伴侶、競爭性抑制劑、細(xì)胞效應(yīng)物等。例如，在具體的實施方案中，提供了鑒定受試化合物作為非常規(guī)活性的抑制劑或增強劑或作為本發(fā)明的組合物與一種或多種受調(diào)節(jié)的該組合物的結(jié)合伴侶、細(xì)胞效應(yīng)物和/或細(xì)胞類型之間的相互作用的抑制劑或增強劑的篩查方法。例如，所述方法可以包括以下步驟：形成包括以下的反應(yīng)混合物：(i)本發(fā)明的組合物，(ii)已知被所述組合物結(jié)合和/或調(diào)節(jié)的結(jié)合伴侶、細(xì)胞效應(yīng)物和/或細(xì)胞類型，和(iii)受試化合物；并且檢測在該受試化合物的存在下結(jié)合和/或調(diào)節(jié)是否增加或減少。相對于不存在受試化合物時的效應(yīng)，受試化合物存在時的活性或調(diào)節(jié)的統(tǒng)計學(xué)顯著的改變(增強或抑制)表明結(jié)合和/或活性的潛在激動劑(模擬劑或增強劑)或拮抗劑(抑制劑)。

序列表簡要說明

SEQ ID NO:1是人細(xì)胞質(zhì)甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)的全長氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是編碼SEQ ID NO:1的GlyRS多肽的核酸序列。

SEQ ID NOs:3-9代表在確定GlyRS片段邊界中所分析的示例性肽序列(參見實施例4和表1)。

SEQ ID NOs:10和11是在鑒定LPS處理的小鼠巨噬細(xì)胞所分泌的片段中使用的GlyRS序列(參見實施例12和圖16)。

附圖簡要說明

圖1A-1D顯示的是GlyRS蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和氨基酸序列(圖1B；SEQ ID NO:1)，以及通過使用人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶進(jìn)行的受控制的全長GlyRS蛋白水解而產(chǎn)生的GlyRS片段的SDS-PAGE分離。

圖2A-2B分別表明用本發(fā)明GlyRS片段處理的內(nèi)皮細(xì)胞中Akt和Gi-GPCRs的激活。

圖3表明用本發(fā)明GlyRS片段處理的單核細(xì)胞中Erk1/2(促分裂原活化蛋白激酶Erk1和Erk2)的激活。

圖4A描述了為了確定GlyRS片段邊界而進(jìn)行的GlyRS肽(例如，SEQ ID NO:9)的分析過程的概況。圖4B顯示了在全長人GlyRS二聚體的晶體結(jié)構(gòu)中，對應(yīng)于氨基酸214-438的GlyRS片段G6的結(jié)構(gòu)。

圖5表明對應(yīng)于氨基酸214-438的GlyRS片段G6與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。

圖6表明GlyRS片段G6調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的遷移。圖6(插入圖)表明GlyRS片段G6通過選擇趨化因子受體進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖7A顯示CD41+集落的代表性染色。圖7B表明小集落、中集落和大集落的定量結(jié)果，并且表明GlyRS片段G6影響巨核細(xì)胞祖細(xì)胞的集落形成。

圖8顯示用抗CD71-FITC抗體染色并通過流式細(xì)胞儀分析后，G6-3處理的單核細(xì)胞中CD71增殖標(biāo)志物的上調(diào)。

圖9顯示用抗CD80-FITC抗體染色并通過流式細(xì)胞儀分析后，G6-3處理的單核細(xì)胞中CD80活化標(biāo)志物的上調(diào)。

圖10表明GlyRS和G6片段刺激多種細(xì)胞因子的分泌，所述細(xì)胞因子包括IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MIP1-α、MIP-1β、GRO-α、MCP-1和IL-1ra。

圖11A和11B表明GlyRS片段G6和G6-3誘導(dǎo)小鼠白血病巨噬細(xì)胞的遷移。

圖12表明GlyRS片段G6誘導(dǎo)HL-60早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞的遷移。

圖13表明在小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基中均可檢測到GlyRS，這表明全長GlyRS的內(nèi)源性分泌。

圖14表明用LPS處理小鼠巨噬細(xì)胞的情況下，在分泌的培養(yǎng)基中可以發(fā)現(xiàn)GlyRS的特異性片段，但在細(xì)胞裂解物中不能發(fā)現(xiàn)GlyRS的特異性片段，這表明GlyRS片段的產(chǎn)生和分泌。

圖15表示用LPS處理小鼠巨噬細(xì)胞以后，為了鑒定片段產(chǎn)生自哪部分的全長蛋白而進(jìn)行的LC/MS/MS分析的結(jié)果。

圖16A顯示了上清條帶9的序列信息，所述上清條帶9為分子量為約45-50kd的GRS片段，加粗部分顯示相關(guān)的肽序列。圖16B顯示了上清條帶18的序列信息，所述上清條帶18為分子量為約15kd的GRS片段，加粗部分顯示相關(guān)的肽序列。

發(fā)明的詳細(xì)描述

除非文中有明確相反指示，本發(fā)明的實踐可利用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)方法和重組DNA技術(shù)，為了說明的目的，其中很多方法和技術(shù)在下文進(jìn)行了描述。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的講解。參見，例如，Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A1Laboratory Manual(分子克隆：實驗手冊)(第2版,1989)；Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克?。簩嶒炇謨?(1982)；DNA Cloning:A Practical Approach (DNA克隆：操作方法),vol.I&II(D.Glover,ed.)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(N.Gait,ed.,1984)；Nucleic Acid Hybridization (核酸雜交)(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985)；Transcription and Translation(轉(zhuǎn)錄和翻譯)(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984)；Animal Cell Culture(動物細(xì)胞培養(yǎng))(R.Freshney,ed.,1986)；A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆操作指南)(B.Perbal,ed.,1984)。

本文引用的所有出版物、專利、專利申請通過引用的方式將其全部內(nèi)容并入本文。

在本說明書和附加的權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“a”、“an”、“the”包括復(fù)數(shù)形式，除非文中明確指示不包括復(fù)數(shù)。

本文所用的術(shù)語“多肽”和“蛋白”以常規(guī)含義使用，即氨基酸序列。多肽不被限制為特定的長度，但是，在本發(fā)明的背景下，其通常代表全長蛋白的片段，并且可以包括諸如糖基化、乙?；?、磷酸化等的翻譯后修飾以及本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他修飾，并且包括天然存在的或非天然存在的修飾?？梢允褂枚喾N公知的重組技術(shù)和/或合成技術(shù)來制備本發(fā)明的多肽和蛋白，這些技術(shù)的示例性實例將在下文進(jìn)一步討論。

甘氨酰tRNA合成酶多肽

本發(fā)明通常涉及分離的GlyRS多肽、編碼該多肽的多核苷酸、與該多肽結(jié)合的結(jié)合劑、該多肽的類似物、變體和片段等，以及使用上述任何物質(zhì)的組合物和方法。

因此，按照本發(fā)明的一方面，提供了具有治療相關(guān)的非常規(guī)活性的GlyRS多肽，以及包含所述GlyRS多肽的組合物。在某些實施方案中，GlyRS多肽是GlyRS蛋白的截短的形式。本文所用的“截短的”GlyRS是指短于其對應(yīng)的全長GlyRS蛋白的甘氨酰-tRNA合成酶蛋白，例如，由于從所述全長GlyRS蛋白N末端和/或C末端移除氨基酸。截短的程度，即從全長GlyRS蛋白移除的N末端和/或C末端氨基酸殘基的數(shù)量，可以明顯不同，但是如本文所述，當(dāng)給予細(xì)胞、組織或個體時，仍然提供所需的細(xì)胞效應(yīng)。在某些實施方案中，從全長GlyRS蛋白的N末端和/或C末端截去至少約5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350個氨基酸或更多，包括所有中間的長度。中間的長度意圖包括之間的所有整數(shù)，例如，6、7、8等，51、52、53等，201、202、203等。

在某些示例性的實施方案中，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的和可得到的技術(shù)、使用多種蛋白水解酶中的任何一種來產(chǎn)生截短的GlyRS多肽。示例性的蛋白酶包括，例如，無色肽酶、氨肽酶、安克洛酶、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、菠羅蛋白酶、鈣蛋白酶、鈣蛋白酶I、鈣蛋白酶II、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶P、羧肽酶W、羧肽酶Y、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶13、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶G、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、木瓜凝乳蛋白酶、胃促胰酶、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶、膠原酶、補體C1r、補體C1s、補體因子D、補體因子I、黃瓜素、二肽基肽酶IV、彈性蛋白酶(白細(xì)胞)、彈性蛋白酶(胰腺)、內(nèi)蛋白酶Arg-C、內(nèi)蛋白酶Asp-N、內(nèi)蛋白酶Glu-C、內(nèi)蛋白酶Lys-C、腸激酶、因子Xa、無花果蛋白酶、弗林蛋白酶、粒酶A、粒酶B、HIV蛋白酶、IGase、組織激肽釋放酶、亮氨酸氨基肽酶(總的)、亮氨酸氨基肽酶(細(xì)胞溶質(zhì)的)、亮氨酸氨基肽酶(微粒體的)、基質(zhì)金屬蛋白酶、蛋氨酸氨基肽酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纖維蛋白溶酶、氨?；彼岫拿?、鏈酶蛋白酶E、前列腺特異性抗原、來自灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)的堿性蛋白酶、來自曲霉屬(Aspergillus)的蛋白酶、來自佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)的蛋白酶、來自醬油曲霉(Aspergillus sojae)的蛋白酶、蛋白酶(地衣芽孢桿菌(B.licheniformis))(堿性的或堿性蛋白酶)、來自多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)的蛋白酶、來自芽孢桿菌(Bacillus sp.)的蛋白酶、來自根霉菌(Rhizopus sp.)的蛋白酶、蛋白酶S、蛋白酶體、來自米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶A、蛋白酶K、蛋白C、焦谷氨酸氨基肽酶、凝乳酶、鏈激酶、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、凝血酶、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、胰蛋白酶、類胰蛋白酶和尿激酶。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供了本文所述的GlyRS多肽的變體。本發(fā)明某些示例性實施方案所包括的多肽變體通常沿其長度表現(xiàn)出與野生型GlyRS蛋白的對應(yīng)的區(qū)的至少約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性(按照下文所述測定)，所述野生型GlyRS蛋白例如SEQ ID NO:1。

多肽變體與天然存在的GlyRS多肽的區(qū)別可以是一個或多個取代、缺失、添加和/或插入。這些變體可以是天然存在的或可以是合成產(chǎn)生的，例如，通過修飾一個或多個本發(fā)明的上述多肽序列并按照本文所述用本領(lǐng)域內(nèi)公知的多種技術(shù)中的任何一種評估其生物活性。

在其他的示例性實施方案中，GlyRS變體可以是天然存在的或非天然存在的剪接變體，其中所述剪接變體具有至少一種非常規(guī)活性，例如本文所述的非常規(guī)活性。

在其他的示例性實施方案中，相對于野生型GlyRS多肽序列，所述變體包含一個或多個天然存在的或非天然存在的點突變，其中所述變體多肽具有至少一種非常規(guī)活性，例如本文所述的非常規(guī)活性。

在某些實施方案中，變體包含保守型取代?！氨Ｊ匦腿〈笔侵赴被岜痪哂邢嗨菩再|(zhì)的另一個氨基酸所取代，這樣本領(lǐng)域技術(shù)人員會預(yù)測到基本上未改變的多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性?？梢栽诒景l(fā)明的多核苷酸和多肽的結(jié)構(gòu)內(nèi)進(jìn)行修飾，并且仍可獲得編碼具有所需特性的變體或衍生多肽的功能分子。當(dāng)希望改變多肽的氨基酸序列來產(chǎn)生等同的甚至改進(jìn)的本發(fā)明的GlyRS多肽的變體時，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)表1改變編碼DNA序列的一個或多個密碼子。

例如，在蛋白結(jié)構(gòu)中，某些氨基酸可以被其他的氨基酸取代，而不會造成與諸如受體、抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子的結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)的相互作用結(jié)合能力的明顯損失。因為通常是蛋白的相互作用能力和性質(zhì)限定該蛋白的生物功能活性，所以可以在蛋白序列中進(jìn)行某些氨基酸序列取代，也當(dāng)然可以在其基本的DNA編碼序列中進(jìn)行取代，而仍然獲得具有相似性質(zhì)的蛋白。因此，已考慮到可以在所公開的組合物的多肽序列或編碼所述多肽的相應(yīng)DNA序列中進(jìn)行各種改變，而不會造成所需的功效或活性的明顯損失。

表1

在進(jìn)行這些改變時，還應(yīng)當(dāng)考慮氨基酸的親水指數(shù)。本領(lǐng)域內(nèi)普遍理解親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白相互作用的生物學(xué)功能中的重要性(Kyte and Doolittle,1982，通過引用并入本文)。例如，已知氨基酸的相對親水特性與得到的蛋白的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，而該二級結(jié)構(gòu)隨之限定了該蛋白與諸如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等其他分子的相互作用?；诎被岬氖杷院碗姾商匦裕糠N氨基酸具有指定的親水指數(shù)(Kyte and Doolittle,1982)。這些值是：異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。

本領(lǐng)域內(nèi)已知，某些氨基酸可以被具有相似親水指數(shù)或評分的其他氨基酸取代，而仍產(chǎn)生具有相似生物活性的蛋白，即仍獲得生物學(xué)功能等同的蛋白。在進(jìn)行這些改變時，親水指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，特別優(yōu)選的是在±1以內(nèi)的氨基酸的取代，并且更特別優(yōu)選的是在±0.5以內(nèi)的那些氨基酸的取代。

本領(lǐng)域內(nèi)還應(yīng)當(dāng)理解，可以基于親水性有效地進(jìn)行相似氨基酸的取代。如美國專利第4,554,101號詳述，已將下述親水性值指定給氨基酸殘基：精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。應(yīng)當(dāng)理解，氨基酸可以被具有相似親水性值的另一氨基酸取代，且仍獲得生物學(xué)上等同的蛋白。在這類改變中，親水性值在±2以內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，特別優(yōu)選的是在±1以內(nèi)的氨基酸的取代，并且更特別優(yōu)選的是在±0.5以內(nèi)的那些氨基酸的取代。

如上文所述，氨基酸取代可以基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對的相似性，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。綜合考慮了上述各種特性的示例性取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且包括：精氨酸與賴氨酸、谷氨酸與天冬氨酸、絲氨酸與蘇氨酸、谷氨酰胺與天冬酰胺、以及纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸。

