專利名稱：：治療性促凋亡bh3樣分子和用于產(chǎn)生和/或選擇它的方法治療性促凋亡BH3樣分子和用于產(chǎn)生和/或選擇它的方法發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明通常涉及用于調(diào)節(jié)靶細(xì)胞或細(xì)胞群體中的凋亡的治療性分子。更特別地，本發(fā)明提供了抑制促存活分子的和能夠誘導(dǎo)或促進(jìn)靶細(xì)胞或細(xì)胞群體例如癌細(xì)胞的凋亡的治療劑。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生或選擇該治療分子和包含所述治療分子的藥物組合物的方法?，F(xiàn)有技術(shù)的描述-說明書中參考的現(xiàn)^孜盡不7反和不膽當(dāng)眠當(dāng)1T町"^任何國(guó)家形成了共同的一般知識(shí)的承認(rèn)或任何形式的暗示。本申請(qǐng)中提供的資料的詳細(xì)目錄列于本申請(qǐng)書的結(jié)尾。癌癥是發(fā)達(dá)國(guó)家中的第二大死亡原因。除了它使患者和其家庭遭受痛苦外，其也是治療花費(fèi)最昂貴的疾病之一(Zhang，#WWeK//"or厶101-102，2002)。因此，雖然對(duì)人生活產(chǎn)生極大的代價(jià)，但如果考慮到治療費(fèi)用和減少的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)率的代價(jià)，對(duì)社會(huì)的年經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)預(yù)期到2010年時(shí)大約為2000至50D0億美元。對(duì)編程性細(xì)胞死亡(凋亡)的千擾是許多主要疾病包括癌癥的發(fā)展中的中心步驟。凋亡的至關(guān)重要的調(diào)節(jié)物的一個(gè)家族是Bcl-2蛋白家族。研究已顯示人濾泡性淋巴瘤中增強(qiáng)的Bcl-2家族的過度表達(dá)抑制了凋亡和促進(jìn)腫瘤發(fā)生(Vaux等人，Wfl"re440-442，1988;和Strasser等人，^"wre雄331-333，1990)。在高達(dá)90°/。的乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中發(fā)現(xiàn)Bcl-2的過度表達(dá)(Zhang，2002，同上)，所述癌癥代表了一些最常見的癌癥。Bel-2的促存活相關(guān)物也在許多腫瘤中過度表達(dá)。事實(shí)上，現(xiàn)已接受被削弱的凋亡為大多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生的中心步驟(Cory等人，iVa"e"a"cer么.647-656，2002)。被削弱的凋亡也是細(xì)胞毒性癌癥治療功效的主要障礙(Cory等人，2002，同上；Johnstone等人，Ce//153-164，2002)。大多數(shù)細(xì)胞毒性劑，包括許多化療藥物和放射性藥物，通過分子例如腫瘤抑制劑p53間接觸發(fā)凋亡(Cory等人，2002，同上)。然而，在大多數(shù)腫瘤中，p53途徑被失活，這阻止了啟始凋亡。因此p53功能的喪失或Bcl-2的過度表達(dá)可引發(fā)藥物抗性，是治療失敗的共同原因。促進(jìn)細(xì)胞存活的Bcl-2蛋白家族的成員，包括哺乳動(dòng)物Bcl-2、Bc卜Xl、Bcl-w、Mcl-l和Al,包含3或4個(gè)序列相似的BH(Bcl-2同源性)區(qū)，并且持續(xù)作用直至被其唯一的BH3only相關(guān)物中和。這些促細(xì)月包凋亡拮抗劑，包括哺乳動(dòng)物Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk、Bid和Noxa相互相關(guān)，并且是只被短的BH3結(jié)構(gòu)域識(shí)別的廣泛家族(Huang和Strasser，Ce777W:839-842，2000)。相反地，Bax和Bak(促細(xì)胞凋亡家族成員的亞組)與Bel-2共有3個(gè)BH結(jié)構(gòu)域，并且可能在胞內(nèi)膜的透化中具有基本的下游功能(Wei等人，Sc/e/2ce"么.727-730，2001)。BH3-only蛋白監(jiān)控細(xì)胞正常，而破壞信號(hào)觸發(fā)它們對(duì)促存活Bel-2樣蛋白的給合，從而起始細(xì)胞死亡(Cory等人，0/2coge"e":8590-8607，2003;Huang和Strasser，2000，同上)。其由轉(zhuǎn)錄信號(hào)(例如Bim、Puma、Noxa)或不同翻譯后機(jī)制(例如Bim、Braf、Bad、Bid)誘導(dǎo)的差異激活提供了一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特異性(Puthalakath等人，Ce〃/^7Ter久'505-512，2002)。然而，一旦被激活，通常認(rèn)為不同的BH3-only蛋白通過靶向所有促存活Bcl-2樣蛋白類似地起作用(Adams等人，6^2<^"ey77:2481-2495，2003;Cory等人.2003同上；Huang和Strasser,2000，同上)。直到最近其相互作用才得到系統(tǒng)性表征，少數(shù)研究局限于Bel-Xl或Bc卜2(Letai等人，Ce//么."3-192，2002;Petros等人，2000，同上；Sattler等人，1997，同上)?，F(xiàn)已出版了揭示一些BH3only蛋白是泛宿主性結(jié)合劑而其他為更具選擇性的結(jié)合劑的詳盡研究(Chen等人，Ce7/777.'393-403，2005)。確定不同的BH3-only蛋白和促存活家族成員是選擇性地相互作用還是泛宿主性地相互作用對(duì)于闡明細(xì)胞死亡啟動(dòng)的機(jī)制(Adams，2003，同上；Cory等人，2003，同上；Danial和Korsmeyer，Ce//"^;205-219，2004)是非常重要的并且對(duì)發(fā)展模擬BH3-only蛋白的作用、作為新抗癌藥的化合物的當(dāng)前努力是緊密相關(guān)的。根據(jù)對(duì)具有更少的毒性和更好的被靶向的抗癌療法的需要，存在對(duì)鑒定與Bcl-2樣蛋白相互作用以抑制其促存活功能的分子的明確需要。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)細(xì)胞或細(xì)胞群體的凋亡的分子。特別地，本發(fā)明提供了促存活分子的拮抗劑，特別是促存活Bcl-2蛋白家族的一個(gè)或多個(gè)成員的拮抗劑。受試促存活Bcl-2相互作用分子的產(chǎn)生和/或選擇基于BH3-only促凋亡蛋白內(nèi)的氨基酸殘基的鑒定，所述氨基酸殘基是發(fā)生BH3-only蛋白和促存活Bel-2蛋白之間的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合所必需的?？稍谂c其相互作用的促存活Bcl-2蛋白i普方面從功能上區(qū)分BH3-only蛋白。通過鑒定特定BH3-only蛋白與特定促存活Bcl-2蛋白之間發(fā)生結(jié)合所必需的氨基酸，可產(chǎn)生或選擇特異性與促存活Bcl-2蛋白相互作用和抑制其功能的拮抗劑。此類拮抗劑與耙細(xì)胞或細(xì)胞群的接觸阻止了促存活Bel-2蛋白的活性，從而在把細(xì)胞或耙細(xì)胞群體中誘導(dǎo)凋亡?？蛇x擇地，這些靶的鑒定導(dǎo)致用于抑制凋亡分子分子用于治療退行性疾病(degenerativedisease)。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及試劑，所述試劑拮抗特定促存活Bel-2蛋白，從而使得能夠在選擇的類型的細(xì)胞或細(xì)胞群體例如但不限于與癌細(xì)胞或過度增殖性疾病相關(guān)的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。特別地，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生促存活Bcl-2家族成員的方法，該方法包括步驟a.突變來自BH3-only促凋亡蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；b.將突變的BH3結(jié)構(gòu)域與促存活Bcl-2家族成員接觸；c.檢測(cè)突變的BH3結(jié)構(gòu)域與促存活Bcl-2家族成員之間的結(jié)合的存在，從而鑒定促凋亡蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域中與BH3結(jié)構(gòu)域和促存活Bel-2家族成員之間的結(jié)合相互作用相關(guān)的氨基酸殘基；和d.產(chǎn)生拮抗劑，其模擬在BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2蛋白之間發(fā)生結(jié)合所必需的氨基酸處的野生型BH3結(jié)構(gòu)域的。上述部分c)中的"檢測(cè)"包括通過促存活蛋白或促凋亡蛋白的效應(yīng)進(jìn)行的間接檢測(cè)和結(jié)合的直接檢測(cè)。方便地，所述拮抗劑是結(jié)合促存活蛋白并且抑制其功能的肽。因此，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述拮抗劑是基于經(jīng)修飾的BH3-only促凋亡蛋白的肽拮抗劑或肽模擬物。本發(fā)明的肽拮抗劑對(duì)于一種或多種促存活分子(包括但不限于Bcl-2、Bc1-Xl、Bc1-w、Mcl-l或Al)可以是特異性的。通過突變促凋亡蛋白例:ft口但不卩艮于Noxa、Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk和Bid中的一種或多種中的殘基來進(jìn)行拮抗劑的鑒定。在特定的實(shí)施方案中，從具有選自SEQIDN0s:1至10的BH3-only結(jié)構(gòu)域序列的促凋亡蛋白衍生本發(fā)明的拮抗劑，其中所述BH3-only結(jié)構(gòu)域在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)和/或在N和/或C末端部分具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失或添加。促凋亡分子的特定突變體包含選自下列的突變Bim:D1A、M2A、R3A、P4A、E5A、16A、W7A、18A、A9E、Q10A、E11A、L12A、R13A、R14A、115A、G16E、D17A、E18A、F19A、N20A、A21E、Y22A、Y23A、A24E、R25A和R26A;Bad:N1A、L2A、W3A、A4E、A5E、()6A、R7A、Y8A、G9E、R10A、E11A、L12A、R13A、R14A、M15A、S16E、D17A、E18A、F19A、V20A、D21A、S22A、F23A、K24A、K25A和G26E;Bid:Q1A、E2A、D3A、I4A、15A、R6A、N7A、18A、A9E、R10A、H1U、L12A、A13E、Q14A、V15A、G16E、D17A、S18A、M19A、D20A、R21A、S22A、123A、P24A、P25A和G26E;邁NoxaA:R1A、A2E、E3A、L4A、P5A、P6A、E7A、F8A、A9E、A10E、Q1U、L12A、R13A、K14A、115A、G16E、D17A、K18A、V19A、Y20A、C2U、T22A、W23A、S24A、A25E和D26ABak:P1A、S2A、S3A、T4A、M5A、G6E、Q7A、V8A、G9E、R10A、Q11A、L12A、A13E、I14A、115A、G16E、D17A、D18A、119A、N20A、R21A、R22A、Y23A、D24A、S25A和E26A。在上面的突變的目錄中，"XnY"代表在殘基編號(hào)n上用氨基酸殘基X置換氨基酸殘基Y。殘基編號(hào)對(duì)應(yīng)于BH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。對(duì)于任何給定的促凋亡分子，可存在一個(gè)或多個(gè)突變?？