專利名稱：包含酪氨酰－絲氨酰－纈氨酸(ysv)的生物活性肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及短肽及其用途。特別是，本發(fā)明涉及具有免疫調(diào)節(jié)性能和抗癌性能的短肽。
相關(guān)領(lǐng)域的描述本領(lǐng)域已知生物活性肽可用于治療疾病和用作藥物組合物。例如，US6,191,113公開了一種對(duì)平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制活性的肽，其因此可以用于防治與平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的病理狀態(tài)，如動(dòng)脈硬化、血管成形術(shù)后的再狹窄、移植血管后的腔狹窄、及平滑肌肉瘤等。US 6,184,208公開了另一種肽，發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)一些生理過程，如上皮生長(zhǎng)帶的增重活性和頭發(fā)生長(zhǎng)。此外，PCT公開WO 03/006492和美國(guó)專利申請(qǐng)10/237,405表明某些肽以及它們的藥物組合物具有生物活性并可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。(需要說明的是，在本公開文本中引用的參考文獻(xiàn)并不一定構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)，因此對(duì)它們的引用并不等于在任何司法效力上承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)為現(xiàn)有技術(shù))。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有生物活性的短肽及其用途。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽(簡(jiǎn)稱YSV)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該三肽具有生物活性。為了進(jìn)行測(cè)試，采用肽L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸。本發(fā)明另一方面包括分離或純化的肽，所述肽包括酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸、基本上由酪氨酰-絲氨酰-纈氨組成或由酪氨酰-絲氨酰-纈氨組成。本發(fā)明又一方面還涉及基本純化的YSV肽。
本發(fā)明再一方面包括分離或純化的基本上由YSV組成的肽，所述肽具有選自以下的活性免疫響應(yīng)的調(diào)節(jié)作用、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激作用、細(xì)胞增殖紊亂的調(diào)節(jié)作用、癌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用、肝癌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用、白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用、宮頸癌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用、肺癌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用以及黑素瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明再一方面還包括含肽的藥物組合物，所述肽包含YSV肽、基本上由YSV肽組成或由YSV肽組成。本發(fā)明其他方面涉及含肽的藥物組合物，所述肽包含YSV肽的功能衍生物、基本上由YSV肽的功能衍生物組成或由YSV肽的功能衍生物組成。再有的方面包括藥物組合物，所述組合物包含L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸三肽、基本上由L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸三肽組成或由L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸三肽組成。
本發(fā)明的另一方面涉及制備藥物組合物的方法，包括提供酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽，并將所述三肽與一種藥物可接受載體混合。
本發(fā)明的另一方面涉及一種降低人疾病影響的方法，所述方法包括給予人藥學(xué)有效劑量的酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽。在本發(fā)明的另外方面，所述人疾病選自其效應(yīng)可通過刺激Y淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化而降低的病癥和細(xì)胞增殖紊亂。在本發(fā)明的其他方面，所述細(xì)胞增殖紊亂為癌癥，包括但不限于肝癌、白血病、宮頸癌、肺癌和黑素瘤。
本發(fā)明的另一方面涉及酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽作為藥物組合物的用途。此外，所述三肽可用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，也可用于治療細(xì)胞增殖紊亂。在本發(fā)明的具體方面，所述細(xì)胞增殖紊亂為癌癥。在本發(fā)明的具體方面，治療肝癌、白血病、宮頸癌、肺癌和/或黑素瘤。
本發(fā)明的另一方面涉及營(yíng)養(yǎng)組合物及其在制備營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑中的用途，所述組合物包含酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸。本發(fā)明的具體方面涉及含肽的營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，所述肽包括酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽、基本上由酪氨酰-絲氨酰-纈氨三肽組成或由酪氨酰-絲氨酰-纈氨三肽組成。
本發(fā)明另外的方面提供了YSV的增效的衍生物或其功能衍生物。所述酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽的增效的衍生物包含能夠以提高或促進(jìn)所述三肽的療效的方式與三肽連接的增效的分子。增強(qiáng)效果可為延長(zhǎng)的效果、縮短的效果、延遲發(fā)效的效果、加速發(fā)效的效果、提高強(qiáng)度的效果、降低強(qiáng)度的效果、減少副作用的效果、產(chǎn)生一種或多種作用的效果、延遲平息的效果、加速平息的效果和將所述肽定位于個(gè)體中分散的區(qū)域的作用。這種增效的分子和增效的衍生物的實(shí)例如下所述。在本發(fā)明的一些方面中，所述增效的分子可為調(diào)節(jié)(但不限于調(diào)節(jié))免疫活性和/或癌癥的生長(zhǎng)，其中所述癌包括但不限于宮頸癌、肝癌和白血病。本發(fā)明的其他方面包括增強(qiáng)肽的療效的方法，所述肽包括YSV或其衍生物、基本上由YSV或其衍生物組成或由YSV或其衍生物組成，所述方法包括將所述肽可操作地連接到增強(qiáng)所述肽的療效的分子上。在本發(fā)明的一些方面，所述方法不包括天然存在的肽中與所述YSV肽或其衍生物相鄰的肽。本發(fā)明的其他方面包括藥物組合物，所述藥物組合物包括YSV的增效的衍生物或其功能衍生物、基本上由YSV的增效的衍生物或其功能衍生物組成或由YSV的增效的衍生物或其功能衍生物組成。
本發(fā)明一方面涉及基本純化的上述YSV肽或其功能衍生物，所述YSV肽或其功能衍生物可連接到能夠增強(qiáng)其療效的分子(也稱為“增效的分子”)上。這些分子可按照美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/435,796(于2002年12月18日提交，發(fā)明名稱為“生物活性肽結(jié)合物”)中公開的任何方式制備和使用，該專利申請(qǐng)通過引用結(jié)合到本文中?？蛇B接到所述肽的候選分子以及實(shí)施這種連接的方式與本領(lǐng)域所用的常規(guī)方式相同。一些可連接到Y(jié)SV肽及其功能衍生物的分子包括但不限于有機(jī)化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、類固醇、蛋白質(zhì)、隔離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、半抗原、抗原、脂類分子、脂肪酸、膽汁酸、聚胺、蛋白酶抑制劑、硅酸鹽以及前述分子的任何組合。本發(fā)明還涉及基本純化的上述YSV肽或其功能衍生物，所述YSV肽或其功能衍生物連接到能夠增強(qiáng)其療效的分子，其中所述可連接分子不是天然存在的肽中與上述肽相鄰的肽。在本發(fā)明的另一方面，所述基本純化的YSV肽或其功能衍生物可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。所述分子可通過共價(jià)鍵或非共價(jià)作用連接到本發(fā)明的肽上。
在具體的實(shí)施方案中，當(dāng)生物活性分子與YSV或其功能衍生物連接時(shí)，可通過將部分連接分子的性能賦予所述肽而改變其藥代動(dòng)力學(xué)。連接分子可賦予肽的一些性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時(shí)間長(zhǎng)短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。
本發(fā)明另一方面涉及基本純化的肽，所述肽包括YSV或其功能衍生物、基本上由YSV或其功能衍生物組成或由YSV或其功能衍生物組成，所述YSV或其功能衍生物連接于可增強(qiáng)其療效的分子上，其中所述連接分子不是天然存在的肽中與YSV或其一種功能衍生物相鄰的肽。一些可連接到Y(jié)SV肽及其功能衍生物的分子包括但不限于有機(jī)化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、類固醇、蛋白質(zhì)、隔離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、半抗原、抗原、脂類分子、脂肪酸、膽汁酸、聚胺、蛋白酶抑制劑、硅酸鹽以及前述分子的任何組合。本發(fā)明的其他方面包括基本純化的肽，所述肽包括YSV肽或其功能衍生物、基本上由YSV肽或其功能衍生物組成或由YSV肽或其功能衍生物組成，所述YSV肽或其功能衍生物連接于可增強(qiáng)其療效的分子上，所述增效的分子可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。所述分子可通過共價(jià)鍵或非共價(jià)作用連接到本發(fā)明的肽上。所述基本純化的肽與增強(qiáng)其療效的分子的連接的作用包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時(shí)間長(zhǎng)短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。
本發(fā)明另一方面涉及包括含有YSV或其一種功能衍生物的肽與另外結(jié)合肽序列的雜化肽，其中所述結(jié)合的另外的序列不是在天然存在的肽中與上述公開的肽相鄰的序列。在具體的實(shí)施方案中，所述雜化肽可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。在具體的實(shí)施方案中，這些非天然存在肽中與YSV或其功能衍生物相鄰的另外結(jié)合肽序列可通過將部分雜化分子的性能賦予所述肽而改變本發(fā)明上述實(shí)施方案中的肽的藥代動(dòng)力學(xué)。連接分子可賦予YSV或其功能衍生物的一些性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時(shí)間長(zhǎng)短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。
本發(fā)明另一方面涉及基因載體，所述基因載體包括編碼YSV肽或其一種功能衍生物的第一核苷酸序列、基本上由所述第一核苷酸序列組成或由所述第一核苷酸序列組成，所述第一核苷酸序列在框架中與第二核苷酸序列稠合，所述第二核苷酸序列編碼增強(qiáng)上述肽的療效的肽，所述第二核苷酸序列編碼的肽不是天然存在的肽中與所述YSV肽或其一種功能衍生物相鄰的肽。本發(fā)明還涉及基因載體，所述基因載體包括編碼基本上由YSV肽或其一種功能衍生物組成的肽的第一核苷酸序列、基本上由該所述第一核苷酸序列組成或由該所述第一核苷酸序列組成，所述第一核苷酸序列在框架中與第二核苷酸序列稠合，所述第二核苷酸序列編碼增強(qiáng)上述肽的療效的肽，所述第二核苷酸序列編碼的肽不是天然存在的肽中與所述YSV肽或其一種功能衍生物相鄰的肽。本發(fā)明還涉及基因載體，所述基因載體包括編碼由YSV肽或其一種功能衍生物的氨基酸序列組成的肽的第一核苷酸序列、基本上由所述第一核苷酸序列組成或由所述第一核苷酸序列組成，所述第一核苷酸序列在框架中與第二核苷酸序列稠合，所述第二核苷酸序列編碼增強(qiáng)上述肽的療效的肽，所述肽不是天然存在的肽中與所述YSV肽或其一種功能衍生物相鄰的肽。在具體的實(shí)施方案中，所述YSV肽或其一種功能衍生物可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。連接分子可賦予所述YSV肽或其一種功能衍生物的一些性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時(shí)間長(zhǎng)短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。本發(fā)明的另一方面涉及包含選自以下列表的核苷酸序列的微生物，所述列表包括上述載體的核苷酸序列；包括編碼含所述YSV肽或其一種功能衍生物的氨基酸序列的肽的第一核苷酸序列的核苷酸序列，所述第一核苷酸序列在框架中與第二核苷酸序列稠合，所述第二核苷酸序列編碼不是天然存在的肽中與所述YSV肽或其一種功能衍生物相鄰的肽。