還可以基于殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì)的相似性進(jìn)行氨基酸取代。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸，以及帶有具有相似親水性值的不帶電荷極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括：亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守型改變的其他氨基酸組包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。變體還可以含有非保守型改變或可選擇地含有非保守型改變。在優(yōu)選的實施方案中，變體多肽與天然序列的區(qū)別在于5個或更少的氨基酸的取代、缺失或添加。還可以(或可選擇地)通過例如對多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)具有最小影響的氨基酸的缺失或添加來修飾變體。

多肽在蛋白的N末端可以包含信號(或前導(dǎo))序列，其在翻譯的同時或在翻譯后指導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)移。多肽還可以與連接物或其他序列綴合，以便于多肽的合成、純化或鑒定(例如，多聚組氨酸)，或用于增強多肽與固相載體的結(jié)合。例如，多肽可以與免疫球蛋白Fc區(qū)綴合。

當(dāng)比較多肽序列時，如果兩個序列中的氨基酸序列在如下文所述進(jìn)行最大對應(yīng)比對時是相同的，則可以認(rèn)為所述兩個序列是“同一的”。通常通過在比較窗中比較序列來進(jìn)行兩個序列間的比較，從而鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域。本文所用的“比較窗”是指至少約20個連續(xù)位置、通常30-約75個、40-約50個連續(xù)位置的節(jié)段，其中在將序列與具有相同數(shù)量連續(xù)位置的參考序列最佳比對后，可以將所述序列與參考序列進(jìn)行比較。

例如，可以使用Lasergene生物信息學(xué)軟件套裝中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)，使用默認(rèn)參數(shù)，進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對。該程序包括以下參考文獻(xiàn)中描述的數(shù)種比對方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change in Proteins-Matrices for detecting distant relationships(蛋白質(zhì)的進(jìn)化改變模型-用于檢驗遠(yuǎn)距離關(guān)系的矩陣)；In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜),National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.(1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes(比對和系統(tǒng)發(fā)生的標(biāo)準(zhǔn)方法)pp.626-645Methods in Enzymology(酶學(xué)方法)vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.(1989)CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.and Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 11:105；Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy(數(shù)值分類法-數(shù)值分類法的原理和實踐),Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Proc.Nat'l Acad.,Sci.USA 80:726-730。

可選擇地，可以通過以下來進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對：Smith and Waterman(1981)Add.APL.Math 2:482的局部同一性算法、Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同一性比對算法、Pearson and Lipman(1988)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85:2444的相似性方法搜索、這些算法的計算機(jī)執(zhí)行(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)、或檢查。

適于測定序列同一性和序列相似性百分比的算法的實例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分別描述于Altschul et al.(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。例如，可以按照本文所述的參數(shù)使用BLAST和BLAST 2.0，從而測定本發(fā)明多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)可以公開獲得進(jìn)行BLAST分析的軟件。對于氨基酸序列而言，可以將評分矩陣用于計算累積評分。在以下情況時停止每個方向的字符命中延伸：當(dāng)累積比對評分從其最大達(dá)到的值下降量X時；由于一個或多個負(fù)評分殘基比對的累積而使累積評分達(dá)到0或低于0時；或達(dá)到任一序列的末端時。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了所述比對的靈敏度和速度。

在一個示例性方法中，通過在至少20個位置的比較窗中比較兩個最佳比對的序列來測定“序列同一性百分比”，其中，與用于兩個序列最佳比對的參考序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗中的多肽序列的一部分可以包含20％或更少的、通常為5％-15％、或10％-12％的添加或缺失(即，空位)。通過以下來計算百分比：測定兩個序列中都存在的相同氨基酸殘基的位置數(shù)量來產(chǎn)生配對位置數(shù)，將配對位置數(shù)除以參考序列中(即窗的大小)的位置總數(shù)，并且將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。

在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了融合多肽和編碼融合多肽的多核苷酸。融合多肽是指直接地或間接地通過氨基酸連接物共價連接于一個或多個異源多肽序列(融合伴侶)的本發(fā)明的多肽。形成融合蛋白的多肽通常是將C末端連接至N末端，但是它們也可以是C末端連接至C末端、N末端連接至N末端、或N末端連接至C末端。融合蛋白的多肽可以為任何順序。

可以為了幾乎任何所需目的設(shè)計并包括融合伴侶，只要它們對多肽所需的活性沒有不利影響。例如，在一個實施方案中，融合伴侶包含有助于以高于天然重組蛋白的產(chǎn)量表達(dá)蛋白(表達(dá)增強子)的序列。可以選擇其他的融合伴侶，以增加蛋白的溶解性或使蛋白能靶向于所需的細(xì)胞內(nèi)部分。其他融合伴侶包括促進(jìn)蛋白純化的親和性標(biāo)簽。

通?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備融合蛋白。例如，可以分別組裝編碼所需融合的多肽組分的DNA序列，并將其連入合適的表達(dá)載體中。使用或不使用肽連接物將編碼一種多肽組分的DNA序列的3'端與編碼第二多肽組分的DNA序列的5'端連接，這樣序列的讀碼框是同相的。這允許翻譯為同時保留兩個組分多肽的生物活性的單一融合蛋白。

如果需要，可以用肽連接物序列將第一和第二多肽組分隔開足以確保每種多肽折疊成其二級和三級結(jié)構(gòu)的距離。用本領(lǐng)域內(nèi)公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這類肽連接物序列并入融合蛋白?？梢曰谙铝幸蛩剡x擇某些肽連接物序列：(1)它們采取柔韌的、伸展的構(gòu)型的能力；(2)它們不會采取與第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二級結(jié)構(gòu)的能力；和(3)可以與所述多肽功能表位反應(yīng)的疏水或帶電殘基的缺乏。優(yōu)選的肽連接物序列包含Gly、Asn和Ser殘基。諸如Thr和Ala的其它接近中性的氨基酸也可以用于連接物序列中?？梢杂行У赜米鬟B接物的氨基酸序列包括公開于Maratea et al.,Gene 40:39 46(1985)；Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258 8262(1986)；美國專利第4,935,233號和第4,751,180號中的那些氨基酸序列。通常，連接物序列的長度可以為1-約50個氨基酸。當(dāng)?shù)谝缓偷诙嚯木哂锌梢杂脕砀糸_功能結(jié)構(gòu)域和防止空間干擾的非必需N末端氨基酸區(qū)時，不需要連接物序列。

將連接的DNA序列可操作地連接于合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件。負(fù)責(zé)DNA表達(dá)的調(diào)節(jié)元件位于編碼第一多肽的DNA序列的5'。同樣，終止翻譯所需的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號位于編碼第二多肽的DNA序列的3'。

通常，多肽和融合多肽(以及它們的編碼多核苷酸)是分離的?！胺蛛x的”多肽或多核苷酸是從其原來的環(huán)境中移出的多肽或多核苷酸。例如，如果將天然存在的蛋白與天然系統(tǒng)中的部分或所有的共存物質(zhì)分開，則該天然存在的蛋白是分離的。優(yōu)選地，這類多肽是至少約90％純的，更優(yōu)選為至少約95％純的和最優(yōu)選為至少約99％純的。例如，如果多核苷酸被克隆入不是天然環(huán)境的一部分的載體中，則認(rèn)為所述多核苷酸是分離的。

在其他的實施方案中，本發(fā)明的GlyRS多肽可以是二聚體的一部分。二聚體可以包括，例如，兩個相同GlyRS多肽之間的同二聚體、兩個不同GlyRS多肽之間的異二聚體(例如，全長GlyRS多肽和截短的GlyRS多肽或兩個不同的截短的GlyRS多肽)、和/或GlyRS多肽和異源多肽之間的異二聚體。單體和/或二聚體可以是可溶的，并且可以被分離為或純化為同質(zhì)性。諸如GlyRS多肽和異源多肽之間的異二聚體的某些異二聚體可以是雙功能的。

在其他的實施方案中，本發(fā)明的GlyRS多肽可以是多單元復(fù)合物的一部分。本發(fā)明的多單元復(fù)合物可以包括，例如，至少2、3、4、或5或更多的單體。所述單體和/或多單元復(fù)合物可以是可溶的，并且可以被分離為或純化為同質(zhì)性。多單元復(fù)合物的單體單元彼此之間可以是不同的、同源的、基本上同源的或相同的。然而，本發(fā)明的多單元復(fù)合物包括至少1個單體，所述單體包含如本發(fā)明所述的一種GlyRS多肽或在其他的實施方案中，包含至少兩種或更多種如本文所述的GlyRS多肽。

共價連接的單體可以是直接(通過鍵)連接的或間接(例如，通過連接物)連接的。為了直接連接本文的多肽單體，修飾本文的多肽以增強二聚化或多聚化可能是有益的。例如，可以通過一個或多個半胱氨酸的添加或取代來修飾GlyRS多肽的一個或多個氨基酸殘基。產(chǎn)生諸如半胱氨酸取代的氨基酸取代或其他修飾來促進(jìn)連接的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。

如本文所述，本發(fā)明的某些實施方案還考慮修飾的GlyRS多肽的用途，包括改善GlyRS所需特性的修飾。本發(fā)明GlyRS多肽的示例性修飾包括，但不限于，一個或多個組成氨基酸的化學(xué)和/或酶促衍生作用，包括側(cè)鏈修飾、主鏈修飾和N末端與C末端修飾，這些修飾包括乙?；⒘u基化、甲基化、酰胺化；和碳水化合物或脂質(zhì)部分、輔因子等的連接。示例性的修飾還包括GlyRS多肽的聚乙二醇化(參見，例如，Veronese and Harris,Advanced Drug Delivery Reviews(藥物遞送發(fā)展綜述)54:453-456,2002，通過引用并入本文)。

在某些方面中，化學(xué)選擇性連接技術(shù)可以用于修飾本發(fā)明截短的GlyRS多肽，例如通過以位點特異性或受控制的方式連接聚合物。通常，這類技術(shù)依賴于通過化學(xué)或重組手段將化學(xué)選擇性錨合并入蛋白主鏈，并且隨后用攜帶互補連接物的聚合物進(jìn)行修飾。因此，可以控制組裝過程和產(chǎn)生的蛋白-聚合物綴合物的共價結(jié)構(gòu)，這使得諸如功效和藥物代謝動力學(xué)特性的藥物性質(zhì)的合理優(yōu)化成為可能(參見，例如，Kochendoerfer,Current Opinion in Chemical Biology 9:555-560,2005)。

多核苷酸組合物

本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明GlyRS多肽的分離的多核苷酸，以及包含這些多核苷酸的組合物。

如本文所用的術(shù)語“DNA”和“多核苷酸”和“核酸”是指從具體物種的總基因組DNA分離出來的DNA分子。因此，編碼多肽的DNA節(jié)段是指這樣的DNA片段，其含有一種或多種編碼序列，而基本上從獲得所述DNA片段的物種的總基因組DNA分離出來的或純化出來。術(shù)語“DNA節(jié)段”和“多核苷酸”包括DNA節(jié)段和這些節(jié)段的較小片段，并且還包括重組載體，包括例如，質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、噬菌體、病毒等。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，本發(fā)明的多核苷酸序列包括基因組序列、基因組外序列和質(zhì)粒編碼的序列以及表達(dá)或被改造來表達(dá)蛋白、多肽、肽等的較小的工程基因節(jié)段。這類節(jié)段可以是天然分離的，或人工合成修飾的。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公認(rèn)的，多核苷酸可以是單鏈的(編碼或反義)或雙鏈的，并且可以是DNA(基因組、cDNA或合成物)或RNA分子。其他編碼或非編碼序列可以，但不需要，存在于本發(fā)明的多核苷酸中，并且多核苷酸可以，但不需要，與其他的分子和/或支持物質(zhì)連接。

多核苷酸可以包含天然序列(即，編碼GlyRS或其部分的內(nèi)源序列)，或可以包含變體，或該序列的生物學(xué)功能等同物。如下面進(jìn)一步論述，多核苷酸變體可以包含一個或多個取代、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選使得所編碼的多肽的所需活性相對于未修飾的多肽沒有顯著減弱。通常，可以按本文所述來評價對于所編碼的多肽的活性的影響。

在其他的實施方案中，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其包含與甘氨酰-tRNA合成酶相同或互補的序列的不同長度的連續(xù)區(qū)段，其中所述分離的多核苷酸編碼如本文所述的GlyRS。

例如，本發(fā)明提供的多核苷酸編碼至少約5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500或更多個本發(fā)明GlyRS多肽的連續(xù)氨基酸殘基，以及所有的中間長度。應(yīng)當(dāng)容易理解，此處的“中間長度”表示所提到的值之間的任何長度，例如101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。

在其他的實施方案中，本發(fā)明涉及能夠在中度嚴(yán)緊條件下與本文提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸，或該多核苷酸的片段，或該多核苷酸的互補序列。雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)公知的。為了說明的目的，適于測試本發(fā)明的多核苷酸與其他多核苷酸雜交的中度嚴(yán)緊條件包括：在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中預(yù)先洗滌；在5×SSC中、于50℃-65℃雜交過夜；然后，用含有0.1％SDS的2×SSC、0.5×SSC和0.2×SSC中的每一種、于65℃洗滌20分鐘，洗滌兩次。

不考慮編碼序列自身的長度，本發(fā)明的多核苷酸可以與其他的DNA序列組合，所述其他的DNA序列例如啟動子、聚腺苷酸化信號、其他的限制性酶切位點、多克隆位點、其他的編碼節(jié)段等，從而它們的總長度可以有相當(dāng)大的變化。因此，應(yīng)當(dāng)考慮到，可以使用幾乎任何長度的多核苷酸片段，總長度優(yōu)選地受在計劃的重組DNA流程中制備和使用的便利性的限制。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于遺傳密碼的簡并性，有很多核苷酸序列編碼如本文所述的多肽。這些多核苷酸中的某些與任何天然基因的核苷酸序列具有低的同源性。雖然如此，本發(fā)明特別考慮到由于密碼子使用中的差異而不同的多核苷酸，例如，為人和/或靈長類動物密碼子選擇而優(yōu)化的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。等位基因是由于一個或多個諸如核苷酸的缺失、添加和/或取代的突變而改變的內(nèi)源基因。所得到的mRNA和蛋白可以，但不需要，具有改變的結(jié)構(gòu)或功能?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定等位基因(例如雜交、擴(kuò)增和/或數(shù)據(jù)庫序列比較)。

可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的和可獲得的多種公認(rèn)的技術(shù)中的任何一種來制備、操控和/或表達(dá)多核苷酸及其融合。例如，編碼本發(fā)明多肽或其融合蛋白或功能等同物的多核苷酸序列可以用于重組DNA分子中，從而控制GlyRS多肽在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。由于遺傳密碼內(nèi)在的簡并性，可以產(chǎn)生編碼基本上相同的或功能上等同氨基酸序列的其他DNA序列，并且這些序列可以用來克隆和表達(dá)給定的多肽。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解地，在一些情況下，產(chǎn)生具有非天然存在的密碼子的編碼多肽的核苷酸序列是有利的。例如，可以選擇特定原核生物或真核生物宿主所偏好的密碼子來增加蛋白表達(dá)率或產(chǎn)生具有所需特性的重組RNA轉(zhuǎn)錄物，所述所需特性例如比天然存在的序列所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物更長的半壽期。