赏ㄟ^方法例如但不限于計(jì)算;f幾篩選方法(silicoscreening)、高通量化學(xué)篩選法、基于功能的篩選法或構(gòu)效關(guān)系法(structure-activityrelationship)產(chǎn)生促存活Bcl-2家族成員的拮抗劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以藥物形式例如藥物組合物方便地提供本發(fā)明的拮抗劑。本發(fā)明的拮抗劑特別適用于治療具有癌癥或過度增生性疾病或?qū)Πl(fā)生癌癥或過度增生性疾病易感的受試者。本發(fā)明的促存活分子包括但不限于Bc-2促存活家族蛋白的成員，包括但不限于Bcl-2、Bcl-XL、Bc卜W、Mc卜1和A1。在表l中提供了整個(gè)本說明書中使用的序列標(biāo)志符的概述。表l淨(jìng)W標(biāo)^存襯迷EDNO:描迷1BIM的BH3結(jié)構(gòu)域DMRPEIW1AQELRRIGDEFNAYYARR2Puma的BH3結(jié)構(gòu)域EEQWAREIGAQLRRMADDLNAQYERR3mBmf的BH3結(jié)構(gòu)域-HRAEVQIARKLQCIADQFHRLHTQ-4Bad的BH3結(jié)構(gòu)域NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKKG5Bik的BH3結(jié)構(gòu)域-MEGSDALALRLACIGDEMDVSLRAP6Hrk的BH3結(jié)構(gòu)域RSSAAQLTAARLKAIGDELHQRTMWR7Bid的BH3結(jié)構(gòu)域QEDHRNIARHLAQVGDSMDRSIPPO8Noxa的BH3結(jié)構(gòu)域:PAELEVECATQLRRFGDKLNFRQKLL9mNoxaA的BH3結(jié)構(gòu)域RAELPPEFAAQLRKIGDKVYCTWSAP10邁NoxaB的朋3結(jié)構(gòu)域-PADLKDECAQLRRIGDKVNLRQKLLN11Bak的BH3結(jié)構(gòu)域PSSTMGQVGRQLADGDDINRRYDSE序列的開始或末尾的"-"表示氨基酸殘基的缺失。發(fā)明詳述在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，要理解除非另外指出，本發(fā)明不限定于特定組分的制劑、生產(chǎn)方法、劑量或診斷方案等。也要理解，此處使用的術(shù)語只是為了描述特定的實(shí)施方案而不希望受到限定。除非上下文明確指出，單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包括復(fù)數(shù)。因此，例如，"aBH3-only蛋白"包括單個(gè)BH3-only蛋白也包括2個(gè)或更多個(gè)BH3-only蛋白；"an試劑"包括一種試劑，也包括2種或更多種試劑；"the制劑"包括單種制劑或多種制劑；等等。此處參考的所有科學(xué)引述、專利、專利申請(qǐng)和廠商技術(shù)說明書在此以其全文引用作為參考。序列的開始或結(jié)尾的"-"表示氨基酸殘基的缺失。BH3結(jié)構(gòu)域中的突變表示為"XnY",其中氨基酸殘基X在位點(diǎn)編號(hào)n上取代氨基酸殘基Y。在描述本發(fā)明和要求本發(fā)明的權(quán)利中，按照下面所示的定義使用下列術(shù)語。在整個(gè)說明書和其后的權(quán)利要求中，除非上下文需要，術(shù)語"包括"，和變化形式"包含"和"含有，，，理解為表示包括所述整體或步驟或整體或步驟的分組但不排除任何其他整體或步驟或整體或步驟的分組。術(shù)語"試劑"、"化合物"、"藥物活性劑"、"藥物"和"活性的"在此處可互換使用，表示誘導(dǎo)想要的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)。所述術(shù)語也包括其藥學(xué)上可接受的形式和藥學(xué)活性形式，包括但不限于鹽、酯、酰胺、前體藥物、活性代謝物、類似物等。在一個(gè)實(shí)施方案中想要的效應(yīng)是抑制或拮抗促存活分子，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在另一個(gè)實(shí)施方案中，想要的效應(yīng)是通過拮抗促凋亡分子來促進(jìn)細(xì)胞存活。"藥劑"、"藥物活性劑"、"藥物，，可包括兩種或更多種此類物質(zhì)例如兩種或更多種促存活拮抗劑的混合物。"混合物"也包括多部分混合物例如兩部分組合物，其中在分配之前分開地提供和分開地給予或分配所述藥劑或?qū)⑵浠旌显谝黄?。例如，多部分藥物包裝可具有分開保存的針對(duì)兩種或更多種促存活蛋白的兩種或更多種拮抗劑。包括使用促存活拮抗劑和抗癌劑(即化學(xué)治療劑)的組合療法也形成了本發(fā)明的部分。此處使用的術(shù)語"有效量"和"治療有效量"是指足以提供想要的治療或生理學(xué)效應(yīng)或效果例如抑制促存活蛋白的活性或誘導(dǎo)把細(xì)胞凋亡的藥劑的量。此外，所述效應(yīng)可以是細(xì)胞病癥例如癌癥的癥狀的改善。同時(shí)再次要提出的是，想要的效應(yīng)可以是在例如退行性疾病的情況下促進(jìn)細(xì)胞的存活。不想要的效應(yīng)，例如副作用，有時(shí)隨想要的治療效應(yīng)一起表現(xiàn)；因此，醫(yī)生在確定什么是恰當(dāng)?shù)?有效量，，中要平衡潛在的益處對(duì)潛在的風(fēng)險(xiǎn)的平衡。藥劑的確切量隨受試者的不同而不同，依賴于物種、年齡和受試者的一般狀況、施用的模式等。因此，不可能確定確切的"有效量"。然而，通過使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定任何個(gè)體情況下的合適的"有效量，，。例如，可容易地在體外或動(dòng)物模型中確定促存活蛋白的拮抗劑發(fā)揮作用的能力。關(guān)于后者，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于這樣的因素例如動(dòng)物的，動(dòng)物的癥狀的嚴(yán)重度和選擇的特定組合物或施用途徑確定所需量。然后將該信息外推至更大型的動(dòng)物例如人。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及蛋白或肽的用途的范圍內(nèi)，有效量包括大約10yg/kg體重的抗體至20mg/kg體重的抗體例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100jag/kg體重、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000jig/kg體重或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg體重。為單一治療或組合治療提供相似的量。"藥學(xué)上可接受的"栽體和/或稀釋劑是由非生物或想要的材料即可與選擇的活性劑一起施用但不導(dǎo)致任何或顯著不利反應(yīng)的材料組成的藥物媒介物。栽體可包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、用于調(diào)節(jié)張力的試劑、緩沖劑、螯合劑和吸收延遲劑等。類似地，此處提供的化合物的"藥學(xué)上可接受的"鹽、酯、酰胺、前體藥物或衍生物是非生物的或不想要的的鹽、酯、酰胺、前體藥物或4汙生物。此處使用的術(shù)語"治療"和"醫(yī)治"是指治療性處理和預(yù)防性或防護(hù)性措施。例如，治療可導(dǎo)致癌癥的癥狀的嚴(yán)重度和/或頻率的減少、癌癥的癥狀和/或背后的病因的消除、癌癥和/或其背后病因的發(fā)生的預(yù)防以及患癌癥后的損傷的改善、補(bǔ)救或好轉(zhuǎn)。因此，治療可以不導(dǎo)致癥狀的"治愈，，但可以導(dǎo)致癥狀的改善。此外，治療可以不是原發(fā)性癌癥的治療但可以是續(xù)發(fā)性癌癥或轉(zhuǎn)移癌的治療。術(shù)語"病狀"和"疾病"在整個(gè)本說明書中可互換使用。此處使用的"受試者"是指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物和更優(yōu)選可從本發(fā)明的藥物組合物和方法受益的人。不存在對(duì)可從本發(fā)明描述的藥物組合物和方法受益的動(dòng)物類型的限定。無論是人或非人動(dòng)物的受試者可稱作個(gè)體、患者、動(dòng)物、宿主或接受者以及受試者。本發(fā)明的組合物和方法用于人的藥物和獸醫(yī)藥物。優(yōu)選哺乳動(dòng)物是人、實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和參與賽跑和耐力行業(yè)的動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)例包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、倉鼠、貓和狗。賽跑和耐力行業(yè)的動(dòng)物的實(shí)例包括馬、狗、牛和駱駝。本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生促存活蛋白的拮抗劑的方法。所述拮抗劑誘導(dǎo)或促進(jìn)凋亡?；诖俚蛲龇肿又袇⑴c本發(fā)明的拮抗劑BH3-only促凋亡蛋白家族的成員和Bcl-2蛋白的促存活家族的成員之間的結(jié)合的氨基酸殘基的鑒定產(chǎn)生本發(fā)明的拮抗劑。因而本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)細(xì)胞或細(xì)胞群體的凋亡的分子。特別地，本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中涉及Bcl-2蛋白家族的促存活成員的拮抗劑。此處的"凋亡，，是指其中程序化的事件順序?qū)е录?xì)胞的死亡和消除的細(xì)胞死亡形式。凋亡細(xì)胞經(jīng)歷獨(dú)特的形態(tài)學(xué)變化。凋亡的標(biāo)志包括細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)凝縮以及質(zhì)膜拓樸學(xué)的改變。在生物化學(xué)上，凋亡細(xì)胞的特征在于增加的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度、染色體DNA的片段化和新的細(xì)胞表面組分的表達(dá)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)Bcl-2蛋白家族成員的拮抗劑，使得能夠在選擇的細(xì)胞或細(xì)胞群體例如但不限于癌細(xì)胞和正在經(jīng)歷不想要的過度增殖的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。此處的"癌細(xì)胞"是指展示非正常生長(zhǎng)和傾向于以不受控制的方式增殖的和在一些情況下導(dǎo)致腫瘤和/或轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。