就上述核酸序列而言，由這些核酸序列表達(dá)的肽和/或雜化肽可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。
本發(fā)明再一方面涉及一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括提供連接在能增強(qiáng)其療效的分子上的YSV肽或其一種功能衍生物；將所述連接在所述分子上的肽與藥學(xué)上可接受的載體一起調(diào)配。本發(fā)明涉及的所述方法中，所述肽可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤?？蛇B接在所述YSV肽或其一種功能衍生物的生物有效性分子的一些實(shí)例包括但不限于有機(jī)化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、類固醇、蛋白質(zhì)、隔離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、半抗原、抗原、脂類分子、脂肪酸、膽汁酸、聚胺、蛋白酶抑制劑、硅酸鹽以及前述分子的任何組合。本發(fā)明還涉及一種制備含肽的藥物組合物的方法，其中所述肽包含所述YSV肽或其一種功能衍生物，所述方法包括將所述肽連接到增強(qiáng)所述療效的分子上，其中所述分子不是天然存在的肽中與所述YSV肽或其一種功能衍生物相鄰的肽。所述分子可通過共價(jià)鍵或非共價(jià)作用與本發(fā)明的肽連接。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述連接分子可賦予所述肽以增強(qiáng)其療效的性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時(shí)間長(zhǎng)短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。本發(fā)明還涉及一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括提供基本純化的肽，所述肽基本上由連接在能增強(qiáng)其療效的分子上的YSV肽或其一種功能衍生物的氨基酸序列組成；將所述連接在所述分子上的肽與藥學(xué)上可接受的載體一起調(diào)配。本發(fā)明還涉及一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括提供基本純化的肽，所述肽由連接在能增強(qiáng)其療效的分子上的YSV肽或其一種功能衍生物組成；將所述連接在所述分子上的肽與藥學(xué)上可接受的載體一起調(diào)配。
本發(fā)明還有一個(gè)方面是涉及一種治療人的方法，所述方法包括給予人藥學(xué)有效劑量的基本純化的包括YSV肽或其一種功能衍生物的肽，所述肽連接在能夠增強(qiáng)其療效的分子上?？蛇B接所述YSV肽或其一種功能衍生物的生物學(xué)活性分子的一些實(shí)例包括但不限于有機(jī)化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、類固醇、蛋白質(zhì)、隔離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、半抗原、抗原、脂類分子、脂肪酸、膽汁酸、聚胺、蛋白酶抑制劑、硅酸鹽以及前述分子的任何組合。在一些實(shí)施方案中，所述連接分子可賦予所述肽以增強(qiáng)其療效的性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時(shí)間長(zhǎng)短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。
在具體的實(shí)施方案中，上述用于治療人的肽可用于調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。
本發(fā)明其他方面包括藥物組合物，所述藥物組合物包括連接于能增強(qiáng)其療效的分子上的YSV肽或其功能衍生物以及藥學(xué)上可接受的載體、基本上由所述YSV肽或其功能衍生物以及藥學(xué)上可接受的載體組成或由所述YSV肽或其功能衍生物以及藥學(xué)上可接受的載體組成。本發(fā)明還涉及所述增強(qiáng)的YSV肽或其衍生物，其中所述肽可調(diào)節(jié)但不限于調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥，其中所述癌癥包括但不限于宮頸癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤?？蛇B接所述YSV肽或其一種功能衍生物學(xué)活性分子的一些實(shí)例包括但不限于有機(jī)化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、類固醇、蛋白質(zhì)、隔離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、半抗原、抗原、脂類分子、脂肪酸、膽汁酸、聚胺、蛋白酶抑制劑、硅酸鹽以及前述分子的任何組合。在一些實(shí)施方案中，所述連接分子可賦予所述肽以增強(qiáng)其療效的性能包括但不限于將肽傳遞到體內(nèi)分散的區(qū)域；將肽的活性集中于體內(nèi)所需的位置，而降低其在其他位置的作用；減少用肽治療的副作用；改變肽的滲透性；改變肽傳遞給身體的生物利用度或速率；改變用肽治療的效果的時(shí)間長(zhǎng)短；改變肽的穩(wěn)定性；改變肽作用起始和衰退的速率；通過使肽具有某種性能而提供允許作用。
附圖概述如下五幅附圖分別舉例說明了將肽連接到類固醇分子的化學(xué)反應(yīng)。


圖1顯示了將肽通過共價(jià)鍵連接到雌酮分子上的一系列化學(xué)反應(yīng)。
圖2顯示了用于創(chuàng)建圖1所示相同連接鍵的第二種作為選擇的系列反應(yīng)。
圖3包含設(shè)計(jì)用于將肽通過共價(jià)鍵連接到雌二醇分子上的一系列化學(xué)反應(yīng)。
圖4包含用于創(chuàng)建圖3所示相同連接鍵第二種系列反應(yīng)。
圖5說明了將肽通過共價(jià)鍵連接到氫化可的松的方法。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述在研究可用作人的免疫調(diào)節(jié)、抗細(xì)胞增殖紊亂、抗癌和/或抗肉瘤藥物的短肽分子中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸(YSV)分子具有體外免疫調(diào)節(jié)和抗癌性能。該發(fā)現(xiàn)表明YSV分子、含該分子的較大分子，包括較大的肽和在它們的序列中含所述YSV序列的肽以及YSV的功能衍生物可用作免疫調(diào)節(jié)劑和/或抗細(xì)胞增殖紊亂藥物或食物增補(bǔ)劑。
應(yīng)理解可以將其他氨基酸加至所述YSV肽的氨基端或羧基端而作為實(shí)施本發(fā)明的另一種方法。在這樣的實(shí)施方案中，所述YSV肽保持本文所描述的一種或多種治療或功能性能。例如，在一些實(shí)施方式中，在所述肽中增加一個(gè)或兩個(gè)氨基酸而并未使其生物功能受到影響。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，也可以增加三或四個(gè)氨基酸而仍保持肽的功能。這些均稱為該肽的變異體。另外，肽的衍生物如在同一功能區(qū)內(nèi)進(jìn)行一個(gè)氨基酸的保守置換也可用于實(shí)施本發(fā)明的另一方面。例如，具有非極性端或稱疏水側(cè)鏈的肽可以被取代一個(gè)側(cè)基而其生物學(xué)功能并不減弱。作為進(jìn)一步的例子，接頭/間隔基可被插入肽形成變體，但這些變體仍保持本研究中所用的原始肽的活性部分。這些被視為本發(fā)明肽的變體。本文所用術(shù)語(yǔ)肽類似物包括具有模擬天然氨基酸結(jié)構(gòu)的氨基酸分子的肽，例如具有不同骨架結(jié)構(gòu)或D-氨基酸取代的類似物。作為進(jìn)一步的例子，盡管用于合成肽的氨基酸是L-光學(xué)異構(gòu)形式，但是序列中一或多個(gè)氨基酸被D-型取代的肽可能具有類似的生物活性。本申請(qǐng)權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“功能性衍生物”涵蓋本發(fā)明肽的片段、變體、類似物和化學(xué)衍生物。
“基本上純化的肽”是指純度至少為10％(w/w)的肽，優(yōu)選純度為20％，更優(yōu)選為40％，更優(yōu)選為60％，進(jìn)一步優(yōu)選為大于90％。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，純度大于99％。如下文所述，基本上純化的肽可做為混合物中的部分成分進(jìn)行藥物或營(yíng)養(yǎng)配方的制備。
上述肽用在藥物配方中可用于治療免疫失調(diào)以及對(duì)于免疫性有繼發(fā)作用的疾病，例如細(xì)胞增殖紊亂，如癌癥或感染。在這些肽的藥物配方可能是YSV或其功能衍生物與其它活性或非活性成分的混合，包括其他肽，例如兩個(gè)或若干個(gè)(例如3-5個(gè))肽可以加到同一配方中，可伴有或不伴有其它成分?；蛘?，YSV或其功能衍生物可以與這兒未列出的肽一起用于制備配方。此類配方可以經(jīng)靜脈、肌肉、皮內(nèi)、皮下或真皮內(nèi)給藥，或動(dòng)脈注射直接作用于器官，還可以以粉末、噴霧的方式經(jīng)呼吸道吸入，經(jīng)皮吸收或本領(lǐng)域已知的其它輸送方式。配方還可以中服，并可含有可用于在口服后防肽的胃消化的載體，或本領(lǐng)域已知的任何其它載體(對(duì)于經(jīng)皮，如脂質(zhì)體)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“雜合肽”是指含有插入具有上述序列的原始生物活性肽或其功能衍生物中的額外肽但仍保持基本類似的活性的肽。額外肽包括前導(dǎo)肽，其含有例如由一或多個(gè)原核或真核細(xì)胞識(shí)別作為將該雜合肽分泌至胞外的信號(hào)的氨基酸序列。分泌可以是直接分泌，或通過分泌小泡間接分泌。
在本說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語(yǔ)“包含”或“包括”等是指“包含/包括，但不限于”。例如，包括A、B和C的方法、裝置、分子或其他術(shù)語(yǔ)可描述為包含A和B。同樣，包含A和B的方法、裝置、分子或其他屬于可包括任何數(shù)量的其他步驟、組分、原子或其他術(shù)語(yǔ)。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“基本上由……組成”是指這樣的一種肽或多肽，其包括YSV肽或其一種功能衍生物的氨基酸序列和羧基和/或氨基末端的額外氨基酸并保持本文所提供的所述肽的活性。因此，作為非限定性實(shí)例，在該實(shí)例中YSV肽或其一種功能衍生物的活性可調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥)，基本上由YSV肽或其一種功能衍生物組成的肽或多肽將具有本文提供的與該肽有關(guān)的調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥)的活性，并且不具有在其內(nèi)部和其自身的(即在連接到生物活性分子而進(jìn)行修飾前)實(shí)質(zhì)上降低肽或多肽調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥)的能力或構(gòu)成對(duì)該肽作為免疫活性調(diào)節(jié)劑這一基本新特征的實(shí)質(zhì)改變的任何特征。因此，在前述實(shí)例中，其主要活性不是調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥)，并且在其中的某處含有所述YSV肽或其一種功能衍生物的氨基酸序列的全長(zhǎng)天然存在的多肽不是“基本由”YSV肽或其一種功能衍生物組成的肽或多肽。同樣，在前述實(shí)例中，其主要活性不是調(diào)節(jié)免疫活性和/或細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥)，但在其中的某處含有所述YSV肽或其一種功能衍生物的氨基酸序列的基因工程化肽或多肽不是“基本由”YSV肽或其一種功能衍生物組成的肽或多肽。
通過使用本文提供的針對(duì)所述YSV肽的測(cè)定調(diào)節(jié)免疫活性和/或調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖紊亂(如癌癥，包括但不限于宮頸癌、肝癌和白血病)的分析來測(cè)定肽或多肽的活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定肽或多肽是否符合前述定義的基本上由YSV肽或其一種功能衍生物組成。同樣，通過使用本文提供的針對(duì)所述YSV肽的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖紊亂(包括但不限于癌癥，所述癌癥包括但不限于黑素瘤、肺癌和癌影響的肺組織)的分析來測(cè)定肽或多肽的活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定肽或多肽是否符合前述定義的基本上由YSV肽或其一種功能衍生物組成。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“基本上由.....組成”是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于20個(gè)氨基酸殘基的肽和多肽。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于15個(gè)氨基酸殘基的肽。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于10個(gè)氨基酸殘基的肽。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于6個(gè)氨基酸殘基的肽或多肽。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于4個(gè)氨基酸殘基的肽或多肽。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)是指除了所述YSV肽或其一種功能衍生物之外另外還有少于2個(gè)氨基酸殘基的肽或多肽。