此外，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法改造本發(fā)明的多核苷酸序列，從而為了多種原因改變多肽編碼序列的多核苷酸，包括但不限于修飾基因產(chǎn)物的克隆、加工、表達(dá)和/或活性的改變。

為了表達(dá)所需的多肽，可以將編碼多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合適的表達(dá)載體中，即包含插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件的載體?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法構(gòu)建含有編碼目的多肽的序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括：體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。這些技術(shù)描述于Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆，實驗手冊)(1989)和Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù))(1989)中。

多種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)是已知的，并且可以用來包含和表達(dá)多核苷酸序列。這些表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)包括但不限于，諸如用重組噬菌體、質(zhì)粒、或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的微生物；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒TMV)或用細(xì)菌表達(dá)載體(例如，Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動物細(xì)胞系統(tǒng)。

表達(dá)載體中存在的“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”是與宿主細(xì)胞蛋白相互作用來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體的那些非翻譯區(qū)(增強子、啟動子、5'和3'非翻譯區(qū))。這些元件在它們的強度和特異性上可以不同。根據(jù)所用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)量的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。例如，當(dāng)克隆入細(xì)菌系統(tǒng)時，可以使用誘導(dǎo)型啟動子，諸如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene,La Jolla,Calif.)或PSPORT1質(zhì)粒(Gibco BRL,Gaithersburg,Md.)的雜合lacZ啟動子等。在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中，通常優(yōu)選來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子。如果有必要產(chǎn)生含有編碼多肽的序列的多拷貝的細(xì)胞系，則可以優(yōu)選地使用基于SV40或EBV的、帶有合適的選擇標(biāo)記的載體。

在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)表達(dá)的多肽的希望的用途，可以選擇多種表達(dá)載體。例如，當(dāng)大量需要時，可以使用指導(dǎo)容易純化的融合蛋白的高水平表達(dá)的載體。這類載體包括但不限于，諸如BLUESCRIPT(Stratagene)的多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體，其中將編碼目的多肽的序列與載體連接，與氨基末端Met和隨后的β-半乳糖苷酶的7個殘基在同一讀碼框中，以便產(chǎn)生雜交蛋白；pIN載體(Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.264:5503 5509(1989))等。pGEX載體(Promega,Madison,Wis.)也可以用來將外源多肽表達(dá)為具有谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常，這類融合蛋白是可溶的，并且可以通過谷胱甘肽瓊脂糖珠的吸附并隨后在游離谷胱甘肽的存在下洗脫來容易地從裂解的細(xì)胞中純化。這些系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白可以被設(shè)計為包括肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶切割位點，以便任意地從GST部分釋放克隆的目的多肽。

在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用多種含有諸如α因子、醇氧化酶和PGH的組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體。對于綜述而言，可以參見Ausubel et al.(同上)和Grant et al.,Methods Enzymol(酶學(xué)方法)153:516-544(1987)。

如果使用植物表達(dá)載體，編碼多肽的序列的表達(dá)可以由多種啟動子中的任何一種所驅(qū)動。例如，諸如CaMV的35S和19S啟動子的病毒啟動子可以單獨使用或與來自TMV的Ω前導(dǎo)序列聯(lián)合使用(Takamatsu,EMBO J.6:307-311(1987))?？蛇x擇地，可以使用諸如RUBISCO的小亞基或熱休克啟動子的植物啟動子(Coruzzi et al.,EMBO J.3:1671-1680(1984)；Broglie et al.,Science 224:838-843(1984)；和Winter et al.,Results Probl.Cell Differ.17:85-105(1991))。可以通過直接的DNA轉(zhuǎn)化或病原體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將這些構(gòu)建體引入植物細(xì)胞。這類技術(shù)描述于很多可普遍獲得的綜述中(參見，例如，Hobbs in McGraw Hill,Yearbook of Science and Technology,pp.191-196(1992))。

還可以用昆蟲系統(tǒng)來表達(dá)目的多肽。例如，在一種這類系統(tǒng)中，將苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)被用作載體在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達(dá)外來基因。可以將編碼多肽的序列克隆入病毒的非必需區(qū)，例如多角體蛋白基因，并置于多角體蛋白啟動子的控制下。編碼多肽的序列的成功插入會使多角體蛋白基因失活，并產(chǎn)生缺少衣殼蛋白的重組病毒。隨后，可以將所述重組病毒用于感染例如草地貪夜蛾細(xì)胞或粉紋夜蛾幼蟲，其中目的多肽可以表達(dá)(Engelhard et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:3224-3227(1994))。

在哺乳動物宿主細(xì)胞中，通?？梢允褂枚喾N基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。例如，如果將腺病毒用作表達(dá)載體，則可以將編碼目的多肽的序列連入由晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合物中。病毒基因組的非必需E1或E3區(qū)中的插入可以用來獲得能在感染的宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽的活病毒(Logan&Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:3655-3659(1984))。此外，可以使用諸如魯斯氏肉瘤病毒(RSV)增強子的轉(zhuǎn)錄增強子來增強哺乳動物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。

也可以使用特異性起始信號來實現(xiàn)編碼目的多肽的序列的更高效的翻譯。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近的序列。如果將編碼多肽的序列、其起始密碼子和上游序列插入合適的表達(dá)載體中，則可以不需要其他的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號。然而，如果僅將編碼序列或其一部分插入，則應(yīng)該提供包括ATG起始密碼子在內(nèi)的外源翻譯控制信號。此外，起始密碼子應(yīng)該在正確的讀碼框中以確保全部插入物的翻譯。外源翻譯元件和起始密碼子可以是不同來源的，可以是天然的或合成的?？梢酝ㄟ^包含適于所用的特定細(xì)胞系統(tǒng)的增強子來增強表達(dá)效率，諸如文獻(xiàn)中描述的那些增強子(Scharf et al.,Results Probl.Cell Differ.20:125-162(1994))。

此外，可以基于宿主細(xì)胞株調(diào)節(jié)插入的序列的表達(dá)或以所需的方式加工所表達(dá)的蛋白的能力來選擇宿主細(xì)胞株。多肽的這些修飾包括但不限于，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化和?；Ｇ懈畹鞍椎摹扒霸毙问降姆g后加工也可以用來促進(jìn)正確的插入、折疊和/或功能。可以選擇諸如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和W138的、對于這類翻譯后活性具有特異性的細(xì)胞體系和特征機(jī)制的不同宿主細(xì)胞，以確保外源蛋白的正確修飾和加工。

為了長期、高產(chǎn)量地產(chǎn)生重組蛋白，通常優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達(dá)目的多核苷酸的細(xì)胞系，所述表達(dá)載體可以在同一載體或分別的載體上含有病毒復(fù)制起點和/或內(nèi)源表達(dá)元件以及選擇標(biāo)記基因。引入載體后，在將細(xì)胞轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基之前，可以允許細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天。選擇標(biāo)記的目的是賦予對于選擇的抗性，并且選擇標(biāo)記的存在允許成功表達(dá)引入的序列的細(xì)胞的生長和恢復(fù)?？梢杂眠m合細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的抗性克隆。

可以用任何數(shù)量的選擇系統(tǒng)來恢復(fù)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。這些選擇系統(tǒng)包括但不限于，可以分別在tk^－細(xì)胞或aprt^－細(xì)胞中使用的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.,Cell 11:223-232(1977))和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy et al.,Cell 22:817-823(1990))基因。此外，抗代謝物、抗生素或除草劑抗性可以被用作選擇的基礎(chǔ)；例如，賦予對氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:3567-70(1980))；賦予對氨基糖苷類、新霉素和G-418的抗性的npt(Colbere-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1-14(1981))；以及分別賦予對氯磺隆和草胺磷乙酰轉(zhuǎn)移酶的抗性的als或pat(Murry，同上)。其它選擇基因已有描述，例如，允許細(xì)胞利用吲哚來代替色氨酸的trpB，或允許細(xì)胞利用組胺醇來代替組氨酸的hisD(Hartman&Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8047-51(1988))。可視標(biāo)記已獲得普遍應(yīng)用，這類標(biāo)記如花青素、β-葡糖苷酸酶及其底物GUS、以及熒光素酶及其底物熒光素，這類標(biāo)記不僅廣泛用于鑒定轉(zhuǎn)化株，而且用于對歸因于特異性載體系統(tǒng)的瞬時或穩(wěn)定蛋白表達(dá)進(jìn)行定量(Rhodes et al.,Methods Mol.Biol.55:121-131(1995))。

使用對產(chǎn)物特異性的多克隆或單克隆抗體檢測和測量多核苷酸編碼的產(chǎn)物的表達(dá)的多種方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)和熒光活化細(xì)胞分選(FACS)。這些測定和其他測定描述于Hampton et al.,Serological Methods,a Laboratory Manual(血清學(xué)方法：實驗手冊)(1990)和Maddox et al.,J.Exp.Med.158:1211-1216(1983)等中。

廣泛多種的標(biāo)記和綴合技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以用于各種核酸和氨基酸測定中。產(chǎn)生用于檢測多核苷酸相關(guān)序列的標(biāo)記的雜交或PCR探針的手段包括寡核苷酸標(biāo)記、缺口平移、末端標(biāo)記或使用標(biāo)記的核苷酸的PCR擴(kuò)增?？蛇x擇地，可以將序列或其任何部分克隆入載體中，用于產(chǎn)生mRNA探針。這類載體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且是可商業(yè)購得的，并且可以通過添加諸如T7、T3或SP6的合適的RNA聚合酶和標(biāo)記的核苷酸來體外合成RNA探針?？梢允褂枚喾N可商業(yè)購得的試劑盒進(jìn)行這些步驟?？梢允褂玫暮线m的報告分子或標(biāo)記包括放射性核素、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑或產(chǎn)色劑以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。

可以在適合蛋白從細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)和回收的條件下，培養(yǎng)用目的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。根據(jù)序列和/或所用的載體，重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白可以是分泌的或包含在細(xì)胞內(nèi)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解地，可以將包含本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體設(shè)計為包含指導(dǎo)編碼的多肽通過原核生物或真核生物細(xì)胞膜的分泌的信號序列?？梢杂闷渌闹亟M構(gòu)造將編碼目的多肽的序列連接至編碼促進(jìn)可溶蛋白純化的多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。

除了重組產(chǎn)生方法，可以通過使用固相技術(shù)的直接肽合成來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽及其片段(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))?？梢杂檬謩蛹夹g(shù)或通過自動化來進(jìn)行蛋白合成。例如，可以用Applied Biosystems的431A肽合成儀(Perkin Elmer)實現(xiàn)自動化合成?？蛇x擇地，可以分別地化學(xué)合成不同片段并使用化學(xué)方法將片段組合來產(chǎn)生全長分子。

按照本發(fā)明的另一方面，可以例如使用基因治療技術(shù)將編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸體內(nèi)遞送至個體?；蛑委熗ǔＪ侵笇愒春怂徂D(zhuǎn)移至患有該治療所針對的病癥或疾病狀態(tài)的哺乳動物，尤其是人的某些細(xì)胞、靶細(xì)胞。以下述方式將核酸引入選擇的靶細(xì)胞，使得異源DNA表達(dá)并從而產(chǎn)生所編碼的治療產(chǎn)物。

如本文所教導(dǎo)的能用于基因治療的各種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)，或優(yōu)選地諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA病毒。優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是鼠或鳥逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物或是慢病毒載體。優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒載體?？梢圆迦雴我煌庠椿虻哪孓D(zhuǎn)錄病毒載體的實例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)、SIV、BIV、HIV和勞氏肉瘤病毒(RSV)。多種其他的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以并入多個基因。所有的這些載體能轉(zhuǎn)移或并入用于選擇性標(biāo)記的基因，以便鑒定和產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。例如，通過將來源于鋅指的DNA結(jié)合目的多肽序列以及編碼對于特異性靶細(xì)胞上的受體的配體的另一基因插入病毒載體，可以使所述載體成為靶標(biāo)特異性的。例如，通過插入編碼蛋白(二聚體)的多核苷酸，可以使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體成為靶標(biāo)特異性的。通過使用抗體來靶向于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以實現(xiàn)示例性的靶向。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)指導(dǎo)或利用有限的實驗就能容易確定特異性多核苷酸序列，所述特異性多核苷酸序列能被插入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中，從而允許含有鋅指-核苷酸結(jié)合蛋白多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的靶向特異性遞送。

由于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒是缺陷型的，所以它們需要輔助以產(chǎn)生感染性載體顆粒。例如，可以通過使用輔助細(xì)胞系來提供該輔助，所述輔助細(xì)胞系含有編碼在LTR中的調(diào)節(jié)序列控制下的所有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒缺少能使包裝機(jī)制識別用于封裝的RNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列。缺失包裝信號的輔助細(xì)胞系包括但不限于，例如PSI.2、PA317和PA12。由于未包裝基因組，所以這些細(xì)胞系產(chǎn)生空的病毒體。如果將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入包裝信號完整的這類細(xì)胞中，而用其他目的基因替代結(jié)構(gòu)基因，則所述載體可以被包裝并可以產(chǎn)生載體病毒體。通過該方法產(chǎn)生的載體病毒體隨后可以用來感染諸如NIH 3T3細(xì)胞的組織細(xì)胞系，以產(chǎn)生大量嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒體。

也能使用用于基因治療的“非病毒”遞送技術(shù)，包括，例如，DNA-配體復(fù)合物、腺病毒-配體-DNA復(fù)合物、DNA的直接注射、CaPO₄沉淀、基因槍技術(shù)、電穿孔、脂質(zhì)體、脂轉(zhuǎn)染等。這些方法中的任何一種對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是可廣泛獲得的，并適于用在本發(fā)明中。其他合適的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是可獲得的，并且應(yīng)當(dāng)理解，可以使用可獲得的任何轉(zhuǎn)染方法來實現(xiàn)本發(fā)明。通過將分離的DNA分子封裝于脂質(zhì)體顆粒中并將該脂質(zhì)體顆粒與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜接觸，能實現(xiàn)脂轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體是自我組裝的膠體顆粒，其中由諸如磷脂酰絲氨酸或磷脂酰膽堿的兩性分子組成的脂質(zhì)雙分子層封裝了周圍介質(zhì)的一部分，這樣所述脂質(zhì)雙分子層包圍了親水內(nèi)部?？梢赃@樣構(gòu)建單層或多層脂質(zhì)體，使得內(nèi)部含有所需的化學(xué)品、藥物或如本發(fā)明中的分離的DNA分子。

