專(zhuān)利名稱(chēng)：一個(gè)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的shRNA及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一個(gè)能通過(guò)RNA干擾途徑特異降 低細(xì)胞內(nèi)^ferc-7基因表達(dá)量的發(fā)夾型小干擾RNA (命名為shHGRC-l) 的序列；以及利用這種發(fā)夾型小干擾RNA (shRNA)對(duì)餘2r-7基因進(jìn)行 特異性干擾后引起細(xì)胞凋亡的作用，尤其是引起乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7) 調(diào)亡的作用；本發(fā)明還涉及到該發(fā)夾型RNA在殺傷乳腺癌細(xì)胞、誘導(dǎo)癌 細(xì)胞凋亡方面的用途。
背景技術(shù)：
^^r-7基因是通過(guò)對(duì)某先天性靜脈畸開(kāi)肥大綜合征(KTS)病例染 色體平衡易位點(diǎn)附近進(jìn)行EST篩査時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的非編碼RNA基因， 在胎兒和成人的心、肝、脾等多種組織中均有持續(xù)廣泛的表達(dá)。該基因 位于8號(hào)染色體長(zhǎng)臂，全長(zhǎng)873bp(見(jiàn)附圖1)，經(jīng)分析沒(méi)有長(zhǎng)的讀碼框， 是一個(gè)以RNA起作用的基因。該基因可能早期血管的發(fā)生與生成有關(guān)系， 可能會(huì)影響細(xì)胞的增殖與凋亡。
RNA干擾技術(shù)(RNA interference,簡(jiǎn)稱(chēng)RNAi)是通過(guò)小分子雙鏈 RNA (dsRNA)特異性互補(bǔ)耙向基因轉(zhuǎn)錄本，從而誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后沉默的 一種技術(shù)。人工合成或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成的小的雙鏈RNA (siRNA)或者 發(fā)夾型RNA (shRNA)進(jìn)入細(xì)胞后，能和與之互補(bǔ)的靶基因信使RNA結(jié)合， 從而介導(dǎo)特異性的切割酶將信使RNA降解，達(dá)到降低目的基因表達(dá)的目 的。RNA干擾的效應(yīng)的關(guān)鍵在于耙基因序列的選取，不同位點(diǎn)的選取， 其效果差異很大。這種高度序列特異性使其能夠?qū)Ｒ惶禺惖亟档湍骋换?因的表達(dá)。己證實(shí)，RNA干擾可單獨(dú)或與其他現(xiàn)有的治療手段一同用于 疾病的治療，如抗病毒感染、腫瘤治療等。(參考文獻(xiàn)(l)Andrew Fire, at al，Potent and specificgenetic interference by double—
strandedRNAin Cae/7ar/ aMz."51 e2e卵7 s, Nature 391, 806—811. (2) Carolyn Napoli, Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes // trans The Plant Cell, Vol. 2， 279-289，)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的shRNA及其用途，該 shRNA能夠促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，本發(fā)明還提供了該shRNA的用途。
本發(fā)明提供的一種促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的shRNA，其特征在于，其堿基序列 如SEQ ID No. 1所示，即5' -GGAUCAGACA GAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCU GAUCC -3。
該shRNA可以應(yīng)用于抑制癌細(xì)胞增殖的藥中。
本發(fā)明提供了一種可以特異性抑制人^ferc-7基因表達(dá)的發(fā)夾型干擾 RNA (shHGRC-l)。該發(fā)夾型干擾RNA具有以下序列5' -GGAUCAGACA GAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCU GAUCC _3' (SEQ ID No. 1)針對(duì)耙序列 是Hgrc-lRNA序列中為AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG(SEQ ID No.2)的序列。本 發(fā)明還提供了編碼該shRNA的DNA序列，以及包含該編碼序列的質(zhì)粒，利 用該質(zhì)粒可以直接在細(xì)胞中，或者在體外生成shHGRC-l。本發(fā)明還證明了 該發(fā)夾型干擾RNA (shHGRC-1)在進(jìn)入人乳腺癌細(xì)胞系中后，^ferc-7表達(dá) 量被降低，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)PI單染檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋 亡增加，細(xì)胞周期沒(méi)有明顯改變。這說(shuō)明shHGRC-l在下調(diào)了乳腺癌細(xì)胞中 ^ferc-7基因的表達(dá)后，會(huì)癌細(xì)胞的凋亡，可以起到殺傷癌細(xì)胞的作用，具 有潛在的治療癌癥的價(jià)值。