藥物制劑可包括任何已知的藥物載體。合適的載體的實(shí)例包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)上可接受的載體。這些載體包括但不限于生理鹽水、水、乳液(包括油水混合物或甘油三酸酯乳液)及其他類型的試劑、填料、包衣片劑和膠囊?？筛鶕?jù)藥物組合物的給藥方式選擇合適的載體。
所述YSV肽及其功能衍生物可經(jīng)靜脈注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射、皮下植入給藥。所述肽還可以任一口服給藥形式如片劑、膠囊、懸液、溶液等，以未經(jīng)修飾的常用形式或緩釋形式或腸胃道保護(hù)或不保護(hù)形式給藥。所述肽可進(jìn)一步以任何局部應(yīng)用的形式如軟膏、霜、凝膠等經(jīng)過或不經(jīng)過皮促進(jìn)裝置給藥(transdermal facilitating device)。肽還可轉(zhuǎn)化成其遺傳序列并克隆進(jìn)表達(dá)系統(tǒng)，或以其本身或與其他肽序列組合以產(chǎn)生肽分子而利用本文所述肽的活性。
每種肽的劑量可以是1ng-10g/kg體重。注射用給藥劑量可以是10ng-10mg/kg，更優(yōu)選1μg-1mg/kg。藥物的起效劑量可以低至1ng/kg體重，這可通過一個(gè)或多個(gè)肽與受體結(jié)合誘導(dǎo)一系列正常機(jī)體反應(yīng)而起效?；蛘咭粋€(gè)或多個(gè)肽直接誘導(dǎo)引起全系列反應(yīng)。對(duì)于口服，給藥劑量可以是1ng-10g/kg體重/天，優(yōu)選0.1μg-1g/kg體重/天，更優(yōu)選是1μg-10mg/kg體重/天。
I.有關(guān)YSV肽作用的實(shí)施方案1.1用于2.1-2.4的材料BALB/c小鼠，體重18-22g，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
YSV由CS Bio，USA定制。
胎牛血清(FBS)和RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基由美國(guó)Gibco公司提供。
四甲基偶氮唑鹽(MTT)和刀豆蛋白A(ConA)由美國(guó)Sigma公司提供。
人肝癌細(xì)胞BEL7402由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院癌癥研究所提供。
人白血病細(xì)胞K562由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液疾病研究所提供。
人宮頸癌海拉(Hela)細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)研究所提供。
2.1YSV對(duì)體外T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用2.1.1方法(如參考文獻(xiàn)1所述，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)將健康的小鼠頸椎脫臼致死。無(wú)菌操作取脾。將脾淋巴細(xì)胞懸浮液洗滌并用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至細(xì)胞密度為5×106/ml。用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋YSV至各種濃度2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml。刀豆蛋白A工作液用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至1mg/ml。
將所述反應(yīng)劑如下加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中100μl/孔的淋巴細(xì)胞懸浮液，20μ1/孔的ConA和100μl/孔的各種濃度的YSV溶液，各濃度設(shè)置6個(gè)平行孔；向12個(gè)平行孔中加入100μl/孔的淋巴細(xì)胞懸浮液和120μl/孔的RPMI-1640培養(yǎng)基(含10％FBS)作為負(fù)對(duì)照；向12個(gè)平行孔中加入100μl/孔的淋巴細(xì)胞懸浮液，100μl/孔的RPMI-1640培養(yǎng)基(10％FBS)和20μl/孔的ConA作為正對(duì)照。
將所述細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)68小時(shí)，隨后在150g下離心10min。棄上清液后，向細(xì)胞沉淀中加入50μl/孔的1mg/ml MTT的RPMI-1640溶液，振蕩2min后再制成懸浮液。繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。在150g下離心10分鐘，棄上清液。用濾紙吸干后，將細(xì)胞與120μl 40mM的鹽酸-2-丙醇混合，并振蕩3min。在ELISA-reader上測(cè)定每孔的吸光度(OD值)，測(cè)定波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm。
2.1.2結(jié)果表1YSV對(duì)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用
*與負(fù)對(duì)照組比較，P＜0.0012.1.3結(jié)論在濃度為0.016μg/ml至2μg/ml時(shí)，YSV能夠刺激體外T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。
2.2 YSV對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌BEL7402細(xì)胞增殖的作用2.2.1方法(如參考文獻(xiàn)2描述，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌BEL7402細(xì)胞與含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)一起培養(yǎng)2至3min，以將其分離。采用倒置顯微鏡檢驗(yàn)細(xì)胞。在觀察到細(xì)胞質(zhì)致密化及細(xì)胞小室膨脹后，除去上清液。加入幾毫升含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基以終止消化。用移液管溫和地吹氣收獲細(xì)胞。將懸浮的細(xì)胞在150g下離心10min收集，用冷D-Hank氏溶液再懸浮和離心來進(jìn)行洗滌兩次。將經(jīng)洗滌的細(xì)胞再懸浮于含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)至密度為5×104/ml。將經(jīng)過處理的BEL7402細(xì)胞置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)24小時(shí)，以進(jìn)行預(yù)活化和附著。
該試驗(yàn)包括三組具有不同YSV濃度的測(cè)試組和負(fù)對(duì)照組。YSV在培養(yǎng)基中的最終濃度為20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml。在負(fù)對(duì)照組中，YSV溶液采用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基替代。每組包含5個(gè)平行孔。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)48小時(shí)。
隨后通過在150g下離心10min以沉淀細(xì)胞。除去上清液后，將100μl/孔的0.5mg/ml MTT的RPMI-1640溶液加入所述細(xì)胞沉淀中，并通過振蕩2min將細(xì)胞重懸浮。繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。在150g下離心10min后除去上清液。用濾紙吸干后，將100μl/孔40mM的鹽酸-2-丙醇加入細(xì)胞沉淀中并振蕩3min。在ELISA-reader上測(cè)定每孔的吸光度(OD值)，測(cè)定波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm。
2.2.2結(jié)果表2YSV對(duì)人肝癌BEL7402細(xì)胞生長(zhǎng)的體外抑制作用
*與負(fù)對(duì)照組比較，P＜0.052.2.3結(jié)論在濃度為5μg/ml至20μg/ml時(shí)，YSV能夠抑制體外人肝癌細(xì)胞BEL7402的生長(zhǎng)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
2.3 YSV對(duì)體外培養(yǎng)的人白血病K562細(xì)胞的增殖的作用
2.3.1方法(如參考文獻(xiàn)2所述，通過引用結(jié)合到本文中)用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人白血病K562細(xì)胞調(diào)節(jié)至密度為5×104/ml。將所述細(xì)胞置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)24小時(shí)。該試驗(yàn)包括五組在培養(yǎng)基中具有不同YSV濃度的測(cè)試組和僅含培養(yǎng)基的負(fù)對(duì)照組。YSV的最終濃度為40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml。每組包含5個(gè)平行孔。將100μl/孔測(cè)試溶液加入經(jīng)處理的細(xì)胞中。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)48小時(shí)。
隨后通過在150g下離心10min沉淀細(xì)胞。除去上清液后，將100μl/孔的0.5mg/ml MTT的RPMI-1640溶液加入所述細(xì)胞沉淀中，并通過振蕩2min將細(xì)胞重懸浮。繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。在150g下離心10min后除去上清液。用濾紙吸干后，將100μl/孔40mM的鹽酸-2-丙醇加入細(xì)胞沉淀中并振蕩3min。在ELISA-reader上測(cè)定每孔的吸光度(OD值)，測(cè)定波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm。
2.2.2結(jié)果表3YSV對(duì)人白血病K562細(xì)胞的體外抑制作用
*與負(fù)對(duì)照組比較，P＜0.052.3.3結(jié)論在濃度為5μg/ml至40μg/ml時(shí)，YSV能夠抑制體外人白血病K562細(xì)胞的生長(zhǎng)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
2.4對(duì)人宮頸癌海拉細(xì)胞生長(zhǎng)的體外抑制作用2.4.1方法(如參考文獻(xiàn)2所述，通過引用將其結(jié)合到本文中)
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌海拉細(xì)胞與含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS培養(yǎng)一起培養(yǎng)2至3min，以將其分離。采用倒置顯微鏡檢驗(yàn)細(xì)胞。在觀察到細(xì)胞質(zhì)致密化及細(xì)胞小室膨脹后，除去上清液。加入幾毫升含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基以終止消化。用移液管溫和地吹氣收獲細(xì)胞。將懸浮的細(xì)胞在150g下離心10min收集，用冷D-Hank氏溶液再懸浮和離心來進(jìn)行洗滌兩次。將經(jīng)洗滌的細(xì)胞再懸浮于含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)至密度為5×104/ml。將經(jīng)過處理的細(xì)胞置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)24小時(shí)，以進(jìn)行預(yù)活化和附著。
該試驗(yàn)包括兩組在培養(yǎng)基中具有不同YSV濃度的測(cè)試組和僅含培養(yǎng)基的負(fù)對(duì)照組。YSV在培養(yǎng)基中的最終濃度為10μg/ml和5μg/ml。每組包含5個(gè)平行孔。在經(jīng)處理的細(xì)胞中加入100μl孔的測(cè)試溶液。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)48小時(shí)。
隨后通過在150g下離心10min以沉淀細(xì)胞。除去上清液后，將100μl/孔的0.5mg/ml MTT的RPMI-1640溶液加入所述細(xì)胞沉淀中，并通過振蕩2min將細(xì)胞重懸浮。繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。在150g下離心10min后除去上清液。用濾紙吸干后，將100μl/孔 40mM的鹽酸-2-丙醇加入細(xì)胞沉淀中并振蕩3min。在ELISA-reader上測(cè)定每孔的吸光度(OD值)，測(cè)定波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm。