結(jié)合劑和調(diào)節(jié)劑

按照另一方面，本發(fā)明還提供了表現(xiàn)出對于本文公開的GlyRS多核苷酸(包括剪接變體種類)或多肽、或其一部分、變體或衍生物的結(jié)合特異性的結(jié)合劑和調(diào)節(jié)劑和使用所述結(jié)合劑和調(diào)節(jié)劑的方法，所述結(jié)合劑和調(diào)節(jié)劑例如抗體及其抗原結(jié)合片段、可溶性受體、顯性負(fù)性多肽、干擾RNA等。優(yōu)選地，這些結(jié)合劑有效地調(diào)節(jié)一種或多種本發(fā)明GlyRS多核苷酸或多肽所介導(dǎo)的非常規(guī)活性，并且因此提供了所需的細(xì)胞和/或治療效應(yīng)。

在某些實施方案中，例如，所述結(jié)合劑與本發(fā)明GlyRS多核苷酸或多肽結(jié)合并調(diào)節(jié)(例如，抑制或增強)所述GlyRS多核苷酸或多肽介導(dǎo)一種或多種目的非常規(guī)活性的能力。例如，在一些實施方案中，所述結(jié)合劑與GlyRS多核苷酸或多肽結(jié)合并調(diào)節(jié)所述GlyRS多核苷酸或多肽與一種或多種它的細(xì)胞結(jié)合伴侶結(jié)合的能力。在其他的實施方案中，所述結(jié)合劑與本發(fā)明GlyRS多核苷酸或多肽結(jié)合并調(diào)節(jié)所述GlyRS多核苷酸或多肽的表達(dá)和/或活性。因此，這些結(jié)合劑通過調(diào)節(jié)GlyRS多核苷酸或多肽的活性可以用來治療或預(yù)防疾病、病癥或由本發(fā)明GlyRS多核苷酸或多肽介導(dǎo)的或相關(guān)的其他疾病狀態(tài)。

在某些示例性實施方案中，所述結(jié)合劑是與本發(fā)明的GlyRS多肽特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。如果抗體或其抗原結(jié)合片段與多肽以可檢測的水平(例如，在ELISA測定中)反應(yīng)，并且在相似條件下不與無關(guān)的多肽可檢測地反應(yīng)，則認(rèn)為所述抗體或其抗原結(jié)合片段與本發(fā)明多肽“特異性結(jié)合”、“免疫結(jié)合”和/或是“免疫反應(yīng)性的”。

在本文背景下所用的免疫結(jié)合等通常是指免疫球蛋白分子和該免疫球蛋白特異性針對的抗原之間發(fā)生的非共價型相互作用?？梢杂孟嗷プ饔玫慕怆x常數(shù)(K_d)來表示免疫結(jié)合相互作用的強度或親和力，其中K_d越小表示親和力越高?？梢杂帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的方法對所選多肽的免疫結(jié)合特性進(jìn)行定量。一種這類方法需要檢測抗原結(jié)合位點/抗原復(fù)合物形成和解離的速率，其中那些速率取決于復(fù)合物伴侶的濃度、相互作用的親和力和等同影響雙向速率的幾何參數(shù)。因此，可以通過計算濃度和結(jié)合與解離的實際速率來確定“結(jié)合速率常數(shù)”(k_on)和“解離速率常數(shù)”(k_Off)。k_Off/k_on的比值可以消去與親和力無關(guān)的所有參數(shù)，并且因此等于解離常數(shù)K_d。通常，參見，Davies et al.(1990)Annual Rev.Biochem.59:439-473。

抗體的“抗原結(jié)合位點”或“結(jié)合部分”是指參與抗原結(jié)合的免疫球蛋白分子的部分。重鏈(“H”)和輕鏈(“L”)的N末端可變區(qū)(“V”)的氨基酸殘基形成抗原結(jié)合位點。重鏈和輕鏈的V區(qū)中的三個高度不同的區(qū)段被稱為“高變區(qū)”，其插在稱為“框架區(qū)”或“FR”的較保守的側(cè)翼區(qū)段之間。因此，術(shù)語“FR”是指天然見于免疫球蛋白中高變區(qū)之間并鄰近高變區(qū)的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的三個高變區(qū)和重鏈的三個高變區(qū)在三維空間中彼此相對排布形成抗原結(jié)合表面。所述抗原結(jié)合表面與結(jié)合的抗原的三維表面互補，并且每條重鏈和輕鏈的三個高變區(qū)被稱為“互補決定區(qū)”或“CDR”。

例如，結(jié)合劑可以是具有或不具有肽組分的核糖體、RNA分子或多肽。在優(yōu)選的實施方案中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來制備抗體。參見，例如，Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(抗體：實驗手冊),Cold Spring Harbor Laboratory,1988。通常，可以通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生抗體，包括如本文所述產(chǎn)生單克隆抗體，或通過將抗體基因轉(zhuǎn)染入合適的細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞宿主，以允許產(chǎn)生重組抗體。在一種技術(shù)中，首先將包含多肽的免疫原注射入任何的多種哺乳動物中(例如，小鼠、大鼠、兔、綿羊或山羊)。在該步驟中，未經(jīng)修飾的本發(fā)明的多肽可以作為免疫原?？蛇x擇地，尤其是對于相對短的多肽而言，如果將多肽連接至諸如牛血清白蛋白或鑰孔蟲戚血蘭素的載體蛋白，則可以引起較強的免疫應(yīng)答。優(yōu)選按照合并了一次或多次加強免疫的預(yù)定安排將免疫原注射進(jìn)動物宿主，并定期地對動物取血。然后，例如，通過使用與適合的固相載體偶聯(lián)的多肽的親和層析從該抗血清中純化對所述多肽特異性的多克隆抗體。

例如，使用Kohler and Milstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976的技術(shù)和對其的改進(jìn)可以制備對目的多肽特異性的單克隆抗體。簡單而言，這些方法涉及制備能產(chǎn)生具有所需特異性(即，與目的多肽的反應(yīng)性)的抗體的永生化細(xì)胞系。例如，可以從如上述免疫的動物獲得的脾細(xì)胞中產(chǎn)生這類細(xì)胞系。然后，例如，通過與骨髓瘤細(xì)胞融合伴侶，優(yōu)選與和免疫的動物同基因的骨髓瘤細(xì)胞融合伴侶進(jìn)行融合而使所述脾細(xì)胞永生化?？梢杂枚喾N融合技術(shù)。例如，可以用非離子去垢劑使脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞結(jié)合幾分鐘，然后以低密度接種于支持雜交細(xì)胞生長而不支持骨髓瘤細(xì)胞生長的選擇培養(yǎng)基上。優(yōu)選的選擇技術(shù)利用HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)選擇。足夠的時間后，通常約1-2周，觀察到雜交的集落。選擇單一集落，并用它們的培養(yǎng)上清檢測與多肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。

可以從生長的雜交瘤集落的上清分離單克隆抗體。此外，可以利用各種技術(shù)提高產(chǎn)量，例如將雜交瘤細(xì)胞系注射進(jìn)諸如小鼠的合適的脊椎動物宿主的腹腔中。隨后，可以從腹水或血液中收獲單克隆抗體。通過諸如層析法、凝膠過濾法、沉淀法和提取法的常規(guī)技術(shù)可以從抗體中除去污染物。本發(fā)明的多肽可以用于例如親和層析步驟的純化過程中。

多種包含抗原結(jié)合位點的、能表現(xiàn)出抗體分子的免疫結(jié)合特性的、治療上有用的分子在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。蛋白水解酶木瓜蛋白酶優(yōu)先切割I(lǐng)gG分子，產(chǎn)生數(shù)個片段，所述片段中的2個(“F(ab)”片段)各包含共價異二聚體，所述共價異二聚體包含完整的抗原結(jié)合位點。胃蛋白酶能切割I(lǐng)gG分子，提供數(shù)個片段，所述片段包括含有兩個抗原結(jié)合位點的“F(ab')₂”片段。通過優(yōu)先蛋白水解切割I(lǐng)gM可以產(chǎn)生“Fv”片段，但是蛋白水解切割I(lǐng)gG或IgA免疫球蛋白分子很少產(chǎn)生“Fv”片段。然而，使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的重組技術(shù)更通常衍生出Fv片段。Fv片段包括非共價V_H::V_L異二聚體，該異二聚體包括保留了天然抗體分子的大部分抗原識別和結(jié)合能力的抗原結(jié)合位點。Inbar et al.(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69:2659-2662；Hochman et al.(1976)Biochem 15:2706-2710；和Ehrlich et al.(1980)Biochem 19:4091-4096。

單鏈Fv(“sFv”)多肽是從融合基因表達(dá)的共價連接的V_H::V_L異二聚體，所述融合基因包括通過肽編碼連接物連接的V_H和V_L編碼基因。Huston et al.(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85(16):5879-5883。已有多種方法描述了分辨化學(xué)結(jié)構(gòu)，用于將來自抗體V區(qū)的天然聚集的但化學(xué)分離的輕多肽鏈和重多肽鏈轉(zhuǎn)換成sFv分子，所述sFv分子會折疊成基本上相似于抗原結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)。參見，例如，Huston等的美國專利第5,091,513號和第5,132,405號；和Ladner等的美國專利第4,946,778號。

每個上述分子包括分別插在重鏈和輕鏈FR組之間的重鏈和輕鏈CDR組，所述FR組為CDR提供支持并且限定了CDR相對于彼此的空間關(guān)系。如本文所用的術(shù)語“CDR組”是指重鏈或輕鏈V區(qū)的三個高變區(qū)。從重鏈或輕鏈的N末端開始，將這些區(qū)分別表示為“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原結(jié)合位點包括6個CDR，包含來自每條重鏈和輕鏈V區(qū)的CDR組。在本文中，包含單一CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽被稱為“分子識別單元”。多個抗原抗體復(fù)合物的晶體分析已經(jīng)證實，CDR的氨基酸殘基與結(jié)合的抗原形成廣泛接觸，其中最廣泛的抗原接觸是與重鏈CDR3。因此，所述分子識別單元主要負(fù)責(zé)抗原結(jié)合位點的特異性。

如本文所用的術(shù)語“FR組”是指為重鏈或輕鏈V區(qū)的CDR組的CDR提供框架的四個側(cè)翼氨基酸序列。一些FR殘基可以接觸結(jié)合的抗原；然而，F(xiàn)R主要負(fù)責(zé)將V區(qū)折疊為抗原結(jié)合位點，尤其是直接鄰近CDR的FR殘基。在FR中，某些氨基酸殘基和某些結(jié)構(gòu)特征是高度保守的。在這點上，所有的V區(qū)序列包含約90個氨基酸殘基的內(nèi)部二硫環(huán)。當(dāng)V區(qū)折疊成結(jié)合位點時，CDR表現(xiàn)為突出的環(huán)狀基序，該環(huán)狀基序形成抗原結(jié)合表面。普遍公認(rèn)的是，F(xiàn)R的保守結(jié)構(gòu)區(qū)影響CDR環(huán)到某些“常規(guī)”結(jié)構(gòu)的折疊形狀，與具體的CDR氨基酸序列無關(guān)。而且，已知某些FR殘基參與非共價的結(jié)構(gòu)域間接觸，該結(jié)構(gòu)域間接觸使抗體重鏈和輕鏈的相互作用穩(wěn)定。

很多包含來自非人免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點的“人源化”抗體分子已有描述，包括以下嵌合抗體：具有與人恒定結(jié)構(gòu)域融合的嚙齒動物V區(qū)及其相關(guān)CDR(Winter et al.(1991)Nature 349:293-299；Lobuglio et al.(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:4220-4224；Shaw et al.(1987)J Immunol.138:4534-4538；和Brown et al.(1987)Cancer Res.47:3577-3583)，在與合適的人抗體恒定結(jié)構(gòu)域融合之前移植進(jìn)人支持FR中的嚙齒動物CDR(Riechmann et al.(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen et al.(1988)Science 239:1534-1536；和Jones et al.(1986)Nature 321:522-525)，以及由重組相嵌的(veneered)嚙齒動物FR支持的嚙齒動物CDR(歐洲專利公開第519,596號，于1992年12月23日公布)。這些“人源化”分子被設(shè)計為將對于嚙齒動物抗體分子的不希望的免疫應(yīng)答降至最低，該免疫應(yīng)答限制了那些部分在人接受體中的治療應(yīng)用的持續(xù)時間和功效。

如本文所用的“相嵌的FR”和“重組相嵌的FR”是指用人FR殘基選擇性地替換來自例如嚙齒動物重鏈或輕鏈V區(qū)的FR殘基，目的是提供包含基本上保留了所有天然FR多肽折疊結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合位點的異基因分子。相嵌技術(shù)基于下述理解，抗原結(jié)合位點的配體結(jié)合特性主要由抗原結(jié)合表面中重鏈和輕鏈CDR組的結(jié)構(gòu)和相對排布決定。Davies et al.(1990)Ann.Rev.Biochem.59:439-473。因此，只要仔細(xì)保持CDR結(jié)構(gòu)、它們彼此的相互作用和它們與其余的V區(qū)結(jié)構(gòu)域的相互作用，就可以在人源化抗體中保留抗原結(jié)合特異性。通過使用相嵌技術(shù)，用人殘基選擇性地替代了容易被免疫系統(tǒng)遇到的外部(例如，可接觸到溶劑)FR殘基，從而提供包含弱免疫原性或基本上無免疫原性相嵌表面的雜合分子。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以將本發(fā)明的單克隆抗體與一種或多種目的試劑結(jié)合。例如，可以將治療劑直接地或間接地(例如，通過連接物基團(tuán))與合適的單克隆抗體結(jié)合(例如，共價鍵合)。當(dāng)試劑和抗體中的每一個都具有能與另一個反應(yīng)的取代基時，試劑和抗體之間的直接反應(yīng)是可能的。例如，一個上的諸如氨基或巰基的親核基團(tuán)能與另一個上的諸如酸酐或酸鹵化物的含有羧基的基團(tuán)反應(yīng)或與含有良好離去基團(tuán)(例如，鹵化物)的烴基反應(yīng)。

可選擇地，通過連接物基團(tuán)將治療劑和抗體結(jié)合是可取的。連接物基團(tuán)的功能可以是間隔物來使抗體與試劑保持距離，從而避免結(jié)合能力的干擾。連接物基團(tuán)也可以增加試劑或抗體上的取代基的化學(xué)反應(yīng)性，并因此增強結(jié)合效率?；瘜W(xué)反應(yīng)性的增強也可以促進(jìn)試劑、或試劑上的官能團(tuán)的效用，否則將無法實現(xiàn)這點。