附圖1顯示i^rc-7基因的基因組結(jié)構(gòu)和差異剪接方式；
附圖2顯示通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證人各種組織和不同細(xì)胞系中#5rc-7的表達(dá)，(a)為胃組織、腦組織和胃癌組織的表達(dá)，(b) MCF-7和HELA細(xì)胞 的表達(dá)，(c)主動(dòng)脈、靜脈和血細(xì)胞的表達(dá)，(d)胎兒心臟和腎臟等組 織的表達(dá)；
附圖3顯示RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建；
附圖4顯示RNA干擾MCF-7細(xì)胞i^rc-7后其表達(dá)量(圖中干擾質(zhì)粒 子3為本發(fā)明中pGenesil-1- Hgrc-l質(zhì)粒); 附圖5對(duì)MCF-7細(xì)胞針對(duì)^ferc^基因進(jìn)行RNA干擾后細(xì)胞凋亡情 況(圖中干擾質(zhì)粒子3為本發(fā)明中pGenesil-1- Hgrc-l質(zhì)粒)。
具體實(shí)施例方式
vferc-7基因全長(zhǎng)由華中科技大學(xué)人類(lèi)基因組研究中心首先獲得，該基 因的部分EST序列見(jiàn)Genebank中AI218163. 1， AI143880, 1， AI028191. 1， AI015296.1。
本發(fā)明提供的通過(guò)RNA干擾途徑能特異性降低細(xì)胞內(nèi)Hgrc-1量的發(fā)夾 型RNA ( shRNA )，具有如SEQ ID No. 1所示序列5 ' -GGAUCAGACA GAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCU GAUCC -3'。更具體地，它針對(duì)的耙序 列是^rc-7基因RNA序列中為AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG(如SEQ ID No. 2) 的序列。
上述shRNA能通過(guò)下述二條DNA寡核苷酸鏈體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成 5' -GGATCAGACAGAGCCATGTTCAAGACGCATGGCTCTCTCTGATCC-3'(如SEQ ID No. 3)
5 ' -GGATCAGAGAGAGCCATGCGTCTTGAACATGGCTCTGTCTGATCC-3 ' (SEQ ID No. 4。該序列是SEQ ID No.3所述核苷酸序列的互補(bǔ)鏈序列。
包含上述SEQ ID No. 3和4所述DNA序列的質(zhì)粒均能夠在體內(nèi)或者體 外通過(guò)轉(zhuǎn)錄生成如SEQ ID No. 1所述序列的RNA。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)說(shuō)明，這些實(shí)施例僅 用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列事實(shí)例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)
驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring harbor Ubortory Press, 1989), 分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(第三版，科學(xué)出版社，2002)中所述的條件， 或按照生產(chǎn)廠商所建議的條件。
實(shí)施例1
RT-PCR檢測(cè))^rc-J基因在人不同組織以及幾種人源性細(xì)胞系中的表達(dá)
1、 RNA提取
用Trizol(Irwitrogene)分別提取六月齡人胎心臟、肝、脾、肺、腎、 小腸、卵巢、軟骨、主動(dòng)脈、臍靜脈、視網(wǎng)膜組織，以及成人主動(dòng)脈、成 人血細(xì)胞、成人靜脈、成人腦組織、正常胃組織、胃癌組織的總RNA，具體 步驟如下，50 —l 00mg組織加lmlTrizol ，勻漿后室溫放置lOmin ，加 入0 . 2ml氯仿/ lmlTrizol ，劇烈震蕩15秒，取上層水相移入一新的 EP管，加入0. 5ml/lmlTrizol異丙醇，室溫放置15min，然后4。C12000g 離心15min,去除上清后加lml75W用DEPC處理水配制的乙醇洗滌一次，然 后7500g離心10min，去除上清后空氣中干燥30min，加30ulDEPC處理水 溶解，紫外分光光度計(jì)下OD260/280接近2.0，于-8(TC保存?zhèn)溆谩Ｈ巳橄?癌細(xì)胞系(MCF-7)于DMEM高糖培養(yǎng)基(Invitrogen)，109()胎牛血清(Hyclone) 中鋪板培養(yǎng)48小時(shí)后，6孔板每孔lmnVizol裂解細(xì)胞，其后步驟同上。