涉及使用本發(fā)明的拮抗劑治療的癌癥包括，但不限于ABL1原癌基因、AIDS相關(guān)性癌癥、聽神經(jīng)瘤、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞樣白血病、嚢性腺樣癌、腎上腺皮質(zhì)癌、特發(fā)性骨髓外化生、斑禿、軟組織腺泡狀肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性貧血、星形細(xì)胞瘤、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、基底細(xì)胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦和兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(brainandenstumor)、乳腺癌、兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(enstumor)、類癌瘤、子宮頸癌、兒童期腦腫瘤、兒童期癌(childhoodcancer)、兒童期非白血性白血病(childhoodleukemia)、兒童期軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病、結(jié)腸直腸癌、皮膚T淋巴細(xì)胞瘤、隆凸性皮膚纖維肉瘤、結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞肺瘤、導(dǎo)管癌、內(nèi)分泌癌(endocrinecancer)、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏肉瘤、肝外膽管癌、眼癌、目艮黑素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、輸卵管癌、范可尼貧血、纖維肉瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸癌、胃腸類癌瘤、泌尿生殖器腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、妊娠性滋養(yǎng)層細(xì)胞病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、婦科癌癥(gynaecologicalcancer)、血液胂瘤(hematologicalmalignancy)、毛細(xì)胞性白血病、頭頸癌(headandneckcancer)、肝細(xì)胞癌、遺傳性乳腺癌、組織細(xì)胞增多病、何杰金病、人乳頭狀瘤病毒、葡萄胎、高血鈣癥、喉咽癌、眼內(nèi)黑色素瘤、胰島細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥、喉癌、平滑肌肉瘤、非白血性白血病、李弗勞明綜合征、唇癌、脂肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水腫、淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、男性乳癌、腎的惡性棒狀腫瘤(malignant-rhabdoid-tumor-of-kidney)、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑素瘤、Merkel細(xì)胞癌、間皮瘤、轉(zhuǎn)移癌、口腔癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤綜合征、覃樣肉芽腫、骨髓增生異常綜合征、骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻癌、鼻咽癌、腎胚細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤病、nijmegen染色體斷裂綜合征(breakagesyndrome)、非黑素瘤(醒-mela廳a)皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌(麵-smal卜cel卜lung-cancer)-(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌(oropharynxcancer)、骨肉瘤、造瘺術(shù)卵巢癌(ostomyovariancancer)、胰腺癌、鼻旁癌(paranasalcancer)、曱狀旁腺腫瘤、腮腺癌、陰莖癌、原始神經(jīng)外胚層腫瘤(peripheral-neuroectodermal-tumors)、腦下垂體癌(pituitarycancer)、真性紅細(xì)胞增多癥、前列腺癌、rare-cancers-and-associated-disorders、腎細(xì)胞癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、先天性血管萎縮性皮膚異色病、涎腺惡性肺瘤、肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、惡性皮膚網(wǎng)狀細(xì)胞增多綜合征、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌(SCLC)、小腸癌、軟組織肉瘤、脊髄瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous-cell-carcinoma-(skin))、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌(thymuscancer)、甲狀腺癌、移行細(xì)胞癌(膀胱)(transitiona卜cel卜cancer-(bladder))、移行細(xì)胞癌(腎臟-骨盆-/-輸尿管)、滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、輸尿管癌、泌尿系統(tǒng)腫瘤、異地排尿(uroplakins)、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、外陰癌、華氏巨球蛋白血癥和維爾姆斯氏腫瘤。作為本發(fā)明的特定靶的癌癥是產(chǎn)生過量Bcl-2蛋白或促存活蛋白相關(guān)蛋白和/或減少量的抑制Bcl-2成員的促凋亡分子的癌癥。按照本發(fā)明，促存活分子包括但不限于Bcl-2蛋白。Bc卜2蛋白家族以及其他細(xì)胞質(zhì)蛋白是凋亡的至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子。目前已鑒定了3個(gè)亞家族內(nèi)的至少15個(gè)Bel-2家族成員。已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和病毒中鑒定了此類蛋白，并且所述蛋白各自具有高度保守的4個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域(BH1至BH4)中的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域。Bcl-2家族蛋白包含在促存活亞家族的成員中發(fā)現(xiàn)的BH1和BH2結(jié)構(gòu)域，然而與Bcl-2最相似的蛋白具有所有4個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，這使得能夠在遇到多種細(xì)胞毒性挑戰(zhàn)時(shí)抑制細(xì)胞的凋亡。在哺乳動(dòng)物中促存活亞家族的成員包括Bcl-2、Bc卜Xl、Bcl-w、Mcl-1和A1(在哺乳動(dòng)物中);NF-13(雞);CED-9(秀麗隱桿線蟲)；和病毒蛋白BHRFl、LMW5-HL、ORF16、KS-Bcl-2和E1B-19K。BH3結(jié)構(gòu)域是促凋亡亞家族蛋白的功能所必需的。兩個(gè)促凋亡亞家族Bax和BH3分別包括Bax、Bak和Bok(也稱為Mtd);和Bik、Blk、Hrk、BNIP3、BimL、Bad、Bid和Egl-l(秀麗隱桿線蟲)。Bax亞家族的成員包含BH1、BH2和BH3結(jié)構(gòu)域，并且與Bel-2非常相似。相反地，BH3亞家族的成員只具有9-16個(gè)殘基的BH3結(jié)構(gòu)域，或與任何已知的蛋白不相關(guān)，只有Bik和Blk共有序列相似性。兩種促凋亡亞家族的蛋白可以是促存活亞家族蛋白的拮抗劑。在秀麗隱桿線蟲中對(duì)此進(jìn)行了說明，在所述秀麗隱桿線蟲中，進(jìn)行凋亡所需的Egl-l結(jié)合至CED-9并通過其起作用(關(guān)于綜述，參見，Adams,J.M.和S.CorySc/e腳息.1322—1326，1998)。促凋亡和抗凋亡亞家族蛋白之間的異二聚體對(duì)這些蛋白亞家族具有滴定效應(yīng)，這表明各亞家族成員的相對(duì)濃度可用于調(diào)節(jié)凋亡。Bcl-2蛋白具有2種通過選擇性剪接形成的同種型ot和p。其形成了同型二聚體和與Bax和Bak蛋白以及Bcl-XL同種型Bcl-Xs形成異二聚體。與Bax的異二聚化需要完整的BH1和BH2結(jié)構(gòu)域，并且對(duì)于促存活活性是必需的。BH4結(jié)構(gòu)域似乎也參與促存活活性。Bel-2位于線粒體內(nèi)膜和線粒體外膜內(nèi)，以及位于核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，并在多種組織中表達(dá)。在染色體易位T(14;18)(q32;q21)中看到其參與產(chǎn)生濾泡性淋巴瘤(II型慢性淋巴性白血病)，并且其參與產(chǎn)生濾泡性淋巴瘤涉及免疫球蛋白區(qū)域。Bc1-Xl蛋白是編程性細(xì)胞死亡的主要調(diào)節(jié)者。選擇性剪接導(dǎo)致產(chǎn)生3種同種型，Bc卜xB、長(zhǎng)同種型和短同種型。長(zhǎng)同種型展示細(xì)胞死亡阻抑物活性，而短同種型促進(jìn)凋亡。Bc卜Xl與Bax和Bak形成異二聚體，盡管與Bax的異二聚化似乎對(duì)于促存活(抗凋亡)活性不是必需的。Bcl-Xs與Bcl-2形成異二聚體。在線粒體膜和核周膜中發(fā)現(xiàn)Bcl-x。Bel-Xs以高水平在發(fā)育中的淋巴細(xì)胞和經(jīng)歷高循環(huán)率(highrateofturnover)的其他細(xì)胞中表達(dá)。在成人腦和其他組織的長(zhǎng)壽命有絲分裂后細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Bcl-X"至于Bcl-2，BH1、BH2和BH4結(jié)構(gòu)域參與促存活活性。在幾乎所有骨髓細(xì)胞系和多數(shù)組織中的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)Bc卜w蛋白，其在腦、結(jié)腸和唾液腺中表達(dá)水平最高。該蛋白以低水平在睪丸、肝、心臟、胃、骨骼肌和胎盤以及淋巴樣細(xì)胞系中表達(dá)。Bcl-w包含BHl、BH2和BH4結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域都是其細(xì)胞存活促進(jìn)活性所需要的。盡管其中Bcl-w基因功能被同源重組破壞的小鼠是可存活的、健康的和外表正常的，并且成年雌性具有正常的生殖功能，但成年雄性是不育的。在這些雄性中，在初始的青春前期前精子發(fā)生未受到明顯影響并且睪丸發(fā)育正常。然而，曲細(xì)精管被破壞，包含大量凋亡細(xì)胞，從而不能產(chǎn)生成熟精子。該小鼠模型可用于人男性不育的一些情況，暗示著睪丸中程序化細(xì)胞死亡的改變可用于調(diào)節(jié)生育力(Print等人tY"/Jcaf/5W咖化12424-12431，1998)。大鼠局部缺血大腦中的研究發(fā)現(xiàn)Bcl-w相對(duì)于其在非局部缺血的大腦中的低組成型水平表達(dá)為過度表達(dá)。此外，檢查Bcl-w的作用機(jī)制的體外研究顯示，當(dāng)Bcl-w也存在時(shí)，分離的大鼠腦線粒體不能對(duì)重組Bax或高濃度的鈣的加入起反應(yīng)。正常反應(yīng)是從線粒體釋放細(xì)胞色素c。此外，發(fā)現(xiàn)重組Bcl-w蛋白抑制鈣誘導(dǎo)的線粒體跨膜電位的喪失，這表示通透性轉(zhuǎn)換。這些發(fā)現(xiàn)一起表明Bcl-w可以是抗局部缺血神經(jīng)元死亡的神經(jīng)保護(hù)劑和可通過線粒體死亡調(diào)節(jié)途徑獲得該保護(hù)(Yan等人，/Cere6W/oocT/Vow2^620-630，2000)。Bfl-l基因是Bc卜2家族的另外的成員，其也是凋亡的阻抑物。Bfl-l蛋白具有175個(gè)氨基酸，并且包含Bcl-2家族成員中發(fā)現(xiàn)的BH1、BH2和BH3保守結(jié)構(gòu)域。其也包含富含Gln的NH2末端區(qū)域和缺少BH結(jié)構(gòu)域1，與其他Bcl-2家族成員不同。小鼠Al蛋白共有與Bfl-l的高序列同源性并且具有3個(gè)Bfl-l中發(fā)現(xiàn)的保守結(jié)構(gòu)域。類似于Bel-2、Bel-Xl和EBV-BHRF1的作用，由p53腫瘤阻抑蛋白誘導(dǎo)的凋亡被Bf卜l抑制QySa-Eipper，C.等人.Ca刀cerWe義i"(5;3879-3882，1996)。Bfl-l經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)胞內(nèi)，在造血區(qū)室(hematopoieticcompartment)即血液、脾和骨髓中表達(dá)最高；在肺、小腸和睪丸中表達(dá)中等；在其他組織中表達(dá)最低。