對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，包括同功能的和異功能的在內(nèi)的多種雙功能或多功能試劑(例如描述于Pierce Chemical Co.,Rockford,IL目錄中的那些)可以用作連接物基團(tuán)。例如，可以通過氨基、羧基、巰基或氧化的碳水化合物殘基而實現(xiàn)結(jié)合。有多個參考文獻(xiàn)描述了這類方法，例如，Rodwell等的美國專利第4,671,958號。

如果當(dāng)治療劑脫離本發(fā)明免疫綴合物的抗體部分時，其更有效，則可能需要使用在細(xì)胞內(nèi)化過程中或細(xì)胞內(nèi)化時可切割的連接物基團(tuán)。多種不同的可切割的連接物基團(tuán)已有描述。試劑從這些連接物基團(tuán)的細(xì)胞內(nèi)釋放機(jī)制包括通過以下的切割：二硫鍵的還原(例如，Spitler的美國專利第4,489,710號)、光不穩(wěn)定的鍵的照射(例如，Senter等的美國專利第4,625,014號)、衍生氨基酸側(cè)鏈的水解(例如，Kohn等的美國專利第4,638,045號)、血清補體介導(dǎo)的水解(例如，Rodwell等的美國專利第4,671,958號)、和酸催化的水解(例如，Blattler等的美國專利第4,569,789號)。

將多于一種的試劑與抗體結(jié)合是可取的。在一個實施方案中，多個試劑分子與一個抗體分子結(jié)合。在另一個實施方案中，可以將多于一種的試劑與一個抗體結(jié)合。不考慮特定實施方案，可以用很多方法制備具有多于一種的試劑的免疫綴合物。例如，可以將多于一種的試劑直接與抗體分子結(jié)合，或可以使用提供多個連接位點的連接物。

在本發(fā)明的其他方面，本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑/結(jié)合劑可以包含一個或多個對GlyRS多核苷酸特異性的干擾RNA(RNAi)序列?？梢詫⑹褂酶蓴_RNAi分子的RNA干擾方法用來擾亂諸如GlyRS基因或剪接變體的所需目的基因或多核苷酸的表達(dá)，從而實現(xiàn)所需的細(xì)胞和/或治療效應(yīng)。

在具體的實施方案中，干擾RNA是小干擾RNA(siRNA)。SiRNA是長度通常為19-30個核苷酸的RNA雙螺旋，其與被稱為RNAi誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的胞質(zhì)多蛋白復(fù)合物相關(guān)聯(lián)。裝載了siRNA的RISC介導(dǎo)同源mRNA轉(zhuǎn)錄物的降解。因此，siRNA能被設(shè)計為高特異性地敲除蛋白表達(dá)。盡管最初描述的RNAi分子是包含RNA有義鏈和RNA反義鏈的RNA:RNA雜合體，但目前已經(jīng)證實，DNA有義:RNA反義雜合體、RNA有義:DNA反義雜合體和DNA:DNA雜合體能介導(dǎo)RNAi(Lamberton,J.S.and Christian,AT.,(2003)Molecular Biotechnology(分子生物技術(shù))24:111-119)。因此，本發(fā)明包括使用含有任何這些不同類型雙鏈分子的RNAi分子。此外，應(yīng)當(dāng)理解，可以以多種形式使用RNAi分子并將其引入細(xì)胞。因此，如本文所用的RNAi分子包括能誘導(dǎo)細(xì)胞中RNAi反應(yīng)的任何分子和所有分子，包括但不限于，包含兩條分別的鏈(即有義鏈和反義鏈)的雙鏈多核苷酸，例如，小干擾RNA(siRNA)；包含形成雙鏈區(qū)的互補序列發(fā)夾環(huán)的多核苷酸，例如，小發(fā)夾RNA(shRNA)分子和表達(dá)一種或多種能單獨形成雙鏈多核苷酸或與另一個多核苷酸聯(lián)合形成雙鏈多核苷酸的多核苷酸的表達(dá)載體。

按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，能容易地制備特異性靶向于GlyRS多核苷酸的RNAi分子。已經(jīng)鑒定出有效siRNA分子的結(jié)構(gòu)特性。Elshabir,S.M.et al.(2001)Nature 411:494-498和Elshabir,S.M.et al.(2001),EMBO 20:6877-6888。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，多種不同的siRNA分子可以用來靶向于特定基因或轉(zhuǎn)錄物。在某些實施方案中，本發(fā)明的siRNA分子通常是雙鏈的并且長度為16-30或18-25個核苷酸，所述長度包括之間的每個整數(shù)。在一個實施方案中，siRNA長度約21個核苷酸。在某些實施方案中，siRNA具有0-7個核苷酸的3'懸突(overhang)或0-4個核苷酸的5'懸突。在一個實施方案中，siRNA分子具有2個核苷酸的3'懸突。在一個實施方案中，siRNA長度為21個核苷酸，具有2個核苷酸的3'懸突(即，它們在有義鏈和反義鏈之間包含19個核苷酸的互補區(qū))。在某些實施方案中，所述懸突是UU或dTdT 3'懸突。

在一個實施方案中，通過掃描靶mRNA轉(zhuǎn)錄物序列出現(xiàn)的AA雙核苷酸序列來選擇siRNA靶位點。每個AA雙核苷酸序列與3'鄰近的約19個核苷酸的組合是潛在的siRNA靶位點。在一個實施方案中，siRNA靶位點優(yōu)選不位于5'和3'非翻譯區(qū)(UTR)或起始密碼子附近的區(qū)(約75個堿基內(nèi))內(nèi)，因為與調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合的蛋白可能干擾siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物的結(jié)合(Elshabir,S.et al.Nature 411:494-498(2001)；Elshabir,S.et al.EMBO J.20:6877-6888(2001))。此外，可以將潛在靶位點與合適的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，例如www.ncbi.nlm的NCBI服務(wù)器上可獲得的BLASTN 2.0.5，以及可以將潛在靶位點與和其他排除的編碼序列具有顯著同源性的潛在靶序列進(jìn)行比較。

在具體的實施方案中，干擾RNA是短發(fā)夾RNA。ShRNA包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在某些實施方案中，它們可以含有可變的莖長度，長度通常為19-29個核苷酸或之間的任何數(shù)量。在某些實施方案中，發(fā)夾含有19-21個核苷酸的莖，而在其他的實施方案中，發(fā)夾含有27-29個核苷酸的莖。在某些實施方案中，環(huán)長度大小為4-23個核苷酸，但是環(huán)的大小可以大于23個核苷酸，而不會顯著影響沉默活性。ShRNA分子可以含有錯配，例如shRNA莖的雙鏈之間的G-U錯配，而不會降低功效。事實上，在某些實施方案中，例如，將shRNA設(shè)計為在發(fā)夾莖中包括一個或數(shù)個G-U配對，從而使發(fā)夾在細(xì)菌中增殖期間穩(wěn)定。然而，與靶mRNA(反義鏈)結(jié)合的莖的部分與mRNA之間的互補性通常是需要的，并且即使是該區(qū)內(nèi)的單一堿基對錯配都可能廢除沉默。5'和3'懸突不是需要的，但它們可以存在。

在某些方面中，干擾RNA或siRNA包含一種或多種修飾，例如修飾的核苷或修飾的磷酸連接。在一個實施方案中，siRNA在雙鏈區(qū)包含至少一個修飾的核苷酸。在一些實施方案中，修飾的siRNA含有至少一個2'OMe嘌呤或嘧啶核苷酸，例如2'OMe鳥嘌呤核苷、2'OMe尿嘧啶核苷、2'OMe-腺嘌呤核苷和/或2'OMe胞嘧啶核苷酸。適用于本發(fā)明的修飾的核苷酸的實例包括但不限于，具有2'-O-甲基(2'OMe)、2'-脫氧-2'-氟代(2'F)、2'-脫氧、5-C-甲基、2'-O-(2-甲氧乙基)(MOE)、4'-S代、2'-氨基或2'-C-丙烯基基團(tuán)的核糖核苷酸。

可以存在于本發(fā)明干擾RNA中的磷酸主鏈修飾(即，產(chǎn)生修飾的核苷酸間連接)的非限制性實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、嗎啉代、酰胺化物、氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰酰胺化物(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、甲縮醛、硫甲縮醛和烷基甲硅烷基(alkylsilyl)取代(參見，例如，Hunziker et al,Nucleic Acid Analogues:Synthesis and Properties(核酸類似物：合成和特性),于Modern Synthetic Methods(現(xiàn)代合成方法)中,VCH,331-417(1995)；Mesmaeker et al,Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides(寡核苷酸的新的主鏈替換),于Carbohydrate Modifications in Antisense Research(反義研究中的碳水化合物修飾)中,ACS,24-39(1994))。這類化學(xué)修飾可以發(fā)生在siRNA的有義鏈、反義鏈或兩條鏈的5'端和3'端。

在具體的實施方案中，干擾RNA靶向于細(xì)胞中表達(dá)的特定GlyRS mRNA。因此，干擾RNA造成與干擾RNA接觸的細(xì)胞中的靶基因表達(dá)的下降。在具體的實施方案中，在足以使RNA干擾發(fā)生的條件和接觸時間下，與干擾RNA接觸的細(xì)胞表達(dá)的靶基因的量少于未與干擾RNA接觸的相同細(xì)胞類型所表達(dá)的靶基因的量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％?？梢砸缘鞍妆磉_(dá)或mRNA表達(dá)、或微RNA表達(dá)來檢測表達(dá)。用諸如Western印跡或FACS的常規(guī)方法可以容易地測定靶基因所表達(dá)的蛋白的水平。用諸如RT-PCR的常規(guī)方法可以容易地測定靶基因所表達(dá)的RNA的水平。

本發(fā)明中使用的干擾RNA包括與靶GlyRS基因的區(qū)對應(yīng)的區(qū)或互補的區(qū)。在優(yōu)選的實施方案中，該互補區(qū)是完全互補的，而在其他的實施方案中，它可以包含一個或多個錯配。在某些實施方案中，互補區(qū)長度為19-25個堿基或長度為19-21個堿基。

本發(fā)明中的調(diào)節(jié)劑/結(jié)合劑也包括例如顯性負(fù)性形式的GlyRS多肽，諸如可以與本發(fā)明的GlyRS多肽結(jié)合并且干擾或?qū)挂环N或多種本發(fā)明的GlyRS多肽的非常規(guī)活性的突變體和/或截短的GlyRS多肽。

制劑和給藥

通常將本發(fā)明的組合物(例如，多肽、多核苷酸、抗體等)配制于藥學(xué)可接受的或生理可接受的溶液中，用于單獨給予細(xì)胞、組織或動物或與一種或多種其他治療形式聯(lián)合給予細(xì)胞、組織或動物。還應(yīng)當(dāng)理解，如果需要，本發(fā)明的組合物也可以與其他試劑聯(lián)合給藥，例如，其他的蛋白或多肽或各種藥物活性劑。對所述組合物中還包括的其他組分幾乎沒有限制，只要其他試劑對本發(fā)明的GlyRS多肽的特性沒有不利影響。

在本發(fā)明的藥物組合物中，藥學(xué)可接受的賦形劑和載體溶液的配制是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，在多個治療方案中使用本文所描述的具體組合物的合適的劑量和治療方案的開發(fā)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，包括例如，口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、顱內(nèi)以及肌肉內(nèi)給藥和制劑。

在某些應(yīng)用中，可以將本文所公開的藥物組合物通過口服給藥遞送至個體。因此，可以將這些組合物與惰性稀釋液或與可吸收可食用的載體一起配制、或可以將它們封裝于硬殼或軟殼的明膠膠囊中、或可以將它們壓成片劑、或可以將它們直接合并到飲食食物中。

在某些情況下，例如按照美國專利第5,543,158號；美國專利第5,641,515號和美國專利第5,399,363號(通過引用將以上每個的全部特別并入本文)所述，將本文所公開的藥物組合物胃腸外遞送、靜脈內(nèi)遞送、肌肉內(nèi)遞送、或甚至是腹膜內(nèi)遞送是可取的?？梢栽谶m當(dāng)混合了諸如羥丙纖維素的表面活性劑水中制備作為游離堿或藥學(xué)可接受的鹽的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇及其混合物中和在油中制備分散液。在通常的保存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物生長。

適于注射使用的藥物形式包括無菌水性溶液或分散液和用于無菌可注射溶液或分散液的臨時制備無菌粉末(美國專利第5,466,468號，通過引用將其全部特別并入本文)。在任何情況下，所述形式應(yīng)該是無菌的，并且流動性應(yīng)達(dá)到易于注射的程度。在制備和保存的條件下，它應(yīng)該是穩(wěn)定的，并且應(yīng)該針對諸如細(xì)菌和真菌的微生物的污染作用而進(jìn)行防腐。所述載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)、以上合適的混合物和/或植物油的溶劑或分散介質(zhì)。通過以下可以保持合適的流動性：例如，使用諸如卵磷脂的包被、對于分散液保持所需的顆粒大小和使用表面活性劑。各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑可以促進(jìn)預(yù)防微生物作用，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等。在多數(shù)情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉。通過在組合物中使用諸如單硬脂酸鋁和明膠的延遲吸收的試劑可以實現(xiàn)注射組合物的延長吸收。

對于水性溶液的胃腸外給藥，例如，如果需要，應(yīng)當(dāng)使溶液適當(dāng)緩沖，并且首先用足夠的鹽溶液或葡萄糖使液體稀釋劑成為等滲的。這些特定的水性溶液尤其適于靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥和腹膜內(nèi)給藥。在該方面，根據(jù)本公開，可以利用的無菌水性介質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可將1個劑量溶于1ml等滲NaCl溶液中，并且或者加至1000ml的皮下注射液或者在計劃的輸注部位進(jìn)行注射(參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明頓制藥科學(xué)),第15版,pp.1035-1038and 1570-1580)。根據(jù)待治療個體的疾病狀況，劑量必然會發(fā)生某些變化。在任何情況下，負(fù)責(zé)給藥的人應(yīng)當(dāng)確定對于單獨個體的合適劑量。此外，對于人類給藥而言，制劑應(yīng)該滿足FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)部門所要求的無菌性、致熱原性以及常規(guī)安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。

可以通過以下制備無菌的可注射溶液：將合適的溶劑中的所需量的活性化合物與上面列舉的各種其他成分合并，如果需要，隨后進(jìn)行過濾滅菌。通常，通過將各種滅菌的活性成分合并入無菌媒介中來制備分散液，所述無菌媒介含有基本的分散介質(zhì)和來自那些上文列舉的所需的其他成分。對于用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，這些技術(shù)可以從事先的無菌過濾溶液產(chǎn)生活性成分外加任何其他所需成分的粉末。