2、 逆轉(zhuǎn)錄
逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行(Promega)，具體如下取7ul步 驟1提取的RNA，加入lul Oligo d (T) 15， 5ulDEPC處理水，72。C保溫10min 后置于冰上。然后加入4ul5 XM-MLV buffer, luldNTP (10mM)， 200L[M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，40URNA酶抑制劑，42。C保溫60min。之后94。C變性10min，冰 上放置10min。
3、 PCR驗(yàn)證各個(gè)組織逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中Hgrc-l的表達(dá)
取步驟2中逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，稀釋5倍作為PCR模版。以寡核苷酸D: 5' -GCGGATAATACAAGCCAAGTT -3'為正向引物，以寡核苷酸E: 5' -TGATGGATAATGTGCACTTGAGA -3'為反向引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。D/E PCR 反應(yīng)的條件為94。C4min,隨之94°C30秒，55°C30秒和72°C50秒進(jìn)行
35個(gè)循環(huán)，最后72i:延伸7min，所得產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果凝 膠成像系統(tǒng)拍照記錄。結(jié)果見(jiàn)附圖2。結(jié)果顯示，在胎兒的心、肝、脾、 肺、腎、血管、視網(wǎng)膜、卵巢、軟骨、脊髓等組織中有表達(dá)，在皮膚和
骨骼肌組織中表達(dá)量極低或不表達(dá)。在成人的動(dòng)脈、靜脈、血細(xì)胞、正 常胃組織、胃腫瘤組織中均有表達(dá)，在MCF-7和HELA細(xì)胞中也有表達(dá)。 (表l)
表1:胎兒和成人不同組織以及細(xì)胞系中Hgrc-l基因的表達(dá)
組織類(lèi)型表達(dá)情況
胎心臟表達(dá)
胎視網(wǎng)膜表達(dá)
胎脾臟表達(dá)
胎腎臟表達(dá)
胎卵巢表達(dá)
胎軟骨表達(dá)
胎血管表達(dá)
胎肺表達(dá)
胎脊髓表達(dá)
胎肝表達(dá)
胎皮膚不表達(dá)
胎骨骼肌不表達(dá)
成人動(dòng)脈表達(dá)
成人靜脈表達(dá)
成人胃組織表達(dá)
胃腫瘤組織表達(dá)
MCF-7細(xì)胞表達(dá)
HELA細(xì)胞表達(dá)
實(shí)施例2
降低Hgrc-l基因表達(dá)的RNA干擾靶點(diǎn)的選擇、設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)人Hgrc-l基因的mRNA序列，借助Ambion公司在網(wǎng)上提供的siRNA
工具軟件選擇下述靶點(diǎn)序列，并根據(jù)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的shRNA系列結(jié)構(gòu)
及其編碼序列。序列如下
靶點(diǎn)序列5'-AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG-3' (SEQ ID No. 2)
shRNA序歹U: 5'-GGAUCAGACAGAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCUGAUCC-3'
(SEQ ID No. 1)
編碼s國(guó)A的DNA序列為(SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4):
5' -GGATCAGACAGAGCCATGTTCAAGACGCATGGCTCTCTCTGATCC-3'和5' -GGATCAGAGAGAGCCATGCGTCTTGAACATGGCTCTGTCTGATCC-3。