2.4.2結(jié)果表4YSV對(duì)人宮頸癌海拉細(xì)胞生長(zhǎng)的體外抑制作用
*與負(fù)對(duì)照組比較，P＜0.052.4.3結(jié)論在濃度為5μg/ml至10μg/ml時(shí)，YSV能夠抑制體外人宮頸癌海拉細(xì)胞的生長(zhǎng)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
2.5 YSV對(duì)移植于裸鼠上的人白血病K562生長(zhǎng)的作用2.5.1材料YSL深圳康哲藥業(yè)有限公司定制生理鹽水中國(guó)OTSUKA藥業(yè)公司RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基美國(guó)GIBCO公司胎牛血清(FBS)美國(guó)HYCLONE公司人白血病K562細(xì)胞組由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院血液疾病研究所提供健康裸鼠(BALB/C(nu/nu)，SPF，雄性，年齡4-5周，體重18-22g)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海腫瘤研究所提供2.5.2方法2.5.2.1細(xì)胞培養(yǎng)液將K-562細(xì)胞保存在含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2。
2.5.2.2白血病小鼠模型的制備[3]用RPMI-1640將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞調(diào)節(jié)至密度為1.6×108/ml。取0.1ml經(jīng)皮下注射到健康裸鼠的右脅腹，以制備白血病模型。
2.5.2.3動(dòng)物分組和給藥攜帶人白血病K562細(xì)胞的小鼠隨機(jī)分成生理鹽水對(duì)照組(0.2ml/天)和YSV組(160μg/kg/天)。將受測(cè)物質(zhì)溶于0.2ml鹽水中并在接種K562的第二天開始通過腹膜內(nèi)注射給予受測(cè)化合物，在連續(xù)的30天內(nèi)每天給藥一次。
2.5.2.4監(jiān)測(cè)參數(shù)每天檢測(cè)裸鼠的全身狀況，每隔3-4天檢測(cè)一次腫瘤尺寸。腫瘤體積(mm3)V＝(1/6)πXYZ，其中X、Y和Z為腫瘤在三個(gè)平面上的直徑。
在最后一次給予受測(cè)物質(zhì)的第二天，切除下腫瘤，記錄腫瘤的重量并測(cè)量腫瘤的體積。腫瘤生長(zhǎng)抑制指數(shù)(％)＝(對(duì)照組的平均腫瘤重量-治療組的平均腫瘤重量)/對(duì)照組的平均腫瘤重量×100。
2.5.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均顯示為算數(shù)平均值±SD。使用SPSS軟件的ANOVA測(cè)試分析數(shù)據(jù)。P＜0.05，為具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可被接受。
2.5.3結(jié)果表1YSV對(duì)移植于裸鼠上的人白血病K562生長(zhǎng)的作用
*與生理鹽水比較，P＜0.052.5.4.結(jié)論合適劑量的YSV能夠抑制移植于裸鼠上的人白血病K562的生長(zhǎng)，與生理鹽水對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
2.6 YSV對(duì)移植于C57BL/6小鼠上的黑素瘤B16生長(zhǎng)的抑制作用2.6.1材料2.6.1.1肽YSL深圳康哲藥業(yè)有限公司定制2.6.1.2對(duì)照物質(zhì)和其他試劑環(huán)磷酰胺(Cy)上海華聯(lián)藥業(yè)有限公司生理鹽水中國(guó)OTSUKA藥業(yè)公司RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基美國(guó)GIBCO公司胎牛血清(FBS)美國(guó)HYCLONE公司Hank氏溶液Dingtian有限公司2.6.1.3細(xì)胞系小鼠B16黑素瘤細(xì)胞系中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所提供2.6.1.4動(dòng)物健康C57 BL/6小鼠(SPF，雄性，年齡4-5周，14-18g)來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院(Academy of Military Medical Sciences)2.6.2方法2.6.2.1細(xì)胞培養(yǎng)液將B16細(xì)胞保存在含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2。
2.6.2.2黑素瘤小鼠模型的制備[4]用Hank氏溶液將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠B16黑素瘤培養(yǎng)物調(diào)節(jié)至細(xì)胞密度為2.5×106/ml，取0.2ml經(jīng)皮下注射到健康C57 BL/6小鼠的右腋窩，以制備黑素瘤小鼠模型。
2.6.2.3動(dòng)物分組和受測(cè)物質(zhì)的給藥將攜帶黑素瘤B16的小鼠隨機(jī)分成生理鹽水組(0.2ml/天)、環(huán)磷酰胺組(Cy)(20mg/kg/天)和YSV組(640μg/kg/天和320μg/kg/天)。將受測(cè)物質(zhì)溶于0.2ml鹽水中并在接種腫瘤的第二天開始通過腹膜內(nèi)注射給予受測(cè)化合物，在連續(xù)的20天內(nèi)每天給予黑素瘤小鼠模型一次。
2.6.2.4監(jiān)測(cè)參數(shù)自腫瘤植入第二天起，每天觀察小鼠的全身狀況和腫瘤的生長(zhǎng)情況。
在最后一次給予受測(cè)物質(zhì)的第二天，切除下腫瘤，測(cè)量腫瘤的重量。
腫瘤抑制率(％)＝(1-測(cè)試組的平均腫瘤重量/對(duì)照組平均腫瘤重量)×100％。
2.6.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均顯示為算數(shù)平均值±SD。使用SPSS軟件的ANOVA測(cè)試分析數(shù)據(jù)。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.6.3結(jié)果表1YSV對(duì)C57 BL/6小鼠上的黑素瘤B16生長(zhǎng)的抑制作用
*與生理鹽水比較，P＜0.052.6.4.結(jié)論在合適劑量下，YSV能夠抑制C57 BL/6小鼠上的黑素瘤B16的生長(zhǎng)，與生理鹽水對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
2.7 YSV對(duì)裸鼠上的A549人肺癌異種移植物的抑制作用2.7.1材料2.7.1.1肽YSV美國(guó)CS Bio公司定制合成2.7.1.2對(duì)照物質(zhì)和其他試劑環(huán)磷酰胺(Cy)上海華聯(lián)藥業(yè)有限公司生理鹽水中國(guó)OTSUKA藥業(yè)公司胎牛血清(FBS)美國(guó)HYCLONE公司RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基美國(guó)GIBCO公司2.7.1.3動(dòng)物健康BALB/C(nu/nu)無(wú)胸腺裸鼠(SPF,年齡4-5周，體重18-22g)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海腫瘤研究所。第一個(gè)實(shí)施方案使用雌性小鼠。第二個(gè)實(shí)施方案使用雄性小鼠。
攜帶A549人肺癌異種移植物的裸鼠來自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海腫瘤研究所。
2.7.2方法2.7.2.1肺癌裸鼠模型的制備[5]選擇直徑長(zhǎng)度大于1cm并在裸鼠上良好生長(zhǎng)的A549人肺癌異種移植物。無(wú)菌切除腫瘤塊，切成2-4mm3的片并浸入RPMI1640中。經(jīng)胸腹切口，將腫瘤塊經(jīng)皮下移植到健康裸鼠的背部接近頸部以制備肺癌裸鼠模型。
2.7.2.2分組和給藥方法將攜帶A549異種移植物的裸鼠隨機(jī)分成生理鹽水對(duì)照組(0.2ml/天)、不同劑量的YSV組和Cy對(duì)照組(0.2mg/kg/天)。將受測(cè)物質(zhì)溶于0.2ml鹽水中并在接種腫瘤的第二天開始通過腹膜內(nèi)注射給予受測(cè)化合物，在連續(xù)的40天內(nèi)每天給予黑素瘤小鼠模型一次。
2.7.2.3監(jiān)測(cè)參數(shù)每天觀察小鼠的全身狀況。每3-4天測(cè)量小鼠的重量并測(cè)試腫瘤的體積V＝(1/6)πXYZ，其中X、Y和Z為腫瘤在三個(gè)平面上的直徑。
在最后一次注射的第二天，切除下腫瘤，測(cè)量腫瘤的重量和體積。檢驗(yàn)?zāi)[瘤壞死的情況。
腫瘤抑制指數(shù)(％)＝(生理鹽水組的平均腫瘤重量-治療組的平均腫瘤重量)/生理鹽水組組的平均腫瘤重量×100％。
選擇部分具有良好生長(zhǎng)條件和堅(jiān)實(shí)密度并且沒有潰瘍或壞死的腫瘤，修整并用10％甲醛固定以進(jìn)行病理學(xué)試驗(yàn)。
2.7.2.4統(tǒng)計(jì)分析執(zhí)行SPSS軟件，利用一元方差分析(one-way ANOVA analysis)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2.7.3結(jié)果表1YSV對(duì)移植于雌性裸鼠上的A549人肺癌的生長(zhǎng)的抑制作用—實(shí)驗(yàn)1
*與生理鹽水比較，P＜0.05表2YSV對(duì)移植于雄性裸鼠上的人肺癌的生長(zhǎng)的抑制作用—實(shí)驗(yàn)2
*與生理鹽水比較，P＜0.052.7.4.結(jié)論合適劑量的YSV能夠抑制移植于裸鼠上的A549人肺癌異種移植物的生長(zhǎng)，與生理鹽水對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
3.總結(jié)論YSV顯示出能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，表明其可用作人用的免疫調(diào)節(jié)劑。
YSV顯示出能夠抑制體外人肝癌細(xì)胞BEL7402、人白血病細(xì)胞K562、人宮頸癌海拉細(xì)胞的生長(zhǎng)，以及體內(nèi)人白血病細(xì)胞K562、鼠科B16黑素瘤細(xì)胞和A549人肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，表明YSV可用于治療人細(xì)胞增殖疾病。
4.參考文獻(xiàn)1.徐叔云、卞如濂和陳修，藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第3版)，人民衛(wèi)生出版社，2002，第1427頁(yè)；2.徐叔云、卞如濂和陳修，藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第3版)，人民衛(wèi)生出版社，2002，第1785-1786頁(yè)；3.Potter G K，Shen R N，Chiao J W et al.Nude mice as models for humanleukemia studies.Am J Pathol，1984，114360；4.Zhunjiang Xie，Wenqing Liu，Yechun He et al.The inhibition of ginsengglycan and IL-2 on mice melanoma cells in vivo.ACTA ANATOMICA SINICA，2002，33(5)538-540；
5.Hanyue，抗癌藥物的研究和實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第一版)，北京醫(yī)科大學(xué)和中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社(1997)299。
II.基因治療及治療方法基于上述肽序列的基因療法是通過設(shè)計(jì)編碼這些肽之一的核酸序列而進(jìn)行。核酸可化學(xué)合成并與啟動(dòng)子有效連接而克隆到表達(dá)載體內(nèi)。表達(dá)載體隨后以基因治療的形式給予人體，以在人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。本文所采用的“基因載體”一詞包括這些表達(dá)載體。可以用于基因治療的載體包括腺相關(guān)病毒(Mizuno，M等(1998)，日本癌癥研究雜志89，76-80)、LNSX載體(Miller，A.D.等(1993)酶學(xué)方法217，581-599)和慢病毒(Goldman，M.J.等(1997)人類基因治療8，2261-2268)。
用于肽輸送的其它載體包括可在宿主生物體中復(fù)制的生物中的編碼所需肽的表達(dá)載體，該宿主生物體希望被給予該肽而不明顯影響該宿主生物體的健康。例如，表達(dá)載體可以被轉(zhuǎn)移至對(duì)希望被給予該肽的宿主生物體是非致病性的生物體中。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)載體在一種對(duì)希望被給予該肽的宿主生物體的健康沒有明顯有害作用的細(xì)菌或真菌生物中以產(chǎn)生所需的肽。例如，編碼所需的肽的表達(dá)載體可以是在如乳酸菌、大腸桿菌或酵母的生物體中產(chǎn)生所需的肽的表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體在一種哺乳動(dòng)物消化道中天然存在的微生物或哺乳動(dòng)物消化道耐受的微生物中產(chǎn)生所需的肽?？梢员磉_(dá)所需的肽的一些微生物物種包括但不限于乳桿菌菌種，如L.acidophilus，L.amylovorus，L.casei，L.crispatus，L.gallinarum，L.gasseri，L.johnsonii，L.paracasei L.plantarum，L.reuteri，L.rhamnosus，等；雙歧桿菌菌種，如B.adolescentis，Banimalus，B.bifidum，B.breve，B.infantis，B.lactis，B.longum等；Enterococcus faecalis或Ent.facium；Sporolactobacillusinulinus；Bacillus subtilis或Bacillus cereus；Escherichiacoli；Propionibacterium freudenreichii；或Saccharomyces cerevisiae或Saccharomyces boulardii。