可以將本文所公開的組合物配制為中性形式或鹽形式。藥學(xué)可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白的自由氨基基團(tuán)形成的)，并且所述酸加成鹽可以與諸如鹽酸或磷酸的無機(jī)酸形成或與諸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有機(jī)酸形成。與自由羧基基團(tuán)形成的鹽也可以來源于諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵的無機(jī)堿和諸如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等的有機(jī)堿。通過配制后，按照與劑型相容的方式和治療有效量給予溶液。可以以多種劑型容易地給予制劑，例如可注射溶液、藥物釋放膠囊等。

如本文所用的“載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、媒介、包被、稀釋劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖液、載體溶液、懸浮液、膠體等。用于藥學(xué)活性物質(zhì)的這些介質(zhì)和試劑的用途在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性成分不相容，否則考慮在治療組合物中使用它。補充的活性成分也能合并入組合物中。

短語“藥學(xué)可接受的”是指這樣的分子實體和組合物，當(dāng)將其給予人時，不會產(chǎn)生過敏性或相似的不良反應(yīng)。含有作為活性成分的蛋白的水性組合物的制劑在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。通常，將這類組合物制備成或為液體溶液或為懸浮液的注射液；還可以制備成在注射前適于溶解或懸浮于液體中的固體形式。也可以將制劑乳化。

在某些實施方案中，可以通過鼻內(nèi)噴霧、吸入和/或其他氣溶膠遞送媒介遞送藥物組合物。通過鼻內(nèi)氣溶膠噴霧將基因、多核苷酸和肽組合物直接遞送至肺的方法已有描述，例如，美國專利第5,756,353號和美國專利第5,804,212號(通過引用將每一篇的全部特別并入本文)。同樣，使用鼻內(nèi)微粒樹脂(Takenaga et al.,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美國專利第5,725,871號，通過引用將其全部特別并入本文)的藥物遞送在制藥行業(yè)內(nèi)也是公知的。同樣，聚四氟乙烯支持基質(zhì)的形式的跨粘膜的藥物遞送描述于美國專利第5,780,045號(通過引用將其全部特別并入本文)。

在某些實施方案中，可以通過使用脂質(zhì)體、納米膠囊、微顆粒、微球、脂質(zhì)顆粒、囊泡等進(jìn)行遞送，用于將本發(fā)明組合物引入合適的宿主細(xì)胞中。特別是，可以配制本發(fā)明組合物用于封裝在脂質(zhì)顆粒、脂質(zhì)體、囊泡、納米球、納米顆粒等中的遞送?？梢杂靡阎暮统Ｒ?guī)的技術(shù)進(jìn)行這類遞送媒介的配制和使用。

包含本發(fā)明組合物的試劑盒

在其他方面，本發(fā)明提供了包含一個或多個容器的試劑盒，所述容器填充了如本文所述的本發(fā)明的一種或多種多肽、多核苷酸、抗體、多單元復(fù)合物、以上的組合物等。所述試劑盒包括如何使用這些組合物的書面說明(例如，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管生成、癌癥、炎性條件等)。

本文的試劑盒還可以包括一種或多種其他的治療劑或待治療的適應(yīng)癥所適用的或所需要的其他組分。如果需要，其他的治療劑可以容納在第二容器中。其他治療劑的實例包括但不限于，抗腫瘤劑、抗炎劑、抗細(xì)菌劑、抗病毒劑、血管生成劑等。

本文的試劑盒還可以包括一種或多種注射器或?qū)嵤┯媱澾f送方式所必需或所需要的其他組分(例如，支架、可植入的貯庫等)。

使用方法

另一方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明組合物(例如，多核苷酸、多肽等)、或這些組合物的結(jié)合劑或其他調(diào)節(jié)劑(例如，抗體、干擾RNA、反義RNA、顯性負(fù)性多肽、小分子調(diào)節(jié)劑等)治療細(xì)胞、組織或個體，從而實現(xiàn)所需的細(xì)胞和/或治療效應(yīng)的方法。本發(fā)明可以調(diào)節(jié)的細(xì)胞或組織優(yōu)選為哺乳動物細(xì)胞或組織，或更優(yōu)選為人細(xì)胞或組織。這些細(xì)胞或組織可以是健康狀態(tài)或疾病狀態(tài)的細(xì)胞或組織。

在某些實施方案中，例如，提供了通過將本文所述的GlyRS組合物與細(xì)胞接觸來調(diào)節(jié)治療相關(guān)的細(xì)胞活性的方法。這些細(xì)胞活性可以包括但不限于，細(xì)胞代謝、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、細(xì)胞運動、細(xì)胞遷移、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌的調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯、細(xì)胞阻抑等。在更具體的實施方案中，按照本發(fā)明，待調(diào)節(jié)的細(xì)胞活性包括，例如，Akt介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、Erk1/2介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、GPCR介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)皮細(xì)胞成管和細(xì)胞結(jié)合。在其他具體的實施方案中，細(xì)胞活性包括，例如，CD71和/或CD80的調(diào)節(jié)。在其他具體的實施方案中，細(xì)胞活性包括，例如，細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或釋放的調(diào)節(jié)，其中所述細(xì)胞因子選自TNF-α、IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MIP1-α、MIP-1β、GRO-α、MCP-1和IL-1ra。在其他具體的實施方案中，細(xì)胞活性包括，例如，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的葡萄糖、胰高血糖素、丙三醇和/或游離脂肪酸的代謝調(diào)節(jié)。在其他具體的實施方案中，細(xì)胞活性包括，例如，神經(jīng)形成或神經(jīng)保護(hù)的調(diào)節(jié)。因此，GlyRS組合物可以用來治療基本上任何可以獲益于一種或多種這些活性的調(diào)節(jié)的細(xì)胞或組織或個體。

GlyRS組合物還可以用于多種治療環(huán)境中的任何一種，包括例如，腫瘤疾病、免疫系統(tǒng)疾病(例如，自身免疫性疾病和炎癥)、感染性疾病、代謝疾病、神經(jīng)元/神經(jīng)病學(xué)疾病、肌肉/心血管疾病、異常造血作用相關(guān)的疾病、異常血管生成相關(guān)的疾病、異常細(xì)胞存活相關(guān)的疾病等的治療或預(yù)防相關(guān)的那些治療環(huán)境。

例如，在某些示例性實施方案中，本發(fā)明的GlyRS組合物可以用于調(diào)節(jié)血管生成，例如，通過內(nèi)皮細(xì)胞增殖和/或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)?？梢允褂煤线m的細(xì)胞系(例如，人微脈管內(nèi)皮肺細(xì)胞(HMVEC-L)和人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC))和使用合適的測定(例如，內(nèi)皮細(xì)胞遷移測定、內(nèi)皮細(xì)胞增殖測定、成管測定、基質(zhì)膠塞測定等)來監(jiān)測內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和/或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述測定中的多數(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且是可以獲得的。

因此，在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明的組合物可以用來治療基本上任何可以獲益于血管生成調(diào)節(jié)的細(xì)胞或組織或個體。例如，在一些實施方案中，可以將經(jīng)歷或易感于血管生成的細(xì)胞或組織或個體(例如，血管生成疾病狀態(tài))與本發(fā)明合適的組合物接觸，從而抑制血管生成疾病狀態(tài)。在其他的實施方案中，可以將經(jīng)歷或易感于不足的血管生成的細(xì)胞或組織(例如，血管生成抑制的疾病狀態(tài))與本發(fā)明合適的組合物接觸，從而干擾血管生成抑制活性和/或促進(jìn)血管生成。

血管生成疾病狀態(tài)的示例性實例包括但不限于，年齡相關(guān)的黃斑部退變(AMD)、癌癥(實體的和血液學(xué)的)、發(fā)育異常(器官發(fā)生)、糖尿病致盲、子宮內(nèi)膜異位、眼部新血管生成、銀屑病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和皮膚變色(例如，血管瘤、鮮紅斑痣或單純痣)。抗血管生成疾病狀態(tài)的實例包括但不限于，心血管疾病、再狹窄、缺血性組織或心力衰竭再灌注后的組織損傷、慢性炎癥和傷口愈合。

本發(fā)明的組合物還可以用作免疫調(diào)節(jié)劑，用于通過調(diào)節(jié)直接或間接介導(dǎo)自身免疫性和/或炎癥疾病、疾病狀態(tài)和病癥的細(xì)胞來治療抗炎癥或促炎癥的適應(yīng)癥?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知和可獲得的任何技術(shù)來監(jiān)測本發(fā)明組合物作為免疫調(diào)節(jié)劑的功效，所述技術(shù)包括例如，遷移測定(例如，使用白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞)或細(xì)胞活力測定(例如，使用B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞或NK細(xì)胞)。

可以按照本發(fā)明治療的示例性免疫系統(tǒng)疾病、病癥或疾病狀態(tài)包括但不限于，原發(fā)性免疫缺陷、免疫介導(dǎo)的血小板減少癥、川崎綜合征、骨髓移植(例如，成年人或兒童的新近骨髓移植)、慢性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞性白血病、HIV感染(例如，成年人或兒童的HIV感染)、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病、輸血后紫癜等。

此外，其他的疾病、病癥和疾病狀態(tài)包括格林巴利綜合征、貧血癥(例如，細(xì)小病毒B19相關(guān)的貧血癥、具有高感染風(fēng)險的患有穩(wěn)定多發(fā)性骨髓瘤的患者(例如，復(fù)發(fā)性感染)、自身免疫性溶血性貧血(例如，溫型自身免疫性溶血性貧血)、血小板減少癥(例如，新生兒血小板減少癥)和免疫介導(dǎo)的嗜中性白細(xì)胞減少癥、移植(例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)陽性器官的CMV陰性接受體)、低丙球蛋白血癥(例如，具有感染或發(fā)病風(fēng)險因素的低丙球蛋白血癥新生兒)、癲癇(例如，難治性癲癇)、系統(tǒng)性血管炎綜合征、重癥肌無力(例如，重癥肌無力的代償失調(diào))、皮肌炎和多肌炎。

其他的自身免疫性疾病、病癥和疾病狀態(tài)包括但不限于，自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性新生兒血小板減少癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性血細(xì)胞減少、溶血性貧血、抗磷脂綜合征、皮炎、變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎、心肌炎、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、風(fēng)濕性心臟病、腎小球性腎炎(例如，IgA腎病)、多發(fā)性硬化、神經(jīng)炎、葡萄膜炎性眼炎、多內(nèi)分泌腺病、紫癜(例如，過敏性紫癜(Henloch-Scoenlein purpura))、萊特爾氏病、僵人綜合征、自身免疫性肺部炎癥、吉蘭-巴雷綜合征、胰島素依賴性糖尿病和自身免疫炎性眼病。

其他的自身免疫性疾病、病癥和疾病狀態(tài)包括但不限于，自身免疫性甲狀腺炎；甲狀腺機(jī)能減退，包括橋本氏甲狀腺炎和特征例如為細(xì)胞介導(dǎo)和體液甲狀腺細(xì)胞毒性的甲狀腺炎；SLE(其特征通常為例如循環(huán)和局部產(chǎn)生的免疫復(fù)合物)；庫德帕斯徹氏綜合征(其特征通常為例如抗基底膜抗體)；天皰瘡(其特征通常為例如表皮棘層松解抗體)；受體自身免疫，例如，葛瑞夫茲氏病(其特征通常為例如促甲狀腺激素受體抗體)、重癥肌無力(其特征通常為例如乙酰膽堿受體抗體)；胰島素抗性(其特征通常為例如胰島素受體抗體)；自身免疫性溶血性貧血(其特征通常為例如抗體致敏的紅細(xì)胞的吞噬作用)；和自身免疫性血小板減少性紫癜(其特征通常為例如抗體致敏的血小板的吞噬作用)。

其他的自身免疫性疾病、病癥和疾病狀態(tài)包括但不限于，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(其特征通常為例如關(guān)節(jié)中的免疫復(fù)合物)；伴隨抗膠原蛋白抗體的硬皮病(其特征通常為例如核仁和其他的核抗體)；混合性結(jié)締組織病(其特征通常為例如諸如核糖核蛋白的可提取性核抗原的抗體)；多炎癥/皮肌炎(其特征通常為例如非組蛋白抗核抗體)；惡性貧血(其特征通常為例如抗壁細(xì)胞、抗微粒體和抗內(nèi)因子抗體)；特發(fā)性阿狄森病(其特征通常為例如體液和細(xì)胞介導(dǎo)的腎上腺細(xì)胞毒性)；不育癥(其特征通常為例如antispennatozoal抗體)；腎小球性腎炎(其特征通常為例如小球基底膜抗體或免疫復(fù)合物)；原發(fā)性腎小球性腎炎、IgA腎??；大皰性類天皰瘡(其特征通常為例如基底膜中的IgG和補體)；舍格倫綜合征(其特征通常為例如多組織抗體和/或特異性非組蛋白抗核抗體(SS-B))；糖尿病(其特征通常為例如細(xì)胞介導(dǎo)的和體液胰島細(xì)胞抗體)；和腎上腺素抗藥性，包括伴有哮喘或囊性纖維化的腎上腺素抗藥性(其特征通常為例如β腎上腺素受體抗體)。

其他的自身免疫性疾病、病癥和疾病狀態(tài)包括但不限于，慢性活動型肝炎(其特征通常為例如平滑肌抗體)；原發(fā)性膽汁性肝硬化(其特征通常為例如抗線粒體抗體)；其他的內(nèi)分泌腺衰竭(其特征通常為例如部分病例中的特異性組織抗體)；白癜風(fēng)(其特征通常為例如抗黑色素細(xì)胞抗體)；脈管炎(其特征通常為例如血管壁中的免疫球蛋白和補體和/或低血清補體)；心肌梗塞后疾病狀態(tài)(其特征通常為例如抗心肌抗體)；心切開術(shù)綜合征(其特征通常為例如抗心肌抗體)；風(fēng)疹(其特征通常為例如對IgE的IgG和IgM抗體)；特應(yīng)性皮炎(其特征通常為例如抗IgE的IgG和IgM抗體)；哮喘(其特征通常為例如對IgE的IgG和IgM抗體)；炎性肌病；和其他炎性病癥、肉芽腫性病癥、退行性病癥和萎縮性病癥。