根據(jù)以上序列，使用美國(guó)ABI公司392型DNA/RNA合成儀合成SEQ ID No. 1所示的RNA,以及SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的DNA，并且在兩端 加上BamH I和Xma I的酶切位點(diǎn)，之后將合成的的SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4 DNA寡核苷酸鏈用水稀釋到lOOmM，各取5ul混和，94'C變性5分鐘后，于60 °。退火15分鐘.然后將退火產(chǎn)物和空的pGenesil-1質(zhì)粒(由武漢晶賽生物 工程有限公司提供)用BamH I和Xma I (NEB)進(jìn)行雙酶切，純化酶切產(chǎn)物，各 取4ul用T4 DNA連接酶(NEB)連接，取連接產(chǎn)物涂LB培養(yǎng)基平板，抗生素為 卡那霉素,濃度為50ug/ml。 37t:培養(yǎng)14小時(shí)后挑取陽(yáng)性克隆搖菌，提取質(zhì) 粒，并測(cè)序驗(yàn)證。
實(shí)施例3
應(yīng)用RNA干擾對(duì)乳腺癌細(xì)胞Hgrc-l基因表達(dá)進(jìn)行特異性干擾
1.對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7) Hgrc-l進(jìn)行RNA干擾
將能轉(zhuǎn)錄生成針對(duì)Hgrc-1的shRNA的pGenesil-l- Hgrc-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 進(jìn)入MCF-7細(xì)胞。具體步驟如下將MCF-7細(xì)胞鋪板于6孔板中，密度為5 Xl()5個(gè)細(xì)胞每孔，培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基(Invitrogen)，含10%胎牛 血清(Hyclone)， 100單位/ml氨芐青霉素，100mg/ml硫酸鏈霉素，37°C， 5%0)2條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，去除培養(yǎng)基，用2ml無(wú)血清無(wú)抗生素的OPTI-MEM (Gibco)培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24小時(shí)。同一板上以一個(gè)孔只加 10ulLipofectamine2000作為空白對(duì)照， 一個(gè)孔以含有無(wú)關(guān)序列的 pGenesil-l質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。 一孔轉(zhuǎn)染pGenesil-1-Hgrc-1質(zhì)粒，另取 3孔轉(zhuǎn)染3個(gè)也是針對(duì)Hgrc-l基因的干擾質(zhì)粒作為對(duì)照(但已經(jīng)證明這三 個(gè)干擾質(zhì)粒沒(méi)有干擾效果)。每孔4ug質(zhì)粒DNA， 10ulLipofectamine2000 (Invitrogen)分別溶于250ulOPTI-MEM培養(yǎng)基中，并混合。保溫20min 后將500ul混合物加入到每個(gè)孔中。干擾試驗(yàn)重復(fù)三次。
2. 干擾載體轉(zhuǎn)錄后干擾效果檢測(cè)
pGenesil-l載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，可以表達(dá)生成綠色熒光蛋白 (EGFP)，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)有綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞數(shù)， 以確定轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)染效率約為70%。然后取各孔細(xì)胞提取RNA， 逆轉(zhuǎn)錄后RT-PCR檢測(cè)Hgrc-l表達(dá)，并以管家基因0 -Actin作為內(nèi)參比 較RNA干擾對(duì)降低Hgrc-1表達(dá)的效果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染特異性干擾質(zhì) 粒的的MCF-7細(xì)胞Hgrc-1表達(dá)量相對(duì)空白對(duì)照和陰性對(duì)照明顯減少， 其中pGenesil-l- Hgrc-l最為明顯(附圖4)。
3、 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)PI單染檢測(cè)MCF-7細(xì)胞Hgrc-l基因RNA干擾后凋 亡情況
取如步驟1中轉(zhuǎn)染了干擾質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒的MCF-7， PBS洗滌2次后， 75%冷乙醇固定24小時(shí)，然后PBS洗滌1次，加RNaseA (Sigma) 37。C消化 60min， RNaseA終濃度為50ug/ml。然后用碘化丙錠(PI)溶液(以PBS配 置)染色15min，之后用FACSORT流式細(xì)胞儀(BD biosciences)分析，激 發(fā)激光波長(zhǎng)為488nm,分析PI熒光強(qiáng)度，結(jié)果用CELL QUEST軟件分析獲 得DNA量參數(shù)圖像(如附圖5)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的細(xì)胞凋亡比例 明顯大于空白對(duì)照和陰性對(duì)照，pGenesil-1- Hgrc-1最為明顯，凋亡率達(dá) 到37. 10%。這一結(jié)果表明shHGRC-1能有效降低細(xì)胞內(nèi)餘/r-7的表達(dá)，并誘 導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，具有在抑制癌細(xì)胞增殖的藥中的應(yīng)用。序列表
<110〉華中科技大學(xué)
〈120> —個(gè)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的shRNA及其用途 <160〉 4
〈170〉 Patentln Version 3.1
〈210〉 1 〈211〉 45 <212>RNA
〈213〉智人(Homo Sapiens) 〈400〉 1
ggacagacag agccagcaag acgcaggccc cgacc
〈210〉 2 <211> 21 <212>RNA
〈213〉智人(Homo Sapiens) 〈400〉 2
aaggaucaga cagagccaau g
<210> 3 〈211> 45 〈212> DNA
<213>智人(Homo Sapiens) 〈400〉 3
ggatcagaca gagccatgtt caagacgcat ggctctctct gatcc
〈210〉 4 <211> 45<212>腿
<213〉智人(Homo Sapiens) <400> 4
ggatcagaga gagccatgc gtcttgaaca tggctctgtc tgatcc
權(quán)利要求
1、一種促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的shRNA，其特征在于，其堿基序列如SEQ IDNo.1所示，即5’-GGAUCAGACA GAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCU GAUCC-3’。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述shRNA，其特征在于其針對(duì)的耙序列如SEQ ID No. 2所示，B卩AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的shRNA，其特征在于該shRNA通過(guò)如 SEQ ID No. 3或4所示的DNA寡核苷酸鏈轉(zhuǎn)錄生成，即5 ' -GGATCAGACAGAGCCATGTTCAAGACGCATGGCTCTCTCTGATCC-3'，或5' -GGATCAGAG AGAGCCATGCGTCTTGAACATGGCTCTGTCTGATCC-3'。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的shRNA，其特征在于該shRNA通過(guò)包 含如SEQ ID No. 3或4所示的DNA寡核苷酸鏈的質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄生成。
5、 一種權(quán)利要求1所述的shRNA的用途，其特征在于該shRNA在抑 制癌細(xì)胞增殖的藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的shRNA，其堿基序列為5’-GGAUCAGACAGAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCUGAUCC-3’。該shRNA針對(duì)的靶序列為AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG。該shRNA通過(guò)下述DNA寡核苷酸鏈之一轉(zhuǎn)錄生成，5’-GGATCAGACAGAGCCATGTTCAAGACGCATGGCTCTCTCTGATCC-3’，或5’-GGATCAGAGAGAGCCATGCGTCTTGAACATGGCTCTGTCTGATCC-3’。這段shRNA能夠通過(guò)RNA干擾途徑(RNAi)，特異性降低人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)中一個(gè)非編碼RNA基因HGRC-1的表達(dá)，從而明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的凋亡。在用途上，該發(fā)卡型小RNA能用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，殺傷癌細(xì)胞，可以應(yīng)用于抑制癌細(xì)胞增殖的藥中。
文檔編號(hào)C07H21/00GK101200482SQ20061012548
公開(kāi)日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者翔 任, 劉木根, 劉靜宇, 徐承啟, 鐵 柯, 欣 涂, 擎 王 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)