也在血管平滑肌細(xì)胞和血液腫瘤(hematopoieticmalignancy)中發(fā)現(xiàn)其。已注意到Bfl-l的表達(dá)7jc平和胃癌發(fā)生之間的相關(guān)性，這表明Bfl-l蛋白在促進(jìn)癌性細(xì)胞存活中和在癌癥中參與胃癌的發(fā)展(Choi等人.Oncogene11:1693-1698，1995)。在某些實(shí)施方案中，促存活分子包括但不限于Bcl-2、Bc1-Xl、Bcl-w、McH和Al。本發(fā)明涉及的促凋亡分子包括但不限于BH3-only蛋白家族的成員。在一些實(shí)施方案中，BH3-only蛋白包括但不限于Noxa、Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk和Bid。本發(fā)明提供了可選擇性結(jié)合Bcl-2、BC1-x"Bel-w、Mcl-1和A1中的一種或多種的拮抗劑，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞或細(xì)胞群體的凋亡。因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生促存活Bcl-2家族成員的拮抗劑的方法，所述方法包括步驟a.突變來自BH3-only促凋亡蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；b.將突變的BH3結(jié)構(gòu)域與促存活Bcl-2家族成員接觸；c.檢測(cè)突變的BH3結(jié)構(gòu)域與促存活Bcl-2家族成員之間的結(jié)合的存在或不存在，從而鑒定促凋亡蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域中與BH3結(jié)構(gòu)域和促存活Bcl-2家族成員之間的結(jié)合相互作用相關(guān)的氨基酸殘基；和d.產(chǎn)生在BH3結(jié)構(gòu)域與Bel-2蛋白之間發(fā)生結(jié)合所必需的氨基酸上模擬野生型BH3結(jié)構(gòu)域的拮抗劑。"突變"是指BH3結(jié)構(gòu)域序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基的置換或缺失。所述突變的實(shí)例公開于SEQIDNOs:l-lO。插入氨基酸序列突變體是其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被導(dǎo)入蛋白中預(yù)先確定的位點(diǎn)的突變體，盡管在對(duì)所得的產(chǎn)物進(jìn)行合適的篩選的情況下也可能進(jìn)行隨機(jī)插入。缺失突變體的特征在于從序列除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸。置換型氨基酸突變體是其中序列中的至少一個(gè)氨基酸被除去而不同的殘基在其位置上插入的突變體。置換型氨基酸突變體的實(shí)例是保守性氨基酸置換。保守性氨基酸置換通常包括下列組內(nèi)的置換甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。對(duì)氨基酸序列的加入包括與其他肽、多肽或蛋白的融合。特定的突變體選自Bim:D1A、M2A、R3A、P4A、E5A、16A、W7A、18A、A9E、Q10A、E11A、L12A、R13A、R14A、115A、G16E、D17A、E18A、F19A、N20A、A21E、Y22A、Y23A、A24E、R25A和R26A;Bad:N1A、L2A、W3A、A4E、A5E、Q6A、R7A、Y8A、G9E、R10A、E11A、L12A、R13A、R14A、M15A、S16E、D17A、E18A、F19A、V20A、D21A、S22A、F23A、K24A、K25A和G26E;Bid:Q1A、E2A、D3A、I4A、15A、R6A、N7A、18A、A9E、R10A、19H11A、L12A、A13E、(J14A、V15A、G16E、D17A、S18A、M19A、D20A、R21A、S22A、123A、P24A、P25A和G26E;mNoxaA:R1A、A2E、E3A、L4A、P5A、P6A、E7A、F8A、A9E、A10E、Q11A、L12A、R13A、K14A、115A、G16E、D17A、K18A、V19A、Y20A、C21A、T22A、W23A、S24A、A25E和D26ABak:P1A、S2A、S3A、T4A、M5A、G6E、Q7A、V8A、G9E、R10A、Q11A、L12A、A13E、I14A、115A、G16E、D17A、D18A、119A、N20A、R21A、R22A、Y23A、D24A、S25A和E26A。上面c)部分中使用的"檢測(cè)，，是指結(jié)合的直接檢測(cè)或通過促存活或促凋亡分子的功能進(jìn)行的間接檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)BH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行系統(tǒng)性突變。在本發(fā)明的某些方面，用丙氨酸置換氨基酸殘基，或在其中丙氨酸或甘氨酸存在于野生型序列中的情況下，置換具有不同性質(zhì)的氨基酸。例如，谷氨酸，當(dāng)與丙氨酸或甘氨酸相比時(shí)，大小更大并且?guī)щ姾??？墒褂煤Y選測(cè)定法確定突變的BH3結(jié)構(gòu)域與促存活Bcl-2蛋白家族的成員之間的結(jié)合存在或不存在。該篩選測(cè)定法的實(shí)例包括但不限于ELISA、酵母雙雜交篩選測(cè)定法或能夠鑒定兩種靶蛋白之間相互作用的任何其他測(cè)定法。例如，在一個(gè)篩選測(cè)定法中，將突變的BH3結(jié)構(gòu)域融合至M13噬菌體的基因-3次要包衣蛋白(minorcoatprotein)序列。然后將促存活蛋白例如Bc卜2、Bc1-Xl、Bcl-w、Mcl-l或Al以不同的濃度與固定稀釋度的展示突變的BH3蛋白的噬菌體一起溫育。然后就給定的BH3突變體與促存活Bcl-2蛋白家族的成員之間的結(jié)合相互作用確定IC5。。不結(jié)合或顯示減少的對(duì)一個(gè)或多個(gè)Bcl-2蛋白家族成員的結(jié)合的能力的BH3突變體鑒定了與BH3-only蛋白對(duì)Bcl-2蛋白的結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基。結(jié)合測(cè)定法可簡(jiǎn)單地檢測(cè)受試化合物對(duì)多肽的結(jié)合，其中通過焚光基團(tuán)、放射性同位素、酶綴合物或其他可檢測(cè)標(biāo)記檢測(cè)結(jié)合。例如，測(cè)定可包括將至少一種BH3突變體與至少一種存在于溶液中或附著至固體支持物的Bc卜2蛋白混合，然后檢測(cè)Bcl-2對(duì)BH3突變體的結(jié)合的步驟?？蛇x擇地，測(cè)定可檢測(cè)或測(cè)量在標(biāo)記的竟?fàn)幷叽嬖诘那闆r下BH3突變體的結(jié)合。此外，可使用無細(xì)胞制劑、化學(xué)文庫或天然產(chǎn)物混合物進(jìn)行測(cè)定，BH3突變體可以在游離于溶液中或附著至固體支持物。這樣的測(cè)定的實(shí)例包括放射性標(biāo)記測(cè)定法例如美國(guó)專利5，914，236和美國(guó)專利6,372,724中描述的測(cè)定法。突變的BH3結(jié)構(gòu)域或突變的BH3結(jié)構(gòu)域片段可用于篩選調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白的活性的化合物。此類化合物可包括激動(dòng)劑、拮抗劑或部分激動(dòng)劑或反激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，在允許BH3對(duì)Bcl-2結(jié)合的條件下進(jìn)行測(cè)定，其中將BH3結(jié)構(gòu)域與至少一種受試化合物混合，然后將BH3結(jié)構(gòu)域在受試化合物存在的情況下誘導(dǎo)凋亡的能力與BH3結(jié)構(gòu)域在所述受試化合物不存在的情況下誘導(dǎo)凋亡的能力比較。在受試化合物存在的情況下凋亡水平的改變表示調(diào)節(jié)Bel-2的活性的化合物?？蛇x擇地，將受試化合物在適合于BH3對(duì)Bel-2結(jié)合的條件下與包含BH3的體外或無細(xì)胞體系混合，進(jìn)行測(cè)定。在這些測(cè)定中的任一測(cè)定中，調(diào)節(jié)BH3誘導(dǎo)凋亡的能力的受試化合物可以間接地進(jìn)行調(diào)節(jié)，并且不必直接與受試化合物接觸?？珊Y選至少一種或多至多種受試化合物。如此處所用的，"BH3結(jié)構(gòu)域蛋白"可包括全長(zhǎng)BH3結(jié)構(gòu)域或其部分。全長(zhǎng)BH3結(jié)構(gòu)域可以存在于完整的BH3-only蛋白的背景中，或可以以分離的形式使用。本發(fā)明的BH3蛋白可以是天然發(fā)生的蛋白、重組產(chǎn)生的蛋白或可以是合成的肽。"片段"是BH3結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特部分或編碼可在序列上對(duì)親本序列同一但在長(zhǎng)度上比親本序列更短的BH3結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。片段可包含大約5至大約1000個(gè)連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基。用作探針、引物、抗原、治療性分子或用于其他目的的片段在長(zhǎng)度上可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250或至少500個(gè)連續(xù)核苷酸或氨基酸。片段優(yōu)選選自分子的某些區(qū)域。很明顯這些長(zhǎng)度是示例性的，本說明書支持的任何長(zhǎng)度，包括序列目錄、列表和圖表，可包括在本實(shí)施方案中。本發(fā)明部分地涉及調(diào)節(jié)Bel-2蛋白功能從而用于增加凋亡的試劑的產(chǎn)生。如此處所用的"拮抗劑"是指抑制或減弱Bcl-2蛋白的生物學(xué)活性的分子。拮抗劑可包括蛋白例如抗體、抗鈣素(anticalin)、核酸、糖類、小分子或任何其他化合物或組合物，所述任何其他化合物或組合物通過直接與Bcl-2相互作用或通過對(duì)其中BH3-only蛋白和/或Bcl-2蛋白參與的生物途徑的組分作用增加細(xì)胞或細(xì)胞群體對(duì)凋亡的易感性。此處的"試劑"應(yīng)當(dāng)理解為是指來源于天然的、重組或合成來源的任何蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子。有用的來源包括天然產(chǎn)生的文庫、化學(xué)文庫以及組合文庫、噬菌體文庫和基于體外翻譯的文庫的篩選。特別有用的來源是修飾泛宿主性BH3only結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生拮抗或刺激它們之間的相互作用的分子。在特別有用的實(shí)施方案中，試劑是基于BH3-only促凋亡蛋白(所述促凋亡蛋白在SEQIDNO:1至10中的一個(gè)中所列的氨基酸序列中具有至少一個(gè)突變)的肽或蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于完全抑制或顯著減少Bel-2或促存活相關(guān)蛋白的促存活功能的水平或活性的本發(fā)明的試劑可以是蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子或化學(xué)分子。術(shù)語"拮抗劑"或"拮抗作用"或"對(duì)抗"包括Bcl-2家族蛋白促存活活性的所有這些降低、抑制、減少和下調(diào)。這些試劑的結(jié)果是誘導(dǎo)或使細(xì)胞或細(xì)胞群體對(duì)凋亡易感。關(guān)于為蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子的試劑，此類分子包括肽、多肽和蛋白。此外，術(shù)語突變體、部分、衍生物、同源物、類似物或模擬物是指包括各種形式的試劑，所述試劑完全抑制或顯著減少Bcl-2家族蛋白的促存活功能。所述試劑可以是天然發(fā)生的或人工產(chǎn)生的分子。