在其他的實施方案中，本發(fā)明的GlyRS組合物可以用于調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和/或存活，并且因此，用于治療或預(yù)防特征為細(xì)胞增殖和/或存活異常的疾病、病癥或疾病狀態(tài)。例如，在某些實施方案中，GlyRS組合物可以用于調(diào)節(jié)凋亡和/或治療異常凋亡相關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)。凋亡是用于描述被稱為程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的術(shù)語。對于誘導(dǎo)凋亡的分子(例如癌癥)，以及抑制凋亡的分子(例如中風(fēng)、心肌梗塞、膿毒癥等)存在各種治療指征?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的和可獲得的任何技術(shù)監(jiān)測凋亡，包括例如，檢測DNA斷裂、膜不對稱性改變、凋亡半胱天冬酶活化和/或細(xì)胞色素C和AIF釋放的分析。

增加的細(xì)胞存活或抑制凋亡相關(guān)的示例性疾病包括但不限于，癌癥(諸如濾泡性淋巴瘤、癌和激素依賴性腫瘤，包括但不限于結(jié)腸癌、心臟腫瘤、胰腺癌、黑素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、腸癌、睪丸癌、胃癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黏液瘤、肌瘤、淋巴瘤、內(nèi)皮瘤、成骨細(xì)胞瘤、破骨細(xì)胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波濟(jì)氏肉瘤和卵巢癌)；自身免疫性病癥(諸如，多發(fā)性硬化、舍格倫綜合征、葛瑞夫茲氏病、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性糖尿病、膽汁性肝硬化、貝切特氏病、克羅恩氏病、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫相關(guān)的腎小球性腎炎、自身免疫性胃炎、自身免疫性血小板減少性紫癜和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，病毒感染(諸如皰疹病毒、痘病毒和腺病毒)、炎癥、移植物抗宿主病(急性和/或慢性)、急性移植排斥和慢性移植排斥。

增加的細(xì)胞存活相關(guān)的示例性疾病或疾病狀態(tài)包括但不限于，惡性腫瘤和相關(guān)病癥的發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移，諸如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴細(xì)胞性白血??；包括成髓細(xì)胞性白血病、早幼粒細(xì)胞性白血病、骨髓單核細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞性白血病和紅白血病在內(nèi)的急性髓細(xì)胞性白血病)和慢性白血病(例如，慢性髓細(xì)胞性(粒細(xì)胞性)白血病和慢性淋巴細(xì)胞性白血病))、骨髓增生異常綜合征、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤(例如，何杰金氏病和非何杰金氏病)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦氏巨球蛋白血癥、重鏈病、和實體腫瘤，所述實體腫瘤包括但不限于，肉瘤和癌，例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺瘤、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、威姆氏瘤、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。

增加的凋亡相關(guān)的示例性疾病包括但不限于，AIDS(諸如HIV誘導(dǎo)的腎病和HIV腦炎)、神經(jīng)退行性病癥(諸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)束硬化癥、色素性視網(wǎng)膜炎、小腦退變和腦瘤或與之前相關(guān)疾病)，自身免疫性病癥(例如多發(fā)性硬化、舍格倫綜合征、葛瑞夫茲氏病、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性糖尿病、膽汁性肝硬化、貝切特氏病、克羅恩氏病、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、免疫相關(guān)的腎小球性腎炎、自身免疫性胃炎、血小板減少性紫癜、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、骨髓增生異常綜合征(例如再生障礙性貧血)、移植物抗宿主病(急性和/或慢性)、缺血性損傷(諸如由心肌梗塞、中風(fēng)和再灌注性損傷引起的損傷)、肝損傷或疾病(例如，肝炎相關(guān)的肝損傷、肝硬化、缺血/再灌注性損傷、膽汁淤積癥(膽管損傷)和肝癌)、毒素誘導(dǎo)的肝疾病(諸如由酒精引起)、膿毒性休克、潰瘍性結(jié)腸炎、惡病質(zhì)和厭食癥。

在其他的實施方案中，本發(fā)明組合物可以用于神經(jīng)元/神經(jīng)病學(xué)疾病或病癥的治療中，其示例性實例包括，帕金森氏癥、阿耳茨海默氏病、皮克氏病、克羅伊茨費爾特雅各布氏病、亨廷頓氏舞蹈病、交叉性肢體癱瘓、肌萎縮性側(cè)束硬化癥、共濟(jì)失調(diào)、大腦性癱瘓、慢性疲勞綜合癥、慢性疼痛綜合癥、先天性神經(jīng)異常、腦神經(jīng)疾病、譫妄、癡呆、脫髓鞘病、家族性自主神經(jīng)異常、癲癇、頭痛、亨廷頓氏舞蹈病、腦積水、腦膜炎、運動障礙、肌病、神經(jīng)系統(tǒng)瘤、神經(jīng)皮膚綜合征、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)毒性綜合癥、眼球運動障礙、周圍神經(jīng)系統(tǒng)病癥、垂體病癥、腦穿通畸形、瑞特綜合征、睡眠障礙、脊髓病癥、中風(fēng)、西登哈姆氏舞蹈病、圖雷特綜合癥、神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷和損傷等。

此外，其他的實施方案涉及使用本發(fā)明組合物治療代謝性病癥，所述代謝性病癥例如糖尿病、肥胖癥、膽固醇水平調(diào)節(jié)、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、克利伯病(球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良)、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、亞歷山大病、Canavan氏病(海綿樣腦白質(zhì)營養(yǎng)不良)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、科凱恩綜合征、賀勒氏疾病、勒韋氏綜合征、利氏病、威爾遜氏病、哈勒沃登-施帕茨病、泰-薩克斯病等?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的和可獲得的任何技術(shù)來監(jiān)測本發(fā)明組合物在調(diào)節(jié)代謝過程中的功效，包括例如，檢測脂肪細(xì)胞脂肪生成或脂肪細(xì)胞脂解的測定。

在本發(fā)明更具體的實施方案中，本發(fā)明的GlyRS組合物用來調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。GPCR受體家族由基于與該受體偶聯(lián)的G蛋白的三個主要組構(gòu)成(Gs、Gi和Gq)。Gs組與環(huán)AMP(cAMP)的腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生的活化偶聯(lián)，Gi組與cAMP的腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生的抑制偶聯(lián)。因此，監(jiān)測用本發(fā)明GlyRS組合物處理的細(xì)胞中cAMP的積累的分析可以用來監(jiān)測G蛋白受體的2個主要組的活化。

在其他具體的實施方案中，本發(fā)明的GlyRS組合物可以用來調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，通過激酶途徑(例如，Akt、Erk1/2等)。可以用任何已知的分析監(jiān)測細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，可以通過多種靶蛋白的改變的磷酸化模式來監(jiān)測總體細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的發(fā)生。因此，響應(yīng)于細(xì)胞的GlyRS片段處理的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的檢測可以作為不同生物效應(yīng)的指示。可以這樣選擇用于該分析的靶蛋白，使其包括主要細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的關(guān)鍵組分，從而提供細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)情況及其治療相關(guān)性的廣泛描述。通常，這類分析涉及用GlyRS多肽處理細(xì)胞，隨后是使用特異性檢測靶蛋白的磷酸化(活化)形式的抗體的免疫檢測。

用來監(jiān)測治療相關(guān)性細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的示例性靶蛋白可以包括但不限于：p38MAPK(促分裂原活化蛋白激酶，其由細(xì)胞應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子激活，參與細(xì)胞分化和凋亡)；SAPK/JNK(應(yīng)激激活的蛋白激酶/Jun氨基末端激酶，其由細(xì)胞應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子激活)；Erk1/2、p44/42MAPK(促分裂原活化蛋白激酶Erk1和Erk2，其由廣泛的細(xì)胞外信號激活，參與細(xì)胞生長和分化的調(diào)節(jié))；和Akt(由胰島素和各種生長或存活因子激活，參與凋亡的抑制、糖原合成調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞生長)。也可以監(jiān)測酪氨酸殘基的總體磷酸化，作為磷酸化介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改變的一般指示。

當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，也可以分析諸如細(xì)胞粘附分子(例如，鈣粘蛋白、整聯(lián)蛋白、閉合蛋白、連環(huán)蛋白、選擇蛋白等)和/或離子通道蛋白的其他蛋白種類，用于監(jiān)測本發(fā)明組合物調(diào)節(jié)的細(xì)胞事件或活性。

通過引用將本說明書所引用的所有出版物和專利申請并入本文，如同特別和單獨指出通過引用并入每一個單獨的出版物或?qū)＠暾垺?/p>

盡管出于清楚理解的目的，以說明和舉例的方式詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的是，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，在不脫離附加的權(quán)利要求的實質(zhì)和范圍的情況下可以進(jìn)行某些改變和修改。提供下述實施例僅為說明而并非限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易意識到，可以改變和修改多種非關(guān)鍵參數(shù)而產(chǎn)生本質(zhì)上相似的結(jié)果。

實施例

實施例1：人甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)片段的產(chǎn)生

表達(dá)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的全長重組人GlyRS，并使用鎳IMAC層析從大腸桿菌中純化所述全長重組人GlyRS。為了通過受控制的蛋白水解產(chǎn)生GlyRS片段，用167nM人嗜中性彈性蛋白酶處理所述全長蛋白30分鐘，然后通過SDS-PAGE(圖1A-D)分離片段。

實施例2：GlyRS片段激活內(nèi)皮細(xì)胞中的AKT和Gi-GPCR

通過將25ng嗜中性彈性蛋白酶添加至4μg全長重組GlyRS中并37℃下持續(xù)30分鐘來產(chǎn)生GlyRS片段庫。通過添加超過蛋白酶10倍的量的α1抗胰蛋白酶(絲氨酸蛋白酶抑制蛋白A1)來終止反應(yīng)。用50nM未切割的或用嗜中性彈性蛋白酶切割的全長GlyRS蛋白的庫來處理牛大動脈內(nèi)皮細(xì)胞(bAEC)。將細(xì)胞與GlyRS片段孵育10分鐘，收獲細(xì)胞并用抗體進(jìn)行western印跡，該抗體僅特異性識別信號分子Akt的磷酸化(活化)形式。該處理通過磷酸化作用導(dǎo)致Akt強的可重復(fù)的活化(圖2A)。由于Akt在抑制凋亡、調(diào)節(jié)糖原合成、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞生長中的作用，所以該效應(yīng)是有意義的。

還評估了通過嗜中性彈性蛋白酶切割產(chǎn)生的GlyRS片段庫激活內(nèi)皮細(xì)胞上G蛋白偶聯(lián)受體的能力。GPCR受體家族由基于與該受體偶聯(lián)的G蛋白的三個主要組構(gòu)成(Gs、Gi和Gq)。Gs組與環(huán)AMP(cAMP)的腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生的活化偶聯(lián)，Gi組與cAMP的腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生的抑制偶聯(lián)。因此，評估了響應(yīng)于GlyRS片段處理的內(nèi)皮細(xì)胞中cAMP的累積(Gs-GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo))，以及所述片段抑制福斯高林誘導(dǎo)的cAMP增加的能力(Gi-GPCR)。用25和100nM切割的GlyRS片段處理內(nèi)皮細(xì)胞后，與超出單獨PBS的用25和100nM未切割的GlyRS處理(約10％)相比，觀察到對福斯高林刺激的cAMP產(chǎn)生的抑制的顯著增加(圖2B，分別為約35％和約40％)，這表明Gi-GPCR的活化。用未切割的或切割的GlyRS處理內(nèi)皮細(xì)胞時，不存在cAMP產(chǎn)生的刺激。

實施例3：GlyRS片段激活單核細(xì)胞中的ERK1/2(p44/42MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

通過將25ng嗜中性彈性蛋白酶添加至4μg全長重組GlyRS中并于37℃下持續(xù)30分鐘來產(chǎn)生GlyRS片段庫。通過添加超過蛋白酶10倍的量的α1抗胰蛋白酶(絲氨酸蛋白酶抑制蛋白A1)來終止反應(yīng)。用50nM未切割的或用嗜中性彈性蛋白酶切割的全長GlyRS蛋白的庫處理單核細(xì)胞(THP-1)。將細(xì)胞與GlyRS片段孵育0.5、2、5、10、30和60分鐘、收獲細(xì)胞并用抗體進(jìn)行western印跡，該抗體僅特異性識別信號分子Erk1/2(促分裂原活化蛋白激酶Erk1和Erk2)的磷酸化(活化)形式。該處理通過磷酸化作用導(dǎo)致Erk1/2強的可重復(fù)的活化(圖3)，所述活化在處理2分鐘后最強。由于Erk1/2可被多種細(xì)胞外信號激活并且其在細(xì)胞生長和分化的調(diào)節(jié)中起重要作用，所以該效應(yīng)是有意義的。

實施例4：嗜中性彈性蛋白酶在GlyRS上的切割位點的鑒定

用LC/MS/MS分析通過嗜中性彈性蛋白酶切割所產(chǎn)生的片段(圖1D)以確定每個片段的準(zhǔn)確的量。此外，從SDS-PAGE凝膠切下單獨片段并進(jìn)行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化，隨后用LC/MS/MS分析，從而鑒定片段產(chǎn)生自全長蛋白的哪個部分并鑒定歸因于嗜中性彈性蛋白酶的非胰蛋白酶切割位點。

這些肽邊界的特征總結(jié)于表1；加粗的殘基是非胰蛋白酶切割位點，這表明已經(jīng)鑒定出所述片段的彈性蛋白酶的精確切割位點(從而得到精確的N末端或C末端)。

表1-GlyRS肽邊界

圖4A描述了鑒定GlyRS肽邊界的以上過程的概述。圖4B表示全長人GlyRS二聚體的晶體結(jié)構(gòu)中的GlyRS片段G6的結(jié)構(gòu)圖示，其對應(yīng)于氨基酸214-438。

實施例5：GlyRS片段G6與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合

全長GlyRS和GlyRS片段被用于bAEC細(xì)胞的結(jié)合測定中。將細(xì)胞以30,000細(xì)胞/孔分布于96孔板，過夜。第二天，棄去培養(yǎng)基并將50μl/孔的Z-Fix添加至每孔。于室溫下孵育細(xì)胞15分鐘。將孔吸干并用1×PBST洗滌1次。于室溫下，用50μl/孔的1％BSA/PBS封閉細(xì)胞1-2小時。從細(xì)胞移去封閉液并將在1％BSA/PBS中稀釋的蛋白樣品添加至孔中。樣品于室溫下孵育1小時。用1×PBST將孔洗滌1次。以50μl/孔添加以1:500稀釋于1％BSA/PBS中的抗6×His HRP(R&D#MAB050H)。于室溫下孵育抗體，持續(xù)30分鐘。用1×PBST將孔洗滌3次。用50μl/孔的1:1稀釋的TMB溶液(Thermo#34021)檢測蛋白結(jié)合。通過添加50μl/孔的2M硫酸終止該反應(yīng)并在酶標(biāo)儀上于405nm下讀吸收值。

如圖5所示，該研究的結(jié)果表明：對應(yīng)于氨基酸214-438的GlyRS片段G6與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。