化學(xué)合成的或以其它方式包括但不限于將mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA分子而產(chǎn)生的編碼本發(fā)明肽的核酸序列被摻入表達(dá)載體中，以通過本領(lǐng)域已知的基因工程方法基因轉(zhuǎn)移進(jìn)所希望的宿主中。表達(dá)載體可以是DNA載體或RNA載體。例如，表達(dá)載體可以基于質(zhì)?；虿《具z傳元件。表達(dá)載體可以是染色體外復(fù)制的載體或者整合進(jìn)染色體的載體。
表達(dá)載體包括與編碼本發(fā)明肽的核酸有效連接的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是可調(diào)控的啟動(dòng)子，如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，可以選擇啟動(dòng)予以提供所需水平的肽表達(dá)。另外，如果需要，表達(dá)載體可以包括其它序列以促進(jìn)肽的產(chǎn)生、呈遞和/或分泌。在一些實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明肽的核酸與指導(dǎo)肽分泌的核酸序列有效連接。例如，編碼本發(fā)明肽的核酸可以與編碼信號(hào)肽的核酸序列有效連接。
在一些實(shí)施方案中，被工程化以編碼本發(fā)明肽的表達(dá)載體可以是適于在組成哺乳動(dòng)物正常消化道菌群的細(xì)菌菌種如乳桿菌菌種和枯草芽孢桿菌中表達(dá)本發(fā)明肽的表達(dá)載體。這種表達(dá)載體的例子可參見美國(guó)專利6,100,388和5,728,571。這些文獻(xiàn)以其全文引入本文作參考。應(yīng)理解的是促進(jìn)本發(fā)明肽在不損害希望給予該肽的宿主生物體的健康的生物體中的表達(dá)的任何表達(dá)載體均可使用。
在一些實(shí)施方案中，被工程化以編碼本發(fā)明肽的表達(dá)載體可以是適于在被哺乳動(dòng)物消化道耐受的酵母菌種如Saccharomycescerevisiae或更優(yōu)選地Saccaromyces boulardii(其可在人消化道中寄居并用于治療某些形式的腹瀉)中表達(dá)本發(fā)明肽的表達(dá)載體。組成性表達(dá)異源蛋白和肽的酵母表達(dá)載體可以使用，因?yàn)槠浞浅７€(wěn)定，因此在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中可以傳遞至子代，所述載體可包括信號(hào)肽或指導(dǎo)重組蛋白高水平分泌的編碼序列。這種酵母載體的例子參見美國(guó)專利6,391,585，該文獻(xiàn)引入本文作參考。
編碼本發(fā)明肽的表達(dá)載體可以經(jīng)本領(lǐng)域已知技術(shù)導(dǎo)入欲表達(dá)該肽的生物體中。這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)化細(xì)菌、酵母或其它微生物的傳統(tǒng)方法，例如經(jīng)使用化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞、電穿孔或乙酸鋰轉(zhuǎn)化(用于酵母)，以及用這些程序無(wú)效的一些細(xì)菌菌種的轉(zhuǎn)化方法的最近進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體用Leer等(WO95/35389)公開的方法導(dǎo)入已知不能轉(zhuǎn)化的乳酸菌中(該文獻(xiàn)引入本文作參考)。導(dǎo)入的序列可以摻入微生物染色體DNA中或保持染色體外DNA元件的形式。
含有表達(dá)載體的這一基因工程微生物隨后可以接種消化道、陰道、氣管等以實(shí)現(xiàn)免疫治療。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)本發(fā)明肽的生物體以無(wú)活性形式攝入，或者優(yōu)選地，以活性形式攝入。在消化道中，這些微生物產(chǎn)生所述肽，通過分泌或微生物的裂解將其釋放進(jìn)腔內(nèi)，或以其它方式將肽呈遞給宿主，由此肽產(chǎn)生其對(duì)宿主生物體的預(yù)期作用。在其它實(shí)施方案中，在鼻通道、陰道或小腸粘膜處將肽呈遞給宿主生物體。
另一種治療方法是使用脂質(zhì)體作為輸送特異核酸至人體細(xì)胞的方式。核酸(如含有編碼SEQ ID NO1-30的肽的核酸的表達(dá)載體)在有利于細(xì)胞吸收和染色體摻入的環(huán)境中被輸送，如Gao，X.和Huang，L.(1995)基因治療2，710-722和美國(guó)專利6,207,456所述?；蛘?，使用US6,245,427的方法，肽本身可包在脂質(zhì)體中并直接輸送。上述所有科學(xué)出版物和專利均引入本文作參考。
可用于上述基因治療和治療方法的核酸序列包括編碼這些肽及其功能衍生物的序列?；诤?jiǎn)并密碼系統(tǒng)，許多核酸序列中的任何一種均可用于編碼這些肽及其衍生物。
下述參考文獻(xiàn)引入本文作參考1.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局。1993，713_1352.徐叔云，卞如濂，陳修主編。藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)。1991，1221-12343.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局。1993，71404.何金生，李瑞珠，宗庭益。MTT還原法檢測(cè)NK細(xì)胞活性的方法學(xué)研究。中國(guó)免疫學(xué)雜志，1996；1(6)356-3585.汪謙.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。人民衛(wèi)生出版社。1998，482-4836.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局。1993，71417.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局。1993，7132-1338.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局。1993，7128-1299.章元沛，蘇懷德.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)(第二版).人民衛(wèi)生出版社.1998，137-13810.李家泰.臨床藥理學(xué)(第二版).人民衛(wèi)生出版社.1998，1338-1339III.YSV及其衍生物的肽結(jié)合物與配方本發(fā)明的生物活性肽可與其它具生物學(xué)效應(yīng)或作用的分子相結(jié)合，來提供額外的效果或作用，或者增強(qiáng)它們的治療效力。許多可能的結(jié)合分子，它們的生物學(xué)作用以及與肽相結(jié)合的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。對(duì)于其它可能的結(jié)合物而言，結(jié)合到肽的化學(xué)反應(yīng)可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員無(wú)需經(jīng)過過度實(shí)驗(yàn)而推導(dǎo)出。效應(yīng)分子(effective molecule)會(huì)在下文描述。具體的例子中描述了本發(fā)明的各種肽如何與它們的效應(yīng)分子相結(jié)合，以及作為結(jié)果的結(jié)合產(chǎn)物的特性?？梢岳斫獾氖牵景l(fā)明的其它肽也可在類似的反應(yīng)中被結(jié)合。
YSV及其衍生物在特定的細(xì)胞或組織類型中具有獨(dú)特的醫(yī)療效力。將分子結(jié)合到肽藥物的一個(gè)重要目的是為了將肽定位于被治療個(gè)體體內(nèi)的特定位置或區(qū)室(compartment)。在這種方式中，肽藥物及其效應(yīng)分子可被集中在細(xì)胞或組織類型的特定區(qū)域，在所述的特定區(qū)域中，藥物具有預(yù)期的治療效果。這樣能增加相同摩爾數(shù)量的、游離的、非結(jié)合的肽可能具有的效果。相反地，被定位在其治療活性位點(diǎn)的結(jié)合肽藥物的劑量可以顯著的低于為取得相同治療效果所需要的、游離的、非結(jié)合形式藥物的劑量。
將肽藥物定位在最容易發(fā)揮其活性的位點(diǎn)的另一個(gè)有益效果在于，減少了不必要的副作用。給予的肽藥物是為了在特定細(xì)胞或組織類型中實(shí)現(xiàn)一種變化，但是所給予的肽藥物在個(gè)體體內(nèi)也會(huì)在其它部位發(fā)揮作用，有時(shí)帶來有害的結(jié)果。通過與一個(gè)定位分子(targeting molecule)結(jié)合而將肽定位在所需要的活性位點(diǎn)，可以減少在該個(gè)體中其它部位的所述肽的濃度以及帶來的副作用。
包含YSV或其功能衍生物之一的肽、基本由YSV或其功能衍生物之一組成的肽或者由YSV或其功能衍生物之一組成的肽，為了定位到個(gè)體體內(nèi)全身的不同部位，可與不同的分子相結(jié)合。下文所描述的將肽定位到所需位置的任何結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他結(jié)合技術(shù)，可被應(yīng)用于本發(fā)明的任意的肽。例如，文獻(xiàn)公開了抗乙型肝炎的藥物的選擇性傳遞到肝細(xì)胞(Fiumeetal.，Ital J Gastroenterol Hepatol，29(3)275，1997，which is incorporated herein by reference in its entirety)。在該項(xiàng)研究中，研究者將腺嘌呤阿拉伯糖苷一磷酸鹽(adenine arabinoside monophosphate，簡(jiǎn)稱ara-AMP)，一種活性對(duì)抗乙型肝炎病毒的磷酸化的核苷類似物，結(jié)合到乳糖化的人清蛋白(lactosaminated human albumin)，一種末端為半乳糖基的高分子。肝細(xì)胞表達(dá)一種能與末端的半乳糖殘基起高親和力反應(yīng)的受體蛋白。通過結(jié)合在該受體上，結(jié)合藥物能夠被肝細(xì)胞選擇性的吸收。吸收以后，結(jié)合藥物被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w，在那兒，結(jié)合藥物兩部分之間的鍵被斷開，以其活性形式釋放ara-AMP。在上述所引用的研究中，結(jié)合藥物在治療慢性乙肝感染的病人時(shí)，與游離的ara-AMP具有同樣的效果，但不會(huì)導(dǎo)致臨床副作用，例如施用游離的ara-AMP所導(dǎo)致的神經(jīng)毒性。這樣的途徑可用于本發(fā)明的任意的肽。
在上述相關(guān)的一個(gè)研究中，同一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)(Di Stefanoet al.，Biochem.Pharmacol.，61(4)459，2001)將一種抗癌的化學(xué)療法試劑，5-熒光-2脫氧尿苷(5-fluoro2-deoxyuridine，簡(jiǎn)稱FUdR)，結(jié)合到乳糖化的聚L-賴氨酸(lactosaminated poly-L-lysine)上，以達(dá)到將化合物定位在肝以及治療肝癌的微小轉(zhuǎn)移。藥物被肝細(xì)胞選擇性吸收，并打斷FUdR與目標(biāo)分子之間的化學(xué)鍵。然后，部分游離的FUdR離開肝細(xì)胞，抗癌試劑停留在肝細(xì)胞中形成集中的治療濃度。這種濃度對(duì)于滲透到肝臟中的轉(zhuǎn)移細(xì)胞的藥理學(xué)活性是足夠的。由于這種結(jié)合藥物是選擇性集中在肝臟中，因此其劑量與游離的、非結(jié)合化合物的最小藥理學(xué)活性劑量相比，顯著降低。這種策略可應(yīng)用到本發(fā)明的任意的肽。例如，乳糖化的聚L-賴氨酸(lactosaminatedpoly-L-lysine)與YSV的結(jié)合可以顯著的減少在個(gè)體中為治療乙型肝炎感染和肝癌的必需的劑量。
將化合物定位在體內(nèi)特定組織或細(xì)胞類型已成功應(yīng)用于大量的不同組織或細(xì)胞類型中。例如，腫瘤細(xì)胞常常在其表面表達(dá)非正常的高水平的肽激素受體，比如蛙皮素(bombesin)、促黃體生成素釋放激素及生長(zhǎng)激素抑制素。在一項(xiàng)研究中，抗癌化合物太平洋紫杉醇(紫杉醇)通過與奧曲肽，一種生長(zhǎng)激素抑制素類似物相結(jié)合，被選擇性定位到分泌激素的腫瘤細(xì)胞，這種腫瘤細(xì)胞高密度地表達(dá)生長(zhǎng)激素抑制素受體。結(jié)合奧曲肽的紫杉醇與游離的紫杉醇具有相同的效果，但能減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性(Huang et al.，Chem.Biol.，7(7)453，2000)。本發(fā)明的幾種肽，例如CMS024和CMS034，在動(dòng)物研究中顯示出有效的抗癌活性。利用Huang等人的技術(shù)，將這些肽與奧曲肽相結(jié)合，可以形成一種可能的抗癌治療方法，特別是針對(duì)高水平表達(dá)生長(zhǎng)激素抑制素的腫瘤細(xì)胞。這種途徑可適用于過量表達(dá)任何數(shù)量肽激素受體的目標(biāo)腫瘤細(xì)胞。在另一個(gè)將藥物定位到特定組織類型的例子中，聚L-天門冬氨酸被用來作為一種攜帶分子(carrier molecule)，特異性地將藥物定位運(yùn)送到結(jié)腸細(xì)胞(Leopold et al.，J.Pharmacokinet.Biopharm.，23(4)397，1995)。
除了肽藥物到特定細(xì)胞或組織類型的特異性定位以外，肽與攜帶分子的結(jié)合可以提供增強(qiáng)肽藥物的運(yùn)輸?shù)钠渌绞?，從而增加或從另一方面改善它們的治療效果，所述肽包含YSV或其功能衍生物、基本由YSV或其功能衍生物組成或者由YSV或其功能衍生物組成。下文描述的任一結(jié)合技術(shù)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的其它技術(shù)，可被用于本發(fā)明的任意的肽。如果化合物不能被運(yùn)送到其高效的目標(biāo)位置，任何藥物的效力將會(huì)受到限制。藥物必須在不存在由于新陳代謝過程或降解造成實(shí)質(zhì)上的活性降低的情況下才能被積極地轉(zhuǎn)運(yùn)到其活性位點(diǎn)。
肽藥物受肽酶活性的支配，并且，作為高帶電分子，難于完成跨脂質(zhì)細(xì)胞膜及內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)輸，例如血腦屏障。與其他分子的結(jié)合提供了一種保護(hù)肽避免降解，以及增強(qiáng)肽藥物進(jìn)入細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)區(qū)室的方式，而通常情況下，細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)區(qū)室會(huì)排斥該化合物。
通過允許肽進(jìn)入到體內(nèi)特定區(qū)域(而通常情況下，在這些區(qū)域中，肽會(huì)被排斥)，結(jié)合技術(shù)開啟了給藥的新途徑。在Pateletal.，BioconjugateChem.，8(3)434，1997，其化學(xué)過程在下文實(shí)施例5中進(jìn)行了詳細(xì)描述，并在此處作為參考全文引用，研究者將一種已知作為有效止痛劑的肽藥物，七肽δ啡肽(heptapeptide deltorphin)，與一種有機(jī)分子相結(jié)合，該有機(jī)分子經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)以允許肽穿過血腦屏障。這樣藥物可通過靜脈給藥，而不用通過腦室注射。
Patel等人研究中的攜帶分子被設(shè)計(jì)來特異性針對(duì)那些含有血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)也允許肽穿越這些屏障。遍及全身的內(nèi)皮細(xì)胞膜，包括血腦屏障，對(duì)于序列特異性及表達(dá)在其表面的膜結(jié)合肽鏈內(nèi)切酶的濃度是不同的。分子的設(shè)計(jì)利用這種特性來使攜帶分子及其攜帶物的定位成為可能。該分子含有三條游離端標(biāo)記了二肽Arg-Pro的脂肪酸鏈，其與血腦屏障的肽鏈內(nèi)切酶優(yōu)先結(jié)合。親脂性的脂肪酸鏈?zhǔn)箮щ姾呻乃幬锓肿拥霓D(zhuǎn)運(yùn)成為可能。從而，標(biāo)記二肽的甘油三酸酯分子既可實(shí)現(xiàn)定位也可實(shí)現(xiàn)跨血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)。
結(jié)合方法也可增強(qiáng)肽藥物活性的動(dòng)力學(xué)。下文所描述的用于增強(qiáng)肽活性動(dòng)力學(xué)的任何結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它結(jié)合技術(shù)都可用于包含YSV或其功能衍生物的肽、基本由YSV或其功能衍生物組成的肽或者由YSV或其功能衍生物組成的肽。Patel等人發(fā)現(xiàn)止痛劑肽的結(jié)合形式不僅能夠從血流中進(jìn)入腦，而且與游離肽相比較具有相同的反應(yīng)性。比之顱內(nèi)注射的游離肽的效果，靜脈給藥的藥物需要更長(zhǎng)時(shí)間來發(fā)揮治療效果，但是效果的持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，減少得更慢。研究者們發(fā)現(xiàn)結(jié)合肽分子在血清中非常穩(wěn)定，但注射入腦室中卻無(wú)效果，顯示出攜帶分子可能是在從血流轉(zhuǎn)運(yùn)到腦的過程中被降解和移除。他們猜測(cè)，轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合物及降解攜帶分子所需要的時(shí)間是導(dǎo)致動(dòng)力學(xué)改變的原因。不考慮延遲的力學(xué)，在臨床應(yīng)用中，結(jié)合肽分子的靜脈穩(wěn)定性、延遲發(fā)作以及藥物效果的活性意味著它可以不用頻繁地給藥。更低的頻率以及更方便的劑量給藥時(shí)間表增強(qiáng)了這種藥物作為可選治療方案的應(yīng)用價(jià)值。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然的是，Patel等人的技術(shù)和過程可以容易的適用于任何落入到有限大小范圍的肽的運(yùn)送，包括本發(fā)明的任意的肽。例如，本發(fā)明的一種肽，其顯示出抗癌效果，比如YSV，能夠與Patel等人所用的同樣的分子相結(jié)合。在一個(gè)帶有腦腫瘤的個(gè)體的治療中，結(jié)合分子可允許YSV從血流中進(jìn)入腦，并允許YSV在腦內(nèi)的腫瘤組織中發(fā)揮作用。改變攜帶分子的定位的修飾對(duì)這個(gè)人同樣顯著。攜帶分子的定位特性是在脂肪酸鏈末端含有二肽修飾的兩種氨基酸的特點(diǎn)的作用。Arg-Pro二肽與發(fā)現(xiàn)位于血腦屏障的內(nèi)皮膜表面的一批膜結(jié)合肽鏈內(nèi)切酶優(yōu)先結(jié)合。其他的內(nèi)皮細(xì)胞和膜可能通過其它二肽結(jié)合物被定位。
研究者們也利用結(jié)合狀態(tài)來制造可通過消化道或者透皮被有效吸收的肽藥物。下文所描述的用于增強(qiáng)吸收的任何結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它結(jié)合技術(shù)，都可被用來增強(qiáng)包含YSV肽或其功能衍生物的肽的吸收、基本由YSV肽或其功能衍生物組成的肽的吸收或者由YSV肽或其功能衍生物組成的肽的吸收。Kramer等人描述了一種將肽藥物連結(jié)到膽汁酸的過程?；衔锟诜o藥之后的結(jié)合分子的吸收率與單獨(dú)的肽相比顯著增強(qiáng)(J.Biol.Chem.，269(14)10621，1994)。Toth等人(J.Med.Chem.，42(19)4010，1999)描述了將具有抗腫瘤特性的肽藥物與脂氨基酸(lipoamino acid，簡(jiǎn)稱LAA)或脂多糖(liposaccharides，簡(jiǎn)稱LS)的結(jié)合，目的是為了增加吸收率以及增強(qiáng)抗癌肽到其活性位點(diǎn)的遞送。在他們的研究中，生長(zhǎng)激素抑制素的一種衍生物與LAA或LS中的任一個(gè)相結(jié)合，這種衍生物顯示出很強(qiáng)的抗增殖特性，但具有削弱的藥代動(dòng)力學(xué)(pharmokinetics)。得到的結(jié)合藥物具有跨皮膚和消化道上皮細(xì)胞的改善的吸收譜(absorption profile)，增加了抗降解的能力，并依然具有抗腫瘤細(xì)胞活性。這些技術(shù)與本發(fā)明的任意的肽相結(jié)合后將非常有用。通過增加分子的跨腸道上皮細(xì)胞的吸收率，更多的肽可被運(yùn)送到血液中并在被治療的個(gè)體體內(nèi)發(fā)揮作用。
結(jié)合(Conjugation)也可被用來提供肽藥物的持續(xù)的釋放。用于提供持續(xù)釋放的任何結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他結(jié)合技術(shù)，都可用于提供肽的持續(xù)釋放，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物組成或者由YSV肽或其功能衍生物組成。如上文Patel等人的工作中所看到的，肽藥物的持續(xù)的遞送可通過結(jié)合方法達(dá)到。另一個(gè)例子是Kim等人的工作(Biomaterials，232311，2002)，在他們的工作中，重組人表皮生長(zhǎng)因子(recombinant human epidermal growth factor，簡(jiǎn)稱rhEGF)在被裝入生物所能分解的聚乳酸聚甘醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)微球體膠囊以前，與聚乙烯乙二醇(polyethylene glycol，簡(jiǎn)稱PEG)相結(jié)合。裝入PLGA微膠囊被好幾個(gè)小組用于遞送不同的生長(zhǎng)因子和形態(tài)發(fā)生蛋白(Meinel et al.，J.ControlledRel.，70193，2001)。與非結(jié)合的游離rhEGF相比較，通過與PEG結(jié)合，rhEGF可避免形成不溶于水的聚合體形式以及在與PLGA形成膠囊過程中吸附在水-有機(jī)相分界面。
與游離的激素相比較，具有結(jié)合激素的配方所表現(xiàn)出的藥代動(dòng)力學(xué)得到改善，顯示出更持久、更穩(wěn)定，以及全面增強(qiáng)的藥物活性，研究者們推測(cè)，這是由于與PEG結(jié)合的激素具有增強(qiáng)的生理穩(wěn)定性。類似的策略可以應(yīng)用來制備本發(fā)明的任意肽的持續(xù)釋放的配方。例如，YSV對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞具有有力的刺激作用。通過將PEG結(jié)合到這種肽并將結(jié)合藥物加入到PLGA微球體中，YSV隨著藥物的定量給藥，以及隨著它從PEG結(jié)合物中釋放出來，對(duì)于個(gè)體的刺激作用可持續(xù)更長(zhǎng)，更穩(wěn)定，更一致，并且確保肽藥物到免疫系統(tǒng)的更持續(xù)的遞送。
肽藥物的延遲釋放可顯著增強(qiáng)其活性。下文所描述的任何用于提供肽的延遲釋放的結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它結(jié)合技術(shù)，都可用于提供肽的延遲釋放，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物組成或者由YSV肽或其功能衍生物組成。Oldham等人(Int.J.Oncology，16125，2000)比較了抗癌試劑太平洋紫杉醇與該藥物的一種新形式，太平洋紫杉醇結(jié)合到聚L-谷氨酸(PG-TXL)。PG-TXL相比較游離的太平洋紫杉醇，顯示出具有較高的抗癌活性，暗示該藥物具有較好的藥代動(dòng)力學(xué)特性或者甚至具有更優(yōu)的作用方法。然而，調(diào)查者發(fā)現(xiàn)PG-TXL通過與游離藥物相同的作用機(jī)理來發(fā)揮作用，通過打亂微管亞單位的聚合來誘導(dǎo)細(xì)胞周期的停止。證據(jù)顯示，與游離肽給藥相比，結(jié)合藥物的更好的抗癌活性來自于游離藥物從結(jié)合物中的持續(xù)并穩(wěn)定的釋放，并更長(zhǎng)時(shí)間地維持其治療濃度。本發(fā)明的具有抗癌特性的肽，例如CMS008，其所增加的聚L-谷氨酸尾端也能夠增強(qiáng)殺死腫瘤的能力。
在一些例子中，肽的酶降解可能會(huì)降低肽作為藥物的效力。下文所描述的減少肽的酶降解的任何結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它結(jié)合技術(shù)，可用于減少肽的酶降解，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物組成或者由YSV肽或其功能衍生物組成。研究者們已開發(fā)出很多方法來保護(hù)肽免受消化道中腔體分泌的蛋白酶以及結(jié)合在膜上的肽酶的降解。后者被發(fā)現(xiàn)位于所有粘膜組織的表面，而跨越粘膜組織經(jīng)常是肽藥物的進(jìn)入路線。Bernkop-Schurch等人(J.Drug Target.，755，1999)，報(bào)道了含有胃蛋白酶抑制劑的肽藥物配方的構(gòu)建。一種胃酶抑素的類似物共價(jià)結(jié)合在粘膜附著聚合體(mucoadhesive polymer)上；這種新的胃蛋白酶抑制劑包含在含有胰蛋白酶的藥片中。在模擬消化過程的實(shí)驗(yàn)室條件下的培養(yǎng)之后，對(duì)照藥片的所有的胰蛋白酶都被代謝，然后在含有這種抑制劑的藥片中大約50％的胰蛋白酶被保護(hù)不受降解。在另一項(xiàng)研究中，同一個(gè)研究小組利用蛋白酶抑制劑在通常會(huì)導(dǎo)致毒副作用的劑量下來抑制生物活性肽的降解(Bemkop-Schnurch etal.，Adv.Drug Del.Rev.，52127，2001)。該方法利用殼聚糖，一種從殼質(zhì)中提取的與纖維素相關(guān)的氨基多糖，在甲殼類和其他生物體中發(fā)現(xiàn)的一種主要的結(jié)構(gòu)多糖。通過將蛋白酶抑制劑結(jié)合到殼聚糖，以及在肽藥物配方中包括這種結(jié)合分子，發(fā)現(xiàn)消化道蛋白酶的顯著的抑制，增加了肽的生物利用率，并且沒有在給予游離的蛋白酶抑制劑時(shí)可預(yù)見的副作用。在該研究中，各種蛋白酶抑制劑被單獨(dú)以及聯(lián)合使用來與殼聚糖攜帶物相結(jié)合。殼聚糖-EDTA結(jié)合物同樣通過結(jié)合某些蛋白酶發(fā)揮活性所必需的無(wú)機(jī)輔助因子來抑制內(nèi)生性蛋白酶。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，攜帶分子(carrier molecule)與效應(yīng)部分(effector moiety)之間的大量的可能的組合可以被構(gòu)建來為肽配方提供有益的特性，它們中的任何一種均可容易地適用于本發(fā)明的肽。利用連接在殼聚糖的蛋白酶抑制劑，通過構(gòu)建肽的口服給藥配方，YSV的口服給藥可被用來代替肌肉注射。這種方法并沒有排除在配方中使用更容易被吸收的YSV的結(jié)合形式，來構(gòu)建這種肽及其衍生物的更高水平的生物利用度。
除了被另一個(gè)分子定位在特定區(qū)域，肽自身可作為定位分子。下文所描述的任何利用肽來將分子定位到所希望區(qū)域的結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它定位技術(shù)，均可用于包含YSV肽或其功能衍生物的肽、基本由YSV肽或其功能衍生物組成的肽或者由YSV肽或其功能衍生物組成的肽。例如，研究者們已使用抗癌藥物二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylomithine，簡(jiǎn)稱DFMO)，并為了定位將其結(jié)合到肽上。DFMO是一種高效的細(xì)胞毒素試劑，它可有效地殺傷多種的癌細(xì)胞類型。然而，由于它會(huì)很快地從體內(nèi)被清除，它的治療價(jià)值受到限制。在該項(xiàng)研究中，將DFMO結(jié)合到一個(gè)特殊的促黑細(xì)胞激素片段和含有兩種氨基酸取代基的類似片段，其顯示出能優(yōu)先結(jié)合到人類黑素瘤細(xì)胞系促黑細(xì)胞激素受體(Suli-Vargha et al.，J.Pharm.Sci.，86997，1997)。為使DFMO從肽片斷中通過氨基肽酶方便釋放，藥物被結(jié)合到肽的N末端。研究者們發(fā)現(xiàn)結(jié)合藥物在殺傷黑素瘤細(xì)胞時(shí)比單獨(dú)的非結(jié)合藥物更有效。
本發(fā)明的肽的作用可部分的歸因于肽自身的內(nèi)在的定位能力。例如，像促黑細(xì)胞激素片斷α，本發(fā)明的特定的肽可聯(lián)結(jié)到某一受體，該受體被發(fā)現(xiàn)位于一種獨(dú)特類型細(xì)胞的表面。通過使用該肽作為結(jié)合體，藥物可被定位在用該藥物治療的個(gè)體體內(nèi)的那些細(xì)胞的特定區(qū)域。
作為結(jié)合物的肽可發(fā)揮除定位以外的其它功能。下文所描述的任何提高肽的治療效果的結(jié)合技術(shù)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他結(jié)合技術(shù)，均可用于增強(qiáng)肽的治療效果，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物組成或者由YSV肽或其功能衍生物組成。Fitzpatrick等人通過在兩個(gè)分子之間使用肽間隔，改進(jìn)了結(jié)合抗癌試劑(Anticancer Drug Design，101，1995)。已將甲氨蝶呤(Methotrexate)與人血清蛋白(HSA)相結(jié)合，來增加被腫瘤細(xì)胞吸收以及抗腫瘤細(xì)胞的能力。一旦被細(xì)胞吸收，一些甲氨蝶呤被溶酶體中的酶從結(jié)合物中釋放，并可發(fā)揮其細(xì)胞毒素作用。通過在甲氨蝶呤與容易被溶酶體酶消化的HAS之間插入一個(gè)四氨基酸的連接肽，增加了細(xì)胞內(nèi)由結(jié)合分子產(chǎn)生的活性甲氨蝶呤的數(shù)量。本發(fā)明的肽可通過與特殊的酶的特定反應(yīng)來發(fā)揮它們的作用。通過在結(jié)合分子內(nèi)合并本發(fā)明的一種肽作為藥物與其攜帶分子之間的連接片段，或者增加另一個(gè)連接片段，藥物動(dòng)力學(xué)可被改變。這能夠構(gòu)建一種對(duì)蛋白酶的活性更具抗性或更敏感，并且隨后增加或減少藥物分子從結(jié)合物中的釋放率的前體藥物。就像上文中結(jié)合的化學(xué)治療試劑的例子那樣，藥物分子遞送比例的改變可大大增強(qiáng)藥物的作用效果。
藥物對(duì)于一個(gè)特定細(xì)胞的作用可根據(jù)其它因素而被改變，例如細(xì)胞的活化狀態(tài)，或者細(xì)胞周圍或細(xì)胞內(nèi)其它分子信號(hào)的存在。在一些實(shí)例中，為了藥物能夠發(fā)揮作用，另一個(gè)分子或信號(hào)必須存在。Damjancic等人(Exp.Clin.Endocrin.，95315，1990)研究了人心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，簡(jiǎn)稱hANP)對(duì)內(nèi)糖皮質(zhì)激素缺乏綜合癥(deficient endogenousglucocorticoid synthesis)病人的影響。肽在糖皮質(zhì)激素治療的停藥期間或隨后使用地塞米松進(jìn)行繼續(xù)治療期間給予病人。病人只有在伴隨的地塞米松治療期間給予肽激素，才對(duì)hANP起反應(yīng)并且增加利尿與鈉排泄。在糖皮質(zhì)激素治療的停藥期間用hANP處理無(wú)效果。協(xié)同給予類固醇激素的作用也能增強(qiáng)肽的活性。在Zhu等人的報(bào)道中(Acta Pharm.Sinica，28166，1993)，止痛劑肽京都啡肽(kyotorphin，簡(jiǎn)稱KTP)通過經(jīng)由一個(gè)短連接片段結(jié)合到氫化可的松(hydrocortisone)，其活性與單獨(dú)肽的活性相比較顯著增強(qiáng)。單獨(dú)給予氫化可的松無(wú)效果。
這些研究的結(jié)果表明，類固醇激素作為結(jié)合分子的能力或者作為配方中的成分可實(shí)現(xiàn)或增強(qiáng)生物活性肽的活性。本發(fā)明的任意的肽也可通過結(jié)合到或與類固醇激素共同應(yīng)用被調(diào)節(jié)或活化。Zhu等人的技術(shù)可容易的適用于類固醇分子與本發(fā)明的肽的結(jié)合。圖1至5也提供了連接類固醇激素到本發(fā)明的任意的肽的典型的逐步合成反應(yīng)。
上述所舉的例子提供了增加本發(fā)明的任意的肽的有效性及活性的典型方式。在這一領(lǐng)域中進(jìn)一步的發(fā)展將有助于克服障礙來構(gòu)建基于肽的有效的臨床治療。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然的，開發(fā)用于肽生物化學(xué)、制藥研究及臨床檢測(cè)的技術(shù)、試劑以及實(shí)驗(yàn)規(guī)程，都可容易地應(yīng)用于本發(fā)明的任意的肽。
實(shí)施例1經(jīng)基因工程乳桿菌菌種輸送肽以下提供了將本發(fā)明肽輸送至如上所述宿主中的一個(gè)舉例方法。編碼YSV的DNA序列經(jīng)化學(xué)方法合成，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)將這一DNA序列導(dǎo)入一表達(dá)載體中。所選的表達(dá)載體含有在乳桿菌中有功能的組成型啟動(dòng)子，一個(gè)用于以特異的5’至3’方向異入DNA序列的多克隆位點(diǎn)，以及一個(gè)賦予對(duì)抗生素的抗性的選擇標(biāo)記基因(以輔助克隆程序)，并且還可含有有助于肽的產(chǎn)生和/或分泌的其它序列，如信號(hào)肽序列。這種載體的一個(gè)例子參見美國(guó)專利5,592,908，其引入本文作參考。簡(jiǎn)要地，該專利討論了在乳桿菌菌種中有功能的若干已知啟動(dòng)子，以及在所述細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)新啟動(dòng)子的方法，這些啟動(dòng)子的任一種均可與編碼本發(fā)明肽的核酸有效連接以在乳桿菌中表達(dá)所述肽。編碼信號(hào)肽如美國(guó)專利5,592,908所述的在乳酸乳桿菌中有活性的由16-35個(gè)多數(shù)為疏水的氨基酸組成的肽的核酸被插入啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明肽的核酸之間，從而編碼信號(hào)肽的核酸與編碼本發(fā)明肽的核酸同框。
除了肽的編碼序列之外，合成的DNA序列還可包括有助于將所述DNA連接并克隆進(jìn)表達(dá)載體的序列。例如，相應(yīng)于載體的多克隆位點(diǎn)的一個(gè)位點(diǎn)的限制酶識(shí)別位點(diǎn)可在序列的5’和3’端被摻入合成DNA中，從而所述序列可以正確方向克隆進(jìn)載體中。載體和合成DNA用特定限制酶消化，然后純化。載體和合成DNA連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌合適菌株中。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含有載體賦予抗性的抗生素的培養(yǎng)基上鋪板。選擇轉(zhuǎn)化細(xì)菌的菌落進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)和質(zhì)粒制備。證實(shí)存在正確方向的合成DNA。
然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)乳桿菌菌種如L.acidophilus的細(xì)菌宿主細(xì)胞中。通過載體序列中的選擇標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，肽的分泌可通過進(jìn)行Western印跡、進(jìn)行存在于培養(yǎng)基中的肽的凝膠電泳和其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)證實(shí)。選擇細(xì)菌轉(zhuǎn)化菌落并用于制備基因工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)物。培養(yǎng)表達(dá)所需肽的基因工程菌的培養(yǎng)物并將其至少一部分給予宿主生物體的消化道、陰道、氣管或該細(xì)菌可在其中復(fù)制的其它區(qū)域。如果需要，可以各種方式處理細(xì)菌培養(yǎng)物以產(chǎn)生由宿主腸道吸收的補(bǔ)劑。這些處理包括凍干或其它保存細(xì)菌的方法，另外可將細(xì)菌與載體試劑如溶液、溶劑、分散介質(zhì)、緩釋劑、乳液等組合。這些試劑制備補(bǔ)劑的用途是本領(lǐng)域熟知的。例如，細(xì)菌可用于制備酸奶產(chǎn)品或其它食品供人類消費(fèi)，從而表達(dá)肽的微生物寄居在人消化道中。將乳酸菌的特殊菌株摻入食品如酸奶、泡菜、乳酪和奶油的各種不同方法參見美國(guó)專利6,036,952，其引入本文作參考。通過任一種途徑攝入細(xì)菌后，工程菌可寄居在消化道中使得經(jīng)消化道的粘膜層呈遞和/或吸收本發(fā)明肽。
實(shí)施例2經(jīng)基因工程形式的枯草芽孢桿菌輸送肽以下提供了將本發(fā)明肽輸送至如上所述宿主中的一個(gè)舉例方法。編碼表A中所列的一個(gè)肽的DNA序列經(jīng)化學(xué)方法合成，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)將這一DNA序列號(hào)入一表達(dá)載體中。所選的表達(dá)載體包括穿梭載體，如pTZ18R(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中均能繁殖并含有抗生素抗性基因以選擇轉(zhuǎn)化菌落。這一載體可以含有在枯草芽孢桿菌中有活性的啟動(dòng)子，如衍生自枯草芽孢桿菌SscB基因的啟動(dòng)子，以及編碼在枯草芽孢桿菌中有活性的信號(hào)或前導(dǎo)肽的核苷酸序列，該信號(hào)或前導(dǎo)肽指導(dǎo)表達(dá)的異源蛋白從細(xì)菌細(xì)胞中有效輸出。這種載體的一個(gè)例子參見美國(guó)專利6,268,169，其引入本文作參考。簡(jiǎn)要地，如上所述，以本領(lǐng)域熟知的技術(shù)合成具有限制酶位點(diǎn)和/或促進(jìn)DNA克隆的其它序列的編碼本發(fā)明肽的DNA。在轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌、鋪板、選擇和繁殖質(zhì)料產(chǎn)生質(zhì)粒原液后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌，并根據(jù)對(duì)鋪板培養(yǎng)基中的抗生素的抗性選擇轉(zhuǎn)化子。
用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)如在SDS-PAGE分析或Western印跡后放射標(biāo)記肽以放射自顯影來證實(shí)基因工程枯草芽孢桿菌對(duì)肽的產(chǎn)生和分泌。
培養(yǎng)表達(dá)所需肽的基因工程菌的培養(yǎng)物并將其至少一部分給予宿主生物體的消化道、陰道、氣管或該細(xì)菌可在其中復(fù)制的其它區(qū)域。
實(shí)施例3經(jīng)基因工程糖酵母菌種輸送肽以下提供了將本發(fā)明肽輸送至如上所述宿主中的一個(gè)舉例方法。編碼表A中所列的一個(gè)肽的DNA序列經(jīng)化學(xué)方法合成，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)將這一DNA序列導(dǎo)入一表達(dá)載體中。所選的表達(dá)載體包括一穩(wěn)定維持的酵母蛋白表達(dá)載體，包括組成型酵母啟動(dòng)子如pADH1，使載體在酵母和大腸桿菌中均能復(fù)制的位點(diǎn)，賦予營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母突變體以原養(yǎng)型的用于選擇目的的一個(gè)或多個(gè)基因，多克隆位點(diǎn)(MCS)，以及如果需要的編碼信號(hào)肽的序列。這種載體是市售的并是本領(lǐng)域熟知的或者可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建。在將合成DNA插入酵母載體、轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌、在選擇培養(yǎng)基上鋪板轉(zhuǎn)化的大腸桿菌、選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌落并從所述菌落的細(xì)菌培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA后，將載體經(jīng)熟知技術(shù)如乙酸鋰轉(zhuǎn)化或電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)啤酒糖酵母。選擇用于轉(zhuǎn)化的啤酒糖酵母菌株是突變的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，其需要質(zhì)粒上的一種基因以在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。通過將酵母在缺少該載體上提供的基因的培養(yǎng)基上鋪板而選擇轉(zhuǎn)化的酵母菌落。只有接受的載體及其選擇基因并表達(dá)該基因產(chǎn)物的酵母可在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成菌落。通過進(jìn)行Westem印跡、存在于培養(yǎng)基中的肽的凝膠電泳或其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以證實(shí)肽的表達(dá)。
選擇酵母轉(zhuǎn)化菌落并用于制備大規(guī)模培養(yǎng)物。培養(yǎng)表達(dá)所需肽的基因工程酵母的培養(yǎng)物并將其至少一部分給予宿主生物體的消化道、陰道、氣管或該酵母可在其中復(fù)制的其它區(qū)域。如果需要，可以各種方式處理酵母培養(yǎng)物以產(chǎn)生由宿主腸道吸收的補(bǔ)劑。這些處理包括凍干或其它保存酵母的方法，另外可將酵母與載體試劑如溶液、溶劑、分散介質(zhì)、緩釋劑、乳液等組合。這些試劑制備補(bǔ)劑的用途是本領(lǐng)域熟知的。在另一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化的酵母可用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備食品如發(fā)酵奶制品如酸奶和kefir。與這些食品中的活乳酸菌培養(yǎng)物一樣，轉(zhuǎn)化的酵母至少短時(shí)寄居在消化道中，并經(jīng)消化道腔將肽提供給宿主。
實(shí)施例4將肽定位到特定的區(qū)域下文提供了一種選擇性地將本發(fā)明的肽遞送到特定區(qū)室、器官、細(xì)胞類型或體內(nèi)特定區(qū)域的典型方法。在這一例子中，通過將YSV定位到個(gè)體的腎臟內(nèi)組織來治療腎炎。YSV經(jīng)由本領(lǐng)域所公知的化學(xué)反應(yīng)通過共價(jià)鍵與低分子量(loW molecular weight，簡(jiǎn)稱LMW)溶菌酶(lysozyme)——一種特異地集中在腎臟組織的可通過商業(yè)途徑獲得的蛋白部分——相連。實(shí)現(xiàn)分子與LMW溶菌酶結(jié)合的技術(shù)已有文獻(xiàn)公開(Folgertet al.，Br.J.Pharmcology，1361107，2002)。將蛋白或肽與另一個(gè)相連的常用技術(shù)在所屬領(lǐng)域的文獻(xiàn)中也已公開(Fischer et al.，Bioconj.Chem.，12825，2001)。然后，新構(gòu)建的結(jié)合肽樣品通過氣相色譜(chromotography)方法，例如陽(yáng)離子交換FPLC和/或梯度離心法從連接過程中所使用的化學(xué)試劑中被純化。一旦被純化，該結(jié)合肽給予需要治療腎炎的個(gè)體。對(duì)于抗腎炎活性，依靠YSV與LMW溶菌酶之間的連接，其會(huì)被腎的近端小管(proximaltubule)細(xì)胞選擇性吸收和代謝，YSV被優(yōu)先定位到腎臟組織。與相同摩爾數(shù)量的YSV自身相比較，這種優(yōu)先遞送形成更強(qiáng)的抗腎炎作用。相反地，這能減少為達(dá)到抗腎炎活性的某一水平的肽藥物的量。
實(shí)施例5增強(qiáng)肽到其活性位點(diǎn)的遞送下文提供了一種增強(qiáng)神經(jīng)活性肽(neuroactive peptide)遞送到腦的典型的方法。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的化學(xué)方法合成本發(fā)明的一種的肽，其由腦的神經(jīng)細(xì)胞所表達(dá)并在受體上發(fā)揮作用?；蛘撸部捎晒こ涛⑸锉磉_(dá)并從這些生物體的培養(yǎng)物中回收得到，如上文實(shí)施例中所描述的那樣。一旦以純化的形式獲得，這種肽被用于一系列的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，來構(gòu)建一個(gè)甘油三酸酯(triglyceride ester)結(jié)合部分，連接到該肽。該結(jié)合部分包括一個(gè)四位取代的碳中心，其通過一個(gè)胺鍵連接到肽的末端羧基碳而與本發(fā)明的肽相連接。附著在四位碳中心的另外三個(gè)基團(tuán)包括與16碳脂肪酸鏈的碳酯聯(lián)接。脂肪酸鏈自身末端帶有被認(rèn)為是肽修飾的二肽基團(tuán)，其增加了鏈的親水性并將它們特異性地定位于血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞膜。這一合成過程在Patel etal.，Bioconjugate Chem.，8(3)434，1997中進(jìn)行了詳細(xì)說明，并利用了本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的常用試劑與設(shè)備。
一旦導(dǎo)入到個(gè)體外圍區(qū)域，該化合物經(jīng)由循環(huán)系統(tǒng)在全身轉(zhuǎn)運(yùn)，與血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞膜相互作用。在分子跨越血腦屏障的上皮層的運(yùn)輸過程中，二肽修飾及脂鏈的逐步降解導(dǎo)致本發(fā)明的肽釋放到腦區(qū)室中。在那兒，肽可與神經(jīng)細(xì)胞表面的受體相互作用來發(fā)揮其對(duì)腦功能的影響作用。藥物到達(dá)血腦屏障以及被運(yùn)輸?shù)侥X所需的時(shí)間，以及攜帶部分(carrier moiety)伴隨的降解，改變了藥物活力的動(dòng)力學(xué)，與游離肽的腦室注射相比較，形成一個(gè)更穩(wěn)定更長(zhǎng)時(shí)間釋放的效果。
實(shí)施例6構(gòu)建抗酶降解的肽配方下文提供了一種構(gòu)建用于口服給藥的生物活性肽的配方的典型方法，其可抗在消化道表面內(nèi)部以及沿著消化道表面所發(fā)現(xiàn)的蛋白酶及肽酶活性。在這個(gè)例子中，YSV被用于制備對(duì)病人進(jìn)行口服形式給藥的藥物配方。如Larionova等人所描述的那樣(Iht.J.Pharma.，189171，1999)，肽被用于與可溶性淀粉以及蛋白酶抑制劑----抑酶肽(aprotinin)，一起制備微粒，抑酶肽是一種由細(xì)胞腔分泌以及刷狀緣(brush border)膜結(jié)合的多種蛋白酶的強(qiáng)烈的抑制劑。簡(jiǎn)單地說，可溶性淀粉，蛋白酶抑制劑抑酶肽以及本發(fā)明的肽溶解在一緩沖液中。可溶性淀粉，aprotinin肽的比例可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的實(shí)驗(yàn)方法確定，例如，Larionova等人利用體外模擬消化試驗(yàn)來決定對(duì)他們研究中所用的肽最有效的比例以及預(yù)備條件。水溶液在含有5％Span-80(一種非離子表面活性劑)的環(huán)已烷中(比例1∶3，v/v)，在機(jī)械振動(dòng)的條件下被乳化。對(duì)苯二酰氯(terephthaloyl chloride)的氯仿溶液被加入到乳化液中，繼續(xù)攪拌30分鐘，在這期間淀粉分子與aprotinin以及肽發(fā)生交聯(lián)。在那個(gè)過程中所制備的微粒用環(huán)已烷，95％乙醇溶液與2％v/vTween85去污劑，95％乙醇及水依次洗滌。微粒在水中重懸浮并凍干。凍干的化合物可被置于明膠膠囊中，用于需要治療的個(gè)體的口服給藥。
一旦被消化吸收后，化合物隨著明膠膠囊的溶解被釋放。微粒在小腸中通過α淀粉酶對(duì)淀粉分子的活性而被分解，導(dǎo)致aprotinin以及本發(fā)明的肽的逐步釋放。有效的蛋白酶抑制劑aprotinin在與肽相同的時(shí)間和位置協(xié)同釋放，減少了肽的酶降解，并增加了從腸膜吸收獲得的完整肽的比例雖然本發(fā)明用上述的方法和數(shù)據(jù)以及YSV的特定的實(shí)施例來描述，但可以理解的是，這僅僅是舉例而不能作為對(duì)本發(fā)明的限制。同樣可被理解的是YSV代表了本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的相同的原則也可應(yīng)用于YSV的被修飾但未影響生物學(xué)功能的其它功能等同的肽。例如，YSV的等同肽包括那些具有保守的氨基酸取代基(即，Y、S或V中的一個(gè)被具有處于同樣的生化類型，例如疏水性、親水性，正電或負(fù)電基團(tuán)的殘基的另一個(gè)氨基酸所取代)。YSV等同肽的另一個(gè)例子是一個(gè)更長(zhǎng)一些的肽，比如長(zhǎng)一個(gè)或兩個(gè)氨基酸，能保持同樣的生物學(xué)活性。
權(quán)利要求
1.一種分離或純化的肽，所述肽包含酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸。
2.如權(quán)利要求1所述的分離或純化的肽，所述肽由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽組成。
3.如權(quán)利要求2所述的分離或純化的肽，所述肽由L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-纈氨酸三肽組成。
4.如權(quán)利要求2所述的分離或純化的肽在制備調(diào)節(jié)免疫活性藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求2所述的分離或純化的肽在制備刺激T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化藥物中的應(yīng)用
6.如權(quán)利要求2所述的分離或純化的肽在制備調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖紊亂藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求所述6所述的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞增殖紊亂是癌癥。
8.如權(quán)利要求所述7所述的應(yīng)用，其中所述癌癥選自肝癌、白血病、肺癌、黑素瘤或?qū)m頸癌。
9.如權(quán)利要求2或3所述的分離或純化的肽在制備營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑中的應(yīng)用。
10.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含由酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽組成的三肽。
11.一種制備權(quán)利要求10所述的藥物組合物的方法，包括將所述三肽與藥物學(xué)可接受載體混合。
12.一種包含酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽的增效的衍生物，所述增效的衍生物包括連接在酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽上的增效的分子，所述增效的分子限于增強(qiáng)所述三肽在免疫響應(yīng)的調(diào)節(jié)作用、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激作用、細(xì)胞增殖紊亂的調(diào)節(jié)作用、癌癥生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用、肝癌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用、白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用、宮頸癌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用、肺癌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用以及黑素瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用中的療效。
13.一種包含酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽的增效的衍生物，所述增效的衍生物包括連接在酪氨酰-絲氨酰-纈氨酸三肽上的增效的分子，所述增效的分子限于增強(qiáng)所述三肽作為營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑的效果。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含酪氨酰－絲氨酰－纈氨酸的生物活性肽及其用途。同時(shí)還公開了制備藥物組合物的方法，所述方法包括提供酪氨酰－絲氨酰－纈氨酸三肽并將其與藥學(xué)上可接受的載體混合。
文檔編號(hào)C07K5/087GK1982329SQ20061012626
公開日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2004年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月26日
發(fā)明者王偉明, 林剛 申請(qǐng)人:一泰醫(yī)藥研究(深圳)有限公司