所述試劑可以是包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的BH-3only蛋白或其BH3結(jié)構(gòu)域或片段。可通過誘變或其他化學(xué)方法或重組產(chǎn)生或合成產(chǎn)生所述試劑。丙氨酸掃描是用于鑒定重要氨基酸的有用技術(shù)(Wells，#eMo&i""zy邁o/2M.'2699-2705，1991)。在該技術(shù)中，用丙氨酸替代氨基酸殘基，然后確定其對(duì)多肽活性的影響。以該方式分析試劑的各氨基酸殘基以確定重要的結(jié)構(gòu)和/或電荷和/或構(gòu)象和/或疏水/親水區(qū)。就其對(duì)Bcl-2的結(jié)合的能力和其他性質(zhì)例如壽命、結(jié)合親和力、離解速率、穿膜能力或誘導(dǎo)凋亡的能力檢測(cè)試劑。本發(fā)明的試劑也包括全長(zhǎng)BH3-only蛋白的Bel-2結(jié)合部分。部分是界定Bcl-2結(jié)合片段例如兩親性a螺旋結(jié)構(gòu)的至少l個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)和至少30個(gè)連續(xù)氨基酸，例如l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30個(gè)氨基酸。有人提出該結(jié)構(gòu)與Bcl-2蛋白的疏水溝相互作用。可通過使用標(biāo)準(zhǔn)的重組核酸技術(shù)獲得或使用常規(guī)液相或固相合成技術(shù)合成該類型的肽。例如，可參考由Nicholson編著和由BlackwellScientificPublication的出版的標(biāo)題為"SyntheticVaccines"的出版物中包括的Atherton和Shephard編寫的標(biāo)題為"PeptideSynthesis"的第9章中描述的溶液合成或固相合成?？蛇x擇地，可通過用蛋白酶例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8蛋白酶降解本發(fā)明的氨基酸序列來產(chǎn)生肽?？赏ㄟ^例如高效液相色譜(HPLC)技術(shù)純化降解的片段。任何這樣的片段，無論其產(chǎn)生的方法，要理解為此處使用的術(shù)語"拮抗劑"所包含的意義。因此拮抗劑可包括BH3結(jié)構(gòu)域的衍生物。這樣的衍生物包括BH3結(jié)構(gòu)域或BH3-only蛋白的部分、突變體、同源物、片段、類似物以及雜交分子或融合分子和糖基化變體。衍生物也包括在最優(yōu)比對(duì)后在比較窗口上具有百分比氨基酸序列同一性的分子。優(yōu)選地，特定序列和參照序列之間的百分比相似性是至少大約60%或至少大約70%或至少大約80%或至少大約90%或至少大約95%或更高例如至少大約96%、97%、98%、99%或更高。優(yōu)選地，本試劑的種間、功能或結(jié)構(gòu)同源物之間的百分比相似性是至少大約60%或至少大約70°/。或至少大約80%或至少大約90%或至少大約95%或更高例如至少大約96%、97%、98%、99%或更大。60%和100%之間的相似性或同一性的百分比也包括例如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。此處涉及的蛋白拮抗劑例如BH3-only蛋白或BH3結(jié)構(gòu)域的4汙生物中的殘基的類似物包括但不限于對(duì)側(cè)鏈的修飾、在肽、多肽或蛋白質(zhì)合成期間非天然氨基酸和/或其衍生物至肽中的整合、以及對(duì)蛋白性質(zhì)的分子或其類似物施加構(gòu)象限制的交聯(lián)劑和其他方法的使用。該術(shù)語也不排除多肽的修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。包括在該定義中的是例如包含氨基酸(包括，例如，非天然氨基酸例如表2中給出的氨基酸)的一種或多種改變的多肽或具有取代鍵的多肽。這樣的多肽可能需要能夠進(jìn)入細(xì)胞。本發(fā)明涉及的側(cè)鏈修飾的實(shí)例包括氨基的修飾，例如通過還原烷基化(通過與醛基反應(yīng)，然后用NaBH4還原)；使用曱基乙酰亞胺酯的二次胺化(amidination);使用醋酸酐的?；?；使用氰酸鹽的氨基的氨甲?；皇褂?，4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的氨基的三硝基芐基化；使用琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐的氨基的?；?；和使用吡哆醛-5-磷酸，然后用NaBH4還原的賴氨酸的吡醇羥乙?；?pyridoxylation)。可通過使用試劑例如2，3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛形成雜環(huán)縮合物來修飾精氨酸殘基的胍基?？赏ㄟ^形成O-acylisourea，然后進(jìn)4于隨后的^t生4匕例如形成對(duì)應(yīng)的酰胺來通過碳化二亞胺活化修飾羧基?？赏ㄟ^方法例如使用碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化；對(duì)磺基丙氨酸的過甲酸氧化；使用其他巰基化合物形成的混合二硫鍵；與馬來酰亞胺、馬來酸酐或其他取代馬來酰亞胺的反應(yīng)；使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞酚磺酸(chloromercuriphenylsulphonicacid)、氯化苯汞、2-氯汞-4-硝基盼和其他汞制劑的汞衍生物的形成；在堿性pH下使用氰酸鹽的氨甲?；瘉硇揎棊€基?？赏ㄟ^例如使用N-溴代琥珀酰亞胺的氧化或使用2-羧基-5-硝基溴化節(jié)或磺酰鹵的吲哚環(huán)的烷化修飾色氨酸殘基。另一方面，可通過使用四硝基甲烷硝化來改變酪氨酸殘基，從而形成3-硝基酪氨衍生物?？赏ㄟ^使用碘乙酸衍生物的烷化或使用焦碳酸二乙酯的N-乙氧羰基化(carbethoxylation)進(jìn)行組氨酸殘基的咪唑環(huán)的修飾。在肽合成期間將非天然氨基酸和衍生物整合入肽中的實(shí)例包括但不限于正亮氨酸、4-氨丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸、6-氨己酸、叔-丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu)體的使用。此處涉及的非天然氨基酸的目錄示于表2。此類非天然氨基酸可用于提供類似于BH3結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)。表2:非常規(guī)氨基酸的代碼<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>锏L-cx-曱壯纈城MnvaL-cc-曱^4艦MornMpheL-cc-曱細(xì)艦MproL-a-甲絲絲MscrL-cx-甲基^mMthrL-a-甲基色WMtrpL-oc-甲絲城MtyrL-a-曱絲絲MvalL-N-曱基高苯丙mNmhpheN-(N-(2'2-4乙_|0NnbhmN-(N-(3，3-4丙&隱e氨甲錄甲射械氨甲絲甲&甘城1-(2,2-二苯乙基-Nmbc乙^^環(huán)丙烷可以例如使用交聯(lián)劑穩(wěn)定3D構(gòu)象，使用同質(zhì)雙功能(homo-bifunctional)交聯(lián)劑例如具有n=l至n=6的(CH》n間隔基團(tuán)的雙功能亞胺酯、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯和通常包含氨基反應(yīng)部分例如N-羥基琥珀酰亞胺酯和另一個(gè)基團(tuán)特異性反應(yīng)部分例如馬來酰亞胺基或二硫代部分(SH)或碳化二亞胺(COOH)的異質(zhì)雙功能(hetero-bifunctional)試刑。此夕卜，可通過例如整合C。和N。一甲基氨基酸，在氨基酸的"和Ce原子之間引入雙鍵和通過引入共價(jià)鍵(例如在N和C末端之間、兩個(gè)側(cè)鏈之間或側(cè)鏈和N或C末端之間形成酰胺鍵)形成環(huán)肽或類似物來在限制肽的構(gòu)象。BH3結(jié)構(gòu)域的模擬物包括在結(jié)構(gòu)和/或功能水平上的靶結(jié)合劑(即BH3-only蛋白)并且其抑制促存活Bc卜2蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提出產(chǎn)生選擇的BH3結(jié)構(gòu)域模擬物?；贐H3結(jié)構(gòu)域(所述結(jié)構(gòu)域具有阻止對(duì)Bcl-2蛋白結(jié)合的突變)之間的結(jié)構(gòu)差異設(shè)計(jì)BH3結(jié)構(gòu)域模擬物。肽模擬物可以是包含肽的模擬蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的元件的分子(Johnson等人，PeptideTurnMimeticsinBiotechnologyandPharmacy,Pezzuto等人，Eds.，ChapmanandHal1，NewYork,1993)。促進(jìn)分子相互作用例如促進(jìn)抗體和抗原、酶和底物或支架蛋白(scaffoldingprotein)的相互作用的方式確定氨基酸側(cè)鏈的方向而存在。設(shè)計(jì)肽模擬物以允許類似于天然分子的分子相互作用。BH3結(jié)構(gòu)域的肽或非肽模擬物可作為減少Bcl-2的促存活功能從而誘導(dǎo)或使細(xì)胞或細(xì)胞群體對(duì)凋亡易感的試劑用于本發(fā)明。將模擬物設(shè)計(jì)為藥物活性化合物是已知的產(chǎn)生基于"先導(dǎo)"化合物的藥物的方法。當(dāng)活性化合物難以合成或合成代價(jià)昂貴時(shí)或當(dāng)其不適合用于特定的施用方法(例如肽是不適合于口服組合物的活性劑，因?yàn)槠鋬A向于被消化道內(nèi)的蛋白酶降解)時(shí)，這可以是想要的。模擬物的設(shè)計(jì)、合成和檢測(cè)通常用于避免就耙性質(zhì)隨機(jī)篩選大量分子。在從具有給定的靶性質(zhì)的化合物設(shè)計(jì)模擬物中通常要進(jìn)行幾個(gè)步驟。第一，確定在確定靶性質(zhì)中是至關(guān)重要和/或重要的化合物的特定部分。在肽的情況下，這可以通過例如依次置換各殘基，系統(tǒng)性改變肽中的氨基酸殘基來進(jìn)行。如上文中所描述的，肽的丙氨酸掃描通常用于精煉(refine)此類肽基元。這些構(gòu)成化合物的活性區(qū)的部分或殘基稱為其"藥效團(tuán)"。當(dāng)發(fā)現(xiàn)藥效團(tuán)后，根據(jù)其物理性質(zhì)例如立體化學(xué)、鍵合、大小和/或電荷，使用來自許多來源例如分光鏡技術(shù)、X射線衍射和NMR的數(shù)據(jù)對(duì)其結(jié)構(gòu)建模。可在該建模過程中使用計(jì)算機(jī)分析、相似性作圖(其建立藥效團(tuán)的電荷和/或體積而非原子之間的鍵的模型)，可將其他技術(shù)用于該建模方法。在該方法的變異中，建立配體和其結(jié)合伴侶的三維結(jié)構(gòu)模型。當(dāng)配體和/或結(jié)合伴侶在結(jié)合時(shí)改變構(gòu)象，從而允許模型在模擬物的設(shè)計(jì)中考慮該現(xiàn)象時(shí)，這可以是特別有用的。建?？捎糜诋a(chǎn)生與線性序列或三維構(gòu)型相互作用的抑制劑。然后選擇可將模擬藥效團(tuán)的化學(xué)基團(tuán)嫁接至其上的的模板分子?？煞奖愕剡x擇所述模板分子和嫁接至其上的化學(xué)基團(tuán)以使模擬物容易合成，所述模板分子可能是藥學(xué)上可接受的，并且在體內(nèi)不降解，同時(shí)保持先導(dǎo)化合物的生物學(xué)活性?？蛇x擇地，當(dāng)模擬物基于肽時(shí)，可通過環(huán)化肽增加其剛性來獲得進(jìn)一步的穩(wěn)定性。然后可篩選通過該方法發(fā)現(xiàn)的模擬物以看其是否具有靶性質(zhì)或看它們展示其的程度。然后可進(jìn)行進(jìn)一步的最優(yōu)化或修飾以獲得一種或多種用于體內(nèi)或臨床試驗(yàn)的終模擬物。本發(fā)明的推理性藥物設(shè)計(jì)的目的是使用計(jì)算機(jī)方法產(chǎn)生和/或選擇限制性BH3-only蛋白的結(jié)構(gòu)類似物以產(chǎn)生藥物，所述藥物是例如多肽的更具有活性或穩(wěn)定的形式和具有限制性結(jié)合鐠。