實施例6

A.GlyRS片段G6遷移THP-1單核細(xì)胞并且被百日咳毒素抑制

在完全培養(yǎng)基中以6×10⁵細(xì)胞/孔培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞并將細(xì)胞與終濃度為2μg/ml的鈣黃綠素AM(1mg/ml)孵育。將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱持續(xù)30分鐘。再次洗滌細(xì)胞并將細(xì)胞以6×10⁶細(xì)胞/ml的濃度接種于培養(yǎng)皿的上室。將對照趨化因子以及片段G6(200nM)添加至下室，持續(xù)80分鐘至2小時。通過上下吹打從下室收集細(xì)胞。在酶標(biāo)儀上于Ex485/Em538讀取熒光值，530nm截留(cutoff)。

如圖6所示，本研究的結(jié)果表明：G6影響單核細(xì)胞遷移。

B.GlyRS片段G6通過選擇趨化因子受體進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

用PathHunterβ-Arrestin測定(DiscoveRx Corporation)進(jìn)行趨化因子受體篩查，該測定使用稱為互補的技術(shù)以同質(zhì)、非成像分析模式監(jiān)測GPCR的活化。該技術(shù)利用酶片段互補(EFC)測定，用β-半乳糖苷酶(β-Gal)作為功能報告蛋白。將酶分為在細(xì)胞中表達(dá)為融合蛋白的兩個互補部分。將酶接受體(Enzyme Acceptor)(EA)與β-Arrestin融合并將ProLink供體肽與目的GPCR融合。通過GPCR刺激，β-Arrestin被招募至脫敏作用的受體,將β-Gal的兩個片段帶到一起并允許互補發(fā)生。該過程產(chǎn)生活性酶，該活性酶可以轉(zhuǎn)化化學(xué)發(fā)光底物并產(chǎn)生了標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀可檢測的輸出信號。按照標(biāo)準(zhǔn)操作，在T25瓶中從凍存液擴(kuò)增PathHunter細(xì)胞系并且在測定前，將細(xì)胞系保持在選擇生長培養(yǎng)基中。一旦證實細(xì)胞健康并正常生長，用無胰蛋白酶解離緩沖液從瓶中傳代細(xì)胞并將細(xì)胞接種于白色壁透明底的384孔微板中，用于片段G6分析。為了分析，以5000細(xì)胞/孔的密度、20μl的總體積接種細(xì)胞并且在添加片段G6前，允許細(xì)胞貼壁和恢復(fù)過夜。在500nM片段G6的存在下，將細(xì)胞于37℃孵育90分鐘。以500nM的終濃度測試了15種趨化因子受體細(xì)胞系。對照孔包含1％介質(zhì)，所述介質(zhì)由50％丙三醇、2mM DTT、0.5×PBS組成。

如圖6(內(nèi)插圖)所示，該研究的結(jié)果表明GlyRS片段G6通過選擇趨化因子受體進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

實施例7：片段G6影響巨核細(xì)胞祖細(xì)胞的集落形成

該研究評估了片段G6(500nM)對人巨核細(xì)胞祖細(xì)胞增殖的影響。在補充了專有最佳濃度的細(xì)胞因子的、基于膠原蛋白的無血清培養(yǎng)基4950中評估巨核細(xì)胞的產(chǎn)克隆祖細(xì)胞(CFU-Mk)譜系。將正常人骨髓低密度細(xì)胞(Lonza貨號#07B21195)保存于-152℃，直至測定需要。在實驗當(dāng)天，將細(xì)胞于37℃快速解凍，將小瓶的內(nèi)容物稀釋于含2％胎牛血清(FBS)的10ml Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)中并且通過離心進(jìn)行洗滌(室溫，1200rpm持續(xù)10分鐘)。棄去上清，并將細(xì)胞團(tuán)重懸于已知體積的含2％FBS的IMDM中。將片段G6添加至補充了專有最佳濃度的細(xì)胞因子rhTpo、rhIL-3和rhIL-6的、基于膠原蛋白的無血清培養(yǎng)基4950的管中。還準(zhǔn)備了緩沖液對照培養(yǎng)物(不含受試蛋白，但含相同濃度的透析過的50％丙三醇/0.5×PBS/2mM DTT緩沖液)。然后，將骨髓細(xì)胞添加至每管培養(yǎng)基，終濃度為1×10⁵細(xì)胞/載玻片。然后，添加牛膠原蛋白，將管渦旋振蕩，并將內(nèi)容物一式三份分配在雙室載玻片中。將所有的培養(yǎng)物于37℃、5％CO₂下孵育10-12天。孵育后，在將載玻片脫水和固定之前，在顯微鏡下評估培養(yǎng)物的集落形成。使用抗體染色方法檢測GPIIa/IIIb(CD41)表達(dá)，用堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)對載玻片上的集落進(jìn)行染色。對集落數(shù)進(jìn)行評分和評估?；诖笮『托螒B(tài)，將集落分成下述類別：小CFU-Mk(2-20)、中等CFU-Mk(21-49)、大CFU-Mk(>50)。

圖7A表示CD41⁺集落的代表性染色。圖7B表示對小集落、中等集落和大集落的定量結(jié)果。該研究的結(jié)果表明：GlyRS片段G6影響巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞的集落形成。

實施例8：片段G6和G6-3活化單核細(xì)胞

A.GlyRS片段誘導(dǎo)單核細(xì)胞中CD71標(biāo)記上調(diào)

從正常血液供體分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。用200nM劑量的GlyRS片段G6-3(由殘基367-438組成)處理1.5×10⁶PBMC 24小時。用1μg/ml的植物凝集素植物血球凝集素(PHA)和0.1μg/ml作為陽性對照的蛋白毒素葡萄球菌腸毒素B(SEB)處理PBMC。如圖8所示，用來自Becton-Dickinson的抗CD71-FITC抗體染色并通過流式細(xì)胞儀分析后，在G6-3處理的單核細(xì)胞中可以看見CD71增殖標(biāo)記的上調(diào)。在相同樣品的門內(nèi)的淋巴細(xì)胞群體中，未觀察到CD71上調(diào)的顯著增加。

因此，我們證實：G6-3具有激活PBMC混合物中的單核細(xì)胞的細(xì)胞類型特異性能力。

B.GlyR片段誘導(dǎo)單核細(xì)胞中CD80標(biāo)記上調(diào)

從正常血液供體分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。用200nM劑量的GlyRS片段G6(由殘基214-438組成)和G6-3(367-438)處理1.5×10⁶PBMC 24小時。用1μg/ml的植物凝集素植物血球凝集素(PHA)和0.1μg/ml作為陽性對照的蛋白毒素葡萄球菌腸毒素B(SEB)處理PBMC。如圖9所示，用來自Becton-Dickinson的抗CD80-FITC抗體染色并通過流式細(xì)胞儀分析后，在G6-3處理的單核細(xì)胞中可以看見CD80活化標(biāo)記的上調(diào)。在相同樣品的門內(nèi)的淋巴細(xì)胞群體中，未觀察到CD80上調(diào)的顯著增加。

本研究的結(jié)果表明：兩個GlyRS片段G6和G6-3以細(xì)胞類型特異性的方式活化PBMC混合物中的單核細(xì)胞。

實施例9：全長GlyRS和GlyRS片段G6誘導(dǎo)PBMC的細(xì)胞因子分泌

將全長GlyRS(100nM)或GlyRS片段G6(殘基214-438)(100nM)與1×10⁶外周血單核細(xì)胞(PBMC)孵育4小時。孵育4小時后，收獲上清并將在液氮中快速冷凍。然后，通過多元細(xì)胞因子分析(MD Biosciences；St.Paul,MN)分析樣品。檢測上清的27種不同的細(xì)胞因子，并按照與緩沖液處理的PBMC上清相比的倍數(shù)改變來繪圖。誤差棒代表2次生物學(xué)重復(fù)。如圖10所示，全長GlyRS和G6片段都表現(xiàn)出高于PBS處理的細(xì)胞的對多種細(xì)胞因子的強刺激(例如，TNF-α、IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MIP1-α、MIP-1β、GRO-α、MCP-1和IL-1ra)。

該研究的結(jié)果表明：本發(fā)明的GlyRS多肽可以誘導(dǎo)治療相關(guān)的多種細(xì)胞因子的分泌。

實施例10：GlyRS片段G6和G6-3誘導(dǎo)RAW264.7小鼠白血病巨噬細(xì)胞的遷移

為了評價體外細(xì)胞遷移，用含0.5mg/ml明膠的PBS包被具有聚碳酸酯膜(5μm孔徑，Costar)的24孔Transwell小室并使其風(fēng)干。用新鮮的DMEM將分離的RAW264.7細(xì)胞(小鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞系)洗滌1次并以2×10⁷細(xì)胞/ml懸浮于0.1％BSA/DMEM中。如圖11所標(biāo)明，用0.1％BSA/DMEM將GlyRS片段稀釋為不同的濃度。將RAW細(xì)胞以2×10⁶細(xì)胞/100μl/孔置于上室中。將GlyRS片段以500μl/孔添加于下室中。37℃下遷移24小時后，將鈣黃綠素AM(Invitrogen)添加至下室作為細(xì)胞指示物，終濃度為8μM。30分鐘后，用棉簽從Transwell膜的上表面移除未遷移的細(xì)胞。在熒光顯微鏡的高倍視野下，對膜的下表面上的遷移細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

如圖11所示，該研究結(jié)果表明：G6和G6-3可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移。

實施例11：GlyRS片段G6誘導(dǎo)HL-60早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞的遷移

用0.1％BSA-RPMI將HL60細(xì)胞(人早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞系)洗滌2次。添加0.1％BSA-RPMI中的8μM鈣黃綠素AM(Invitrogen)，于37℃孵育HL60細(xì)胞3小時。再一次洗滌后，將細(xì)胞以1×10⁷細(xì)胞/ml懸于0.1％BSA-RPMI中。如圖11所標(biāo)明，用0.1％BSA-RPMI將GRS或其片段稀釋成不同濃度。將HL60細(xì)胞以1×10⁶細(xì)胞/100μl/孔置于具有聚碳酸酯膜(5μm孔徑，Costar)的Transwell可透過支持物的上室中。將GRS或片段以500μl/孔添加于下室中。37℃下遷移30分鐘后，通過在Ex485/Em538下讀取熒光值來測定下室中遷移的細(xì)胞。

如圖12所示，該研究結(jié)果表明：G6可以誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞遷移。

實施例12：全長GlyRS和片段從RAW264.7小鼠白血病巨噬細(xì)胞的分泌

A.全長GlyRS從RAW263.7細(xì)胞的內(nèi)源性分泌

RAW細(xì)胞(小鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞系)生長于6孔組織培養(yǎng)皿中，直至匯合。用PBS洗滌2次后，將細(xì)胞在單獨的無血清DMEM(2ml/瓶)中或補充了TNFα或IFN-γ的無血清DMEM中孵育48小時。收集條件培養(yǎng)基并于4℃下、以20,000×G離心30分鐘，去除細(xì)胞碎片。將上清與10％濃度的TCA沉淀20分鐘。丙酮洗滌后，將蛋白團(tuán)溶解于SDS樣品緩沖液中用于SDS-PAGE。用抗人GRS的小鼠多克隆抗體(Abnova)檢測細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)基中的GlyRS，這表明全長GlyRS從小鼠巨噬細(xì)胞的內(nèi)源性分泌(圖13)。

B.在脂多糖處理下，全長GlyRS和GlyRS片段從RAW264.7小鼠白血病巨噬細(xì)胞分泌

RAW264.7細(xì)胞(小鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞系)生長于6孔組織培養(yǎng)皿中，直至匯合。用PBS洗滌2次后，將細(xì)胞在添加了10ng/ml LPS的無血清DMEM(2ml/瓶)中孵育48小時。收集條件培養(yǎng)基并于4℃下、以20,000×G離心30分鐘，去除細(xì)胞碎片。將上清與10％濃度的TCA沉淀20分鐘。丙酮洗滌后，將蛋白團(tuán)溶解于SDS樣品緩沖液中，用于SDS-PAGE。用抗人GRS的小鼠多克隆抗體(Abnova)檢測細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)基中的GlyRS。在LPS處理下，在分泌的培養(yǎng)基中觀察到GlyRS的特異性片段，而在細(xì)胞裂解液中未觀察到，這指示了在LPS處理下這些GlyRS片段的產(chǎn)生和分泌(圖14)。

C.通過LC/MS/MS鑒定從LPS處理的小鼠巨噬細(xì)胞分泌的GlyRS片段

RAW246.7細(xì)胞(小鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞系)生長于T25瓶中，直至匯合。用上面B中列出的條件，用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞分泌GlyRS片段。收集條件培養(yǎng)基并于4℃下、以20,000×G離心30分鐘，去除細(xì)胞碎片。將上清(CM)與10％濃度的TCA沉淀20分鐘。丙酮洗滌后，將蛋白團(tuán)溶解于SDS樣品緩沖液中，用于SDS-PAGE。從SDS-PAGE凝膠切下單獨片段，并進(jìn)行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化，隨后用LC/MS/MS進(jìn)行分析，鑒定片段產(chǎn)生自全長蛋白的哪個部分(圖15)。從約40-50kDa片段鑒定出的肽位于蛋白的催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)(參見圖15、16A)并且根據(jù)理論分子量計算，表明該片段可能代表在N末端截短的蛋白，其對應(yīng)于GlyRS的氨基酸殘基約265-685。從約15kDa片段鑒定出的肽位于蛋白的C末端(圖15、16B)并且根據(jù)理論分子量計算，表明該片段可能代表蛋白的C末端部分，其對應(yīng)于GlyRS的氨基酸殘基約483-685。

應(yīng)當(dāng)注意到，上述公開是描述性的、說明性的和示例性的，不應(yīng)理解為對附加權(quán)利要求限定范圍的限制。

可以將上述各種實施方案組合以提供其他的實施方案。對于本說明書引用的和/或申請數(shù)據(jù)表列出的所有美國專利、美國專利申請公布、美國專利申請、外國專利、外國專利申請和非專利公布，通過引用將其全部內(nèi)容并入本文。如果有必要，可以修改實施方案的各個方面來利用各個專利、申請和公布的構(gòu)想以提供其他的實施方案。

根據(jù)上文的詳細(xì)描述，可以對實施方案進(jìn)行這些和其他的改變。通常，在下面的權(quán)利要求書中，所用的術(shù)語不應(yīng)當(dāng)解釋為將權(quán)利要求限制于本說明書和權(quán)利要求書所公開的具體實施方案，而應(yīng)當(dāng)解釋為包括所有可能的實施方案和這些權(quán)利要求所要求的等同物的全部范圍。因此，本權(quán)利要求不受本公開限制。