在一個(gè)方法中，人們首先通過X射線衍射晶體分析法、通過計(jì)算機(jī)建模或最常見地方法的組合確定目的蛋白的三維結(jié)構(gòu)。也可通過基于同源蛋白的結(jié)構(gòu)建模獲得關(guān)于多肽結(jié)構(gòu)的有用信息。推理性藥物設(shè)計(jì)的實(shí)例是HIV蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生(Erickson等人，Science249:527-533，1990)。藥物篩選的一個(gè)方法優(yōu)選在竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定中使用用重組多核普酸轉(zhuǎn)化的表達(dá)多肽或片段的真核或原核宿主細(xì)胞。此類細(xì)胞(以活的或固定的形式存在)可用于標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定法?？蓽y(cè)量例如靶或片段和受試試劑之間的復(fù)合物的形成，或檢查受試試劑促進(jìn)或干擾靶或片段和已知的配體之間的復(fù)合物的形成的程度。篩選方法包括測(cè)定(i)藥物和靶之間的復(fù)合物的存在，(ii)編碼所述靶的核酸分子的表達(dá)水平的改變。測(cè)定的一種形式包括竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定法。在該竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定中，通常標(biāo)記乾。將游離耙與任何假定的復(fù)合物分離，游離(即未復(fù)合的)標(biāo)記的量是受試試劑對(duì)靶分子的結(jié)合的量度。也可測(cè)量結(jié)合的靶而非游離的靶的量。也可能標(biāo)記化合物而不是靶，然后測(cè)量在受試藥物存在和不存在的情況下結(jié)合靶的化合物的量。用于藥物篩選的另一種技術(shù)提供了針對(duì)具有對(duì)靶的合適結(jié)合親和力的化合物的高通量篩選，在Geysen(國(guó)際專利公開號(hào)W084/03564)中詳細(xì)地描述了該技術(shù)。簡(jiǎn)而言之，在固體基質(zhì)例如塑料針(plasticpin)或一些其他表面上合成大量不同的小肽受試化合物。將所述肽受試化合物與靶反應(yīng)，然后進(jìn)行洗滌。之后使用本領(lǐng)域中熟知的方法檢測(cè)結(jié)合的靶分子。該方法可適合用于篩選非肽、化學(xué)實(shí)體。因此該方面擴(kuò)展至篩選靶拮抗劑或激動(dòng)劑的組合方法?？蓪⒓兓陌兄苯影辉谏鲜鏊幬锖Y選技術(shù)中使用的板上。然而，也可使用針對(duì)靶的非中和抗體將靶固定在固相上。可選擇地可以以與方便選擇的標(biāo)記的融合蛋白形式表達(dá)耙以有利于結(jié)合和鑒定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可進(jìn)行Bcl-2蛋白和Bcl-w的抑制劑的高通量化學(xué)篩選(HTCS)。假定BH3-only蛋白如Bim與促存活Bcl-2分子的相互作用參與凋亡，那么可就有機(jī)小分子(所述有機(jī)小分子以這樣的方式如阻止BH3結(jié)合的方式結(jié)合促存活蛋白)篩選文庫。為了鑒定靼向一種或兩種抗凋亡分子的化合物，可進(jìn)行多個(gè)篩選過程?？稍诩?xì)菌中產(chǎn)生高容量測(cè)定所必需的蛋白，使用光學(xué)生物傳感器(BiaCore)的初步研究顯示生物素化的BH3肽以高親和力(Kd~11nM)結(jié)合His6標(biāo)記的Bcl-2蛋白(Hinds等人，^￥^7/owr/7a/1497-1507，2003)。已使用AlphaScreen(AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay)技術(shù)發(fā)展了進(jìn)行HTCS所必需的高容量結(jié)合測(cè)定法(Glickman等人，/"/o/zo7Scree"7:3-10，2002)。通過顯示作為兩個(gè)伴侶蛋白相互作用的熒光輸出的變化，其可以敏銳的靈敏性監(jiān)控蛋白的相互作用。AlphaScreenTM非常適合用于HTCS，因?yàn)槠浞浅?qiáng)大并且可作為具有很大動(dòng)態(tài)范圍的均相測(cè)定法在小體積中容易地進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，將HiSeBel-2結(jié)合至鎳包被的受體小珠和將生物素化的BH3肽結(jié)合至鏈霉抗生物素包被的供體小珠。然后將小珠與受試化合物在384孔微量滴定板的小孔(每孔一種受試化合物)一起溫育，然后使用Fusionalpha板讀出器讀出測(cè)定結(jié)果?？删偷鞍装槌托≈榈臐舛取赜龝r(shí)間和測(cè)定體積最優(yōu)化結(jié)合測(cè)定法以使測(cè)定通常產(chǎn)生大于30:1的信號(hào)背景比。已驗(yàn)證所述測(cè)定法是有效的，因?yàn)楂@得的系列肽的ICs。值與使用光學(xué)生物傳感器獲得的相當(dāng)。盡管肽的親和力橫跨3個(gè)數(shù)量級(jí)(8nM-35|aM),但兩組結(jié)果之間的強(qiáng)相關(guān)性(R2=0.9983)顯示所述測(cè)定法測(cè)量相同的相互作用。也可最優(yōu)化用于His6Bel-2A/BH3的結(jié)合測(cè)定法。在最優(yōu)化測(cè)定法后，可使其接受嚴(yán)格的質(zhì)量控制以評(píng)估板對(duì)板和天對(duì)天的重現(xiàn)性。然后使用各測(cè)定法篩選獨(dú)特的發(fā)現(xiàn)文庫。為消除假陽性，可在第二竟?fàn)帨y(cè)定(AlphaScreenTM，熒光偏振和BiaCore光學(xué)生物傳感器)中驗(yàn)證滿足靼潛能(IC5。<25mM)的所有抑制性化合物。光學(xué)生物傳感器幫助定量Bel-2家族成員之間的相互作用，和可進(jìn)行強(qiáng)候選物對(duì)通過BH3-only蛋白產(chǎn)生的生理結(jié)合的親和力之間的容易的比較?？赏ㄟ^，除其他以外，液相色鐠-質(zhì)語光鐠測(cè)定法(liquidchromatography-massspectrometry)就本體(identity)和純度檢查通過這些初步檢測(cè)的化合物，然后就其乾特異性即對(duì)于Bcl-2、Bel-xL、Bel-w、Mcl-l或Al的親和力對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。也可在設(shè)計(jì)用于預(yù)測(cè)腸吸收(Wohnsland等人，/#edC力e邁923-930，2001)和肝毒性的測(cè)定法中檢測(cè)活性化合物。此外，可使用y/7s27/co法(method)預(yù)測(cè)其生物分布特性，和排除可提供于代謝或毒性問題的藥/"r2'/g/rwgZes/g/7s/tf/e「e/o/7/z/e/^，EdErhardt，BlackwellScience,Maiden,MA，USA，1999)?？赏ㄟ^結(jié)合測(cè)定法中的效能、靶選擇性、有利的預(yù)測(cè)的ADMET(吸收、分配、代謝、排泄和毒性)性質(zhì)(vandeWaterbeemd和Gifford，"rwg飽c么.192-204，2003)和化學(xué)易處理性(chemicaltractabi1ity)對(duì)關(guān)于所有活性化合物的數(shù)據(jù)進(jìn)行分級(jí)。然后，可獲得頂部化合物的所有可獲得的相近的結(jié)構(gòu)類似物并就結(jié)合和殺傷測(cè)定中的抑制性活性檢驗(yàn)其以確定各結(jié)構(gòu)系列的初步構(gòu)效關(guān)系。關(guān)于就生物學(xué)活性對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行的測(cè)定法，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有前景的先導(dǎo)化合物時(shí)，可估量其對(duì)細(xì)胞存活率的活性?？稍诔山M的培養(yǎng)的致瘤性細(xì)胞系和非致瘤性細(xì)胞系以及原代小鼠和人細(xì)胞群體例如淋巴細(xì)胞中檢驗(yàn)多至50種根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)最優(yōu)化的化合物?？稍谂clnM至100juM的所述化合物一起溫育的3至7天中監(jiān)控細(xì)胞存活率。當(dāng)然將對(duì)比其正常細(xì)胞對(duì)應(yīng)物更有效殺死腫瘤細(xì)胞的化合物投入是大的關(guān)注?？删推浒械奶禺愋院妥饔媚Ｊ皆u(píng)價(jià)在低于IOmM的濃度上發(fā)生殺死作用的化合物。驗(yàn)證其作用模式是非常重要的，因?yàn)槭茉嚮衔锟砷g接殺死細(xì)胞。例如，如果先導(dǎo)化合物以高選擇性結(jié)合Bcl-2，其不應(yīng)當(dāng)殺死缺乏Bcl-2的細(xì)胞。因此可通過將野生型細(xì)胞中的化合物的活性與缺乏Bcl-2的細(xì)胞中的比較來確認(rèn)作用的特異性?？蓪⒆钣星熬暗暮蜻x物在小鼠模型中接受其抗腫瘤功效的全面分析。在之前已完全表征的兩個(gè)模型中，用B細(xì)胞淋巴瘤注射的、來源于myc轉(zhuǎn)基因小鼠(Adams等人，J/》；533-538，1985)或/Z7j^/6c7-2雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(Strasser等人，同上)的免疫活性小鼠快速死亡并重現(xiàn)白血病/淋巴瘤癥狀。盡管兩種腫瘤都對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)療劑(環(huán)磷酰胺)起反應(yīng)，但用邁/c/6c/"v腫瘤細(xì)胞注射的小鼠不可避免地復(fù)發(fā)。這兩種可移植肺瘤將允許在治療這些惡性腫瘤中檢驗(yàn)單獨(dú)提供的或與環(huán)砩酰胺一起提供的任何化合物，所述惡性腫瘤是非常接近人淋巴瘤的模型。關(guān)于先導(dǎo)化合物的構(gòu)效關(guān)系(SAR)和其最優(yōu)化，選自初步篩選的先導(dǎo)物可要求相當(dāng)多的修飾以增強(qiáng)其生物化學(xué)、生物學(xué)和藥理學(xué)橫,(Bleicher等人，"/"ok么.369-378，2003)。為伋進(jìn)這些化合物的最優(yōu)化，可在生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)研究中驗(yàn)證其作用模式。成的復(fù)合物。因?yàn)镹MR可檢測(cè)低親和力的配體和顯示其在靶蛋白上的結(jié)合位置，所以其可大大地幫助結(jié)合的最優(yōu)化，從而加速藥物發(fā)現(xiàn)過程(Hajduk等人，/C力e邁W,2315-2317，1999;Pellecchia等人，Ae7Zri^"/、cor丄'211-219，2002)。通過使用技術(shù)例如化學(xué)位移作圖，可監(jiān)控受試化合物對(duì)Bcl-2蛋白的結(jié)合和可選擇模擬BH3結(jié)構(gòu)域的分子進(jìn)行最優(yōu)化。在相關(guān)方法中，可使用適合的DOCK程序(Kuntz，i^/e"ce^57.'1078-1082，1992)進(jìn)行先導(dǎo)試劑的分子建模以在硅片上(s/7/co)估量其結(jié)合?？蓪?duì)先導(dǎo)物結(jié)合至耙Bcl-2的溝進(jìn)行建模，然后對(duì)使用的功能評(píng)分以預(yù)測(cè)最可能的結(jié)合模式。這可指導(dǎo)提供額外的相互作用以增強(qiáng)結(jié)合的衍生物的設(shè)計(jì)。NMR產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可獲得性也〗吏得可能如意地停靠配體和耙以預(yù)測(cè)改進(jìn)的配體(Lugovskoy等人，/J/Z7Soc"《'1234-1240，2002)。該信息和來自生物學(xué)測(cè)定的信息可用于合成用于進(jìn)一步檢驗(yàn)的衍生化合物。對(duì)于各類先導(dǎo)化合物，存在用于合成衍生物的策略。例如，典型的擊中化合物(hitcompound)由兩個(gè)或三個(gè)連鎖的環(huán)系統(tǒng)組成，所述各環(huán)系統(tǒng)可被許多種官能團(tuán)取代。通過系統(tǒng)性地取代各官能團(tuán)，可產(chǎn)生和檢測(cè)具有廣泛的化學(xué)特性的化合物。根據(jù)本發(fā)明鑒定的試劑用于治療癌癥或過度增生性疾病或病癥。此處的"改善"可以是指當(dāng)前狀況的嚴(yán)重度的減輕。術(shù)語"好轉(zhuǎn)"也用于包括預(yù)防病癥發(fā)生的"預(yù)防性措施"。術(shù)語"好轉(zhuǎn)"不必表示將受試者治療至完全康復(fù)。類似地，"預(yù)防"不必指受試者最終不感染病癥。此處使用的受試者是指可受益于本發(fā)明的試劑的人和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如大猩猩、獼猴、狨猴)、家畜類動(dòng)物(例如綿羊、牛、馬、驢、豬)、伴侶動(dòng)物(例如狗、貓)、實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、倉鼠)、俘獲的野生動(dòng)物(例如狐貍、鹿)、爬行類動(dòng)物或兩棲動(dòng)物(例如蟾蜍(canetoad))、魚(例如斑馬魚)和任何其他生物(例如，線蟲)。對(duì)可受益于目前描述的試劑的動(dòng)物類型沒有限制。本發(fā)明的最優(yōu)選受試者是人。受試者，無論其是人或非人生物，可稱為患者、個(gè)體、動(dòng)物、宿主或接受者。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了在受試者中預(yù)防或減少癌癥或過度增生相關(guān)性疾病的方法，所述方法包括在一段時(shí)間內(nèi)和在足以預(yù)防或減少癌癥或過度增生病癥的條件下給所述受試者施用有效量的Bcl-2蛋白的拮抗劑。能夠拮抗Bcl-2和誘導(dǎo)凋亡的試劑的鑒定提供了用于癌癥的治療性治療的藥物組合物。可將本發(fā)明的試劑與一種或多種藥學(xué)上可接受的栽體和/或稀釋劑混合，從而形成藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體可包含生理上可接受的化合物，所述化合物用于例如穩(wěn)定或增加或減少本發(fā)明的藥物組合物的吸收或清除率。生理可接受的化合物可包括例如糖類例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化劑例如抗壞血酸或谷光苷肽、螯合劑、低分子量蛋白、減少肽或多肽的清除或水解的組合物、或賦形劑或其他穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。去垢劑也可用于穩(wěn)定或增加或減少藥物組合物包括脂質(zhì)體載體的吸收。用于肽和多肽的藥學(xué)上可接受的載體和制劑中，參見例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版，MackPublishingCompany,Easton，PA，1990("Remington's")。其他生理可接受化合物包括濕潤(rùn)劑、乳化劑、分散劑或特別地用于預(yù)防微生物的生長(zhǎng)或作用的防腐劑。不同的防腐劑是熟知的，包括例如酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到藥物可接受的栽體包括生理可接受的化合物的選擇依賴于例如本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑的施用途徑和其特定的物化特性?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方便的方法以藥物組合物的形式施用試劑。施用途徑包括但不限于經(jīng)呼吸、氣管內(nèi)、經(jīng)鼻咽、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、顱內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、大腦內(nèi)、鼻內(nèi)、輸注、口服、經(jīng)直腸、貼附和植入施用途徑。對(duì)于口服施用，可將化合物配制成固體或液體制劑例如膠嚢、丸劑、片劑、錠劑、粉劑、懸浮劑或乳劑。在制備以口服劑型存在的組合物中，在口服液體制劑(例如懸浮劑、酏劑或溶液)的情況下，可使用任何常用的藥物介質(zhì)，例如，水、乙二醇、油、乙醇、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑、懸浮劑等；或在口服固體制劑(例如粉劑、膠嚢劑和片劑)的情況下可使用載體例如淀粉、糖、稀釋劑、顆?；噭?granulatingagent)、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑等。因?yàn)槠涫┯玫娜菀仔裕瑒┖湍z嚢劑代表了最有利的口服劑量單位形式，在該情況下，很顯然使用固體藥物載體。如果想要，可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)片劑進(jìn)行糖包被或腸溶衣包被?？蓪⒒钚詣┓庋b入膠嚢以使其穩(wěn)定地通過胃腸道，同時(shí)允許通過血腦屏障，參見，例如，國(guó)際專利公開號(hào)WO96/11698。本發(fā)明的試劑，當(dāng)口服施用時(shí)，可獲得保護(hù)免受降解?？赏ㄟ^將核酸、肽或多肽與組合物復(fù)合以使其對(duì)酸和酶水解產(chǎn)生抗性或通過將核酸、肽或多肽封裝入合適的抗性栽體例如脂質(zhì)體來實(shí)現(xiàn)該目的。保護(hù)化合物免受降解的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，參見，例如Fix,戶力ar邊"..1760-1764,1996;Samanen等人，/戶力，Wzll9-135，1996;美國(guó)專利5,391,377,描述了用于口服遞送治療劑的脂質(zhì)體組合物(在下文中更詳細(xì)地描迷脂質(zhì)體遞送)。適合用于注射用途的藥物形式包括無菌水溶液(當(dāng)可溶于水時(shí))或用于無菌注射液或分散體的臨時(shí)制備的分散體和無菌粉劑或可以乳骨的形式或適合用于局部施用的其他形式存在。其必須在生產(chǎn)和貯上的條件下是穩(wěn)定的并且必須保持免受微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。栽體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和植物油?？梢岳缤ㄟ^使用包衣例如卵砩脂，在分散體的情況下通過保持顆粒大小和通過使用表面活性劑保持恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？墒褂酶鞣N抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等預(yù)防微生物的作用。優(yōu)選包含等滲劑例如糖或氯化鈉。可通過在組合物中使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠產(chǎn)生可注射組合物的延遲吸收。通過將試劑以需要的量按要求與上面列舉的各種其他組分一起整合入合適的溶劑中，然后進(jìn)行過濾滅菌來制備無菌注射液。一般地，通過將各種無菌活性組分整合入包含基本分散介質(zhì)和所需的來自上面列舉的組分中的其他組分的無菌媒介物中。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，制備的優(yōu)選方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，所述技術(shù)用于產(chǎn)生活性組分和來自其之前無菌過濾的溶液的任何額外想要的組分的粉劑。對(duì)于胃腸外給藥，可將試劑溶解在藥物載體中，然后以溶液或懸浮液施用。合適的載體的實(shí)例是水、鹽水、葡萄糖溶液、果糖溶液、乙醇或動(dòng)物、植物或合成來源的油。栽體也可包含其他組分，例如防腐劑、懸浮劑、增溶劑、緩沖劑等。當(dāng)向鞘內(nèi)施用試劑時(shí)，也可將其溶解在腦脊液中。對(duì)于透粘膜給藥或透皮給藥，可使用適合于待穿透的屏障的穿透劑遞送試劑。此類用于透粘膜給藥的穿透劑在本領(lǐng)域內(nèi)通常是已知的，例如膽汁酸鹽和夫西地酸衍生物。此外，去垢劑可用于促進(jìn)滲透。透粘膜給藥可通過鼻腔噴霧或使用栓劑進(jìn)行，例如Sayani和Chien，Cr/fT力erCarr/erS/sf85—184，1996。對(duì)于局部透皮給藥，可將試劑配制成軟骨、乳骨、藥骨、粉劑和凝膠。透皮給藥系統(tǒng)也可包括貼劑。對(duì)于吸入，可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何系統(tǒng)包括無水煙霧劑、液體遞送系統(tǒng)、空氣噴射霧化器、噴射系統(tǒng)等遞送本發(fā)明的試劑，參見，例ft口，Patton，"2'ofec力J&'141-143，1998;4吏用例^tDuraPharmaceuticals(SanDiego,CA)、Aradigra(Hayward，CA)、Aerogen(SantaClara,CA)、InhaleTherapeuticSystems(SanCarlos,CA)等的多肽大分子的產(chǎn)品和吸入遞送系統(tǒng)。例如，可以煙霧劑或水劑(mist)的形式施用藥物制劑。對(duì)于煙霧劑施用，可以以精細(xì)^L粒的形式與表面活性劑和噴射劑一起提供制劑。在另一個(gè)方面，用于遞送制劑至呼吸組織的裝置是其中使制劑蒸發(fā)的吸入器。其他液體遞送系統(tǒng)包括，例如，空氣噴射霧化器。本發(fā)明的試劑也可以持續(xù)遞送或持續(xù)釋放的機(jī)制(所述機(jī)制可在內(nèi)部遞送制劑)施用。例如，可將能夠持續(xù)遞送肽的生物可降解的微球或膠嚢或其他生物可降解的聚合物結(jié)構(gòu)包含在本發(fā)明的制劑中(例如，Putney和Burke，yVa"/"ec力16:153-157，1998)。在制備本發(fā)明的藥物中，可使用和操作多種制劑修飾來改變藥物動(dòng)力學(xué)和生物分布。用于改變藥物動(dòng)力學(xué)和生物分布的許多方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。此類方法的實(shí)例包括在由物質(zhì)例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)(例如，脂質(zhì)體，參見下面)、糖或合成的聚合物(上面描述的)組成的栽體中保護(hù)本發(fā)明的組合物。關(guān)于藥物動(dòng)物學(xué)的一般描述，參見例如，Remington's。在一個(gè)方面，將包含本發(fā)明的試劑的藥物制劑包裝入脂質(zhì)單層或雙層例如脂質(zhì)體中，參見，例如，美國(guó)專利6，110,490、6,096,716、385，283，185和5，279,833。本發(fā)明也提供了其中已將本發(fā)明的水溶性調(diào)節(jié)劑附著至單層或雙層的表面的制劑。例如，可將肽附著至含有酰肼-PEG-(二硬酯酸磷酸脂酰)乙醇胺的脂質(zhì)體(例如Zalipsky等人，5/0co/yi^C力e/z^705-708,1995)?？墒褂弥|(zhì)體或任何形式的脂質(zhì)膜例如平面脂質(zhì)膜或完整細(xì)胞例如紅細(xì)胞的細(xì)胞膜。可使用任何方法包括通過靜脈內(nèi)、透皮(Vutla等人，/尸/ar邊5W《乂'5-8，1996)、透粘膜或口服途徑施用脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明也提供了其中本發(fā)明的核酸、肽和/或多肽被整合入微團(tuán)和/或脂質(zhì)體的藥物制劑(Suntres和Shek，/力ar邁":23-28，1994;Woodle等人，戶AaiTBk義'260-265，1992)?？砂凑諛?biāo)準(zhǔn)方法制備脂質(zhì)體和脂質(zhì)體制劑，所述制劑在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的，參見例如，Remington's;Akimaru等人，CWoh'膽#。/7力er丄'197-210，1995;Alving等人，齡5-31，1995;Szoka和Papahadjopoulos,ieK"/o/7力"A/oe/7g義'467-508，1980，美國(guó)專利4，235，871、4，501，728和4，837，028。依賴于施用的方法，可以多種單位劑型施用本發(fā)明的藥物組合物。用于常規(guī)的藥物組合物的劑量對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。這樣的劑量在自然狀況下通常是建議性的，依賴于特定的治療背景、患者耐受力等對(duì)其進(jìn)行調(diào)整。足以實(shí)現(xiàn)該用途的試劑的量定義為"有效量"。用于該用途的劑量方案和有效量即"給藥方案"將依賴于多種因素，包括疾病或病癥的階段、疾病或病癥的嚴(yán)重度、患者健康的一般狀況、患者生理狀況、年齡、藥物制劑和活性劑的濃度等。在計(jì)算用于患者的劑量方案中，也考慮施用的模式。劑量方案也必須考慮藥物動(dòng)力學(xué)，即藥物組合物的吸收率、生物利用度、代謝、清除等。參見，例如，Remington's;Egleton和Davis，〃1431-1439，1997;Langer，5We/ce雄1527-1533，1990。根據(jù)這些方法，本發(fā)明定義的試劑和/或藥物組合物可與一種或多種其他試劑共施用。此處的"共施用"是指在相同的制劑中同時(shí)施用不同的途徑相繼施用。此處的"相繼"施用是指兩種類型的試劑和/或藥物組合物的施用之間的從秒至分鐘、小時(shí)或天的時(shí)間差異。可以任何順序進(jìn)行試劑和/或藥物組合物的共施用?？蛇x擇地，通過使用靶向性系統(tǒng)例如抗體或細(xì)胞特異性配體或特異性核酸分子，可將靶向療法用于更特異地將活性劑遞送至某些類型的細(xì)胞。因?yàn)樵S多原因例如如果試劑具有不可接受的毒性或如果其不能夠進(jìn)入把細(xì)胞，那么粑向可以是想要的。不用直接施用試劑，可在靶細(xì)胞中例如在病毒載體例如上述栽體或在基于細(xì)胞的遞送系統(tǒng)例如美國(guó)專利5，550，050和國(guó)際專利公開號(hào)W092/19195、W094/25503、W095/01203、W095/05452、W096/02286、W096/02646、W096/40871、W096/40959和WO97/12635中描述的系統(tǒng)中產(chǎn)生其?？蓪⒃泽w靶向靶細(xì)胞。設(shè)計(jì)基于細(xì)胞的遞送系統(tǒng)以在想要的靶位點(diǎn)植入患者體內(nèi)，所述遞送系統(tǒng)包含靶試劑的編碼序列?？蛇x擇地，可以前體形式施用所述試劑，所述前體形式可被待治療的細(xì)胞中產(chǎn)生的活性劑或被靶向所述細(xì)胞的激活劑轉(zhuǎn)化成活性形式。參見，例如，歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?425731A和國(guó)際專利/>開號(hào)WO90/07936。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的組合物例如試劑的試劑盒。所述試劑盒也可包括教導(dǎo)此處所描述的本發(fā)明的方法和用途的說明材料。的變化外的改變和修飾。要理解本發(fā)明包括所有此類變化和修飾。本發(fā)明也包括本說明書中單個(gè)地或一起提及的或指出的所有步驟、特征、合。通過下列非限定性實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明實(shí)施例1BH3結(jié)構(gòu)域突變體重組蛋白和合成得多肽使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)所有重組蛋白。以GST融合蛋白的形式表達(dá)在其C末端具有25個(gè)氨基酸截?cái)嗟闹亟M人Bel-Xl(Bc1-XlAC25)和在其N末端具有151個(gè)氨基酸截?cái)嘁约霸谄銫末端具有23個(gè)氨基酸截?cái)嗟男∈驧cl-l(Mcl-1AN151AC23)，然后如之前所描述的(Day等人Ce//Ze"Afl"dZ277ei"e"〃a〃0/7"125-1132，1999;Hinds等人.2003同上)使用PreScission蛋白酶將其從谷光苷肽-瓊脂糖柱上切離，然后對(duì)其進(jìn)行純化。使用模擬位(Mimotope)(Victoria,Australia)分析合成的肽，通過反相HPLC進(jìn)行純化，純度大于90%。除非另外指出，所有肽對(duì)應(yīng)于人BH3結(jié)構(gòu)域序列。使用電噴射質(zhì)語測(cè)定法確證其本體。稱取肽的重量，以1-2mM的貯液形式將其溶解在水中，在檢測(cè)之前通過測(cè)量其在280nm處的吸光率確定其濃度。^蓊#j^種建伴使用互補(bǔ)寡核苷酸通過連接體序列(GGGT)將包含Bim(DMRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYARR)(SEQIDNO:1)或Bad(NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKKG)(SEQIDNO:4)或mNoxaA(SEQID9)或Bid(SEQID7或Bak(SEQID11)的BH3結(jié)構(gòu)域的26個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽融合至M13噬菌體基因3(殘基249至406)序列的氨基末端，所述寡核苷酸也分別在5'和3'末端產(chǎn)生用于克隆入Fairlie等人尸T0fe//2fA77ress/0/7a/ztfPur/ZVcaf/o"26.171—178，2002之前4笛述的噬菌粒載體的)VC0/和if/7i2/限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。此后上述肽序列中的殘基參照其在26聚體中的序列位置。為了產(chǎn)生序列的FLAG標(biāo)記形式，使用Kunkel誘變方法(Kunkel等人.紐，/M心125-139，1991)將編碼FLAG表位的寡核苷酸在已融合至上述的基因3的肽序列的N末端環(huán)入(loop-in)所需的序列。對(duì)于BimBH3或其他BH3序列的丙氨酸掃描構(gòu)建體和其他點(diǎn)突變，在對(duì)FLAG-BimBH3或FLAG-BadBH3模板進(jìn)行的Kunkel誘變反應(yīng)中使用具有想要的密碼子錯(cuò)配的寡核苷酸。通過化學(xué)方法將誘變反應(yīng)物轉(zhuǎn)化入SS320大腸桿菌菌株，然后在M13K07輔助噬菌體存在的情況下培養(yǎng)過夜后，使用之前描述的鹽/聚乙二醇沉淀法(Sidhu等人#e^o&i"/z/邁(7"《333-363，2000)從細(xì)胞上清液分離噬菌體顆粒。實(shí)施例2噬菌體如之前所述(Fairlie等人./j/o/C/e/zz27義'2125-2134，2004)進(jìn)行所有ELISA。在各情況下，在4C下將促存活Bcl-2樣家族蛋白(5yg/mL)或M2抗FLAG抗體(0.5mg/mL)包被在Maxisorp96孑L板上過夜。在用6%(w/v)的PBS中的脫脂奶粉封閉后，以合適的稀釋度在PBS/0.1%(v/v)Tween-20/1%(w/v)脫脂奶粉中加入嗟菌體，在振蕩條件下在室溫下溫育1.5小時(shí)。在用PBS/Tween洗滌后，使用過氧化物酶綴合的抗M13抗體檢測(cè)結(jié)合的噬菌體。對(duì)于竟?fàn)帨y(cè)定法，使用不同濃度的Bc卜2樣蛋白溶液，通過在室溫下共溫育1.5小時(shí)來取代固定的亞飽和稀釋度(sub-saturatingdilution)的嗟菌體展示BimBH3或其他BH3肽對(duì)固定的Bcl-2樣蛋白的結(jié)合。為了確定相對(duì)于天然序列，結(jié)合親和力是減少還是增加，用野生型BimBH3或BadBH3的ICs。值除以促存活蛋白的丙氨酸掃描突變體的ICs。值。表面爭(zhēng)岸f傳^孩fi5i/r/"ace//as邁o/7Teso/2a/2ceJ使用表面等離子體共振在Biacore3000生物傳感器(以HBS(10mMHEPESpH7.2，150mMNaCl，3.4mMEDTA，0.005%Tween20)作為電泳緩沖液)上確定促存活Bcl-2蛋白的野生型和突變BimBH3肽的相對(duì)親和力。使用胺偶聯(lián)化學(xué)物質(zhì)(Wilson-Annan等人，同上)固定26聚體BimBH3和對(duì)照非結(jié)合BimBH3突變體。通過將固定的亞飽和濃度(大約10nM)的促存活Be1-2與不同量的竟?fàn)嶣H3蛋白在冰上在HBS中溫育超過2小時(shí)，比較其與固定的BimBH3肽竟?fàn)帉?duì)Bcl-2樣蛋白的結(jié)合的能力來估量BH3肽對(duì)促存活Bel-2樣蛋白的相對(duì)親和力(Wilson-An醒等人.o,CW/》/0/0g/嵌877-888,2003;Chen等人.Ce/777:393-403，2005)。然后在包含槽(在其上固定有野生型BimBH3)和對(duì)照槽(固定有非結(jié)合BimBH3突變體)的CM5傳感器芯片上注射所述混合物。減去基線反應(yīng)(對(duì)照槽)，從而獲得絕對(duì)結(jié)合反應(yīng)。然后如之前所述(Chen等人.2005同上)分析數(shù)據(jù)。逆掙錄病毒浙定法使用Lipofectamine(Invitrogen)將親本pMIG質(zhì)粒DNA或包含編碼Bim或Bim突變體的插入片段的pMIG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入PhoenixEcotropic包裝細(xì)胞(http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral-systems/phx.html)(Kinesella和Nolan,1996)。通過旋轉(zhuǎn)接種(在4jig/mL聚凝胺(Sigma)存在的情況下在32。C下以2，500rpm離心"分鐘)使用經(jīng)過濾的包含病毒的上清液感染感染3T9小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)。常規(guī)地獲得超過90%的感染效率。從StanleyKorsmeyer教授獲得SV40大T抗原固定的野生型和Bax+Bak+MEFS并將其保持在完全DME中。使用被感染的細(xì)胞(GFP+ve;FL-1)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析確定細(xì)胞的存活率(對(duì)于短期存活測(cè)定)，通過使用FACScan(BectonDickinson)分析，所述被感染的細(xì)胞排除5Hg/mL碘化丙啶(Sigma)(FL-3)。實(shí)施例3萬/yz7和^AW潛^誠(chéng)4^霧伴丄#^3和^#傻存活家族蛋^的潛合在進(jìn)行BimBH3和其他BH3結(jié)構(gòu)域的任何結(jié)構(gòu)-功能分析之前，首先必需確定序列是否可在噬菌體上展示，和確定其是否以這樣的方式起作用，所述方式與觀察到的例如BimBH3或BadBH3合成肽在其他生物化學(xué)測(cè)定中對(duì)促存活Bcl-2蛋白的結(jié)合方式相似。在初步測(cè)定中，就其對(duì)固定的Bel-Xl和Mcl-1的直接結(jié)合的能力檢測(cè)BimBH3和其他BH3噬菌體。觀察到兩種BH3結(jié)構(gòu)域?qū)el-^的相對(duì)強(qiáng)的可滴定的結(jié)合，同時(shí)只有BimBH3結(jié)合Mcl-l。這與之前顯示Bim可以以高親和力結(jié)合所有促存活蛋白同時(shí)Bad對(duì)于Bcl-x。Bcl-2和Bcl-w是特異性的數(shù)據(jù)一致(Chen等人，2005同上)。使用竟?fàn)帨y(cè)定法進(jìn)一步估量相互作用的特異性，在所述竟?fàn)帨y(cè)定法中，在溶液中用對(duì)應(yīng)的重組蛋白竟?fàn)幨删w對(duì)固定的蛋白的結(jié)合。獲得的IC5o值顯示于表3中，其與在表面等離子共振BIAcore儀(Chen等人2005同上)上使用表面等離子共振和使用等溫量熱術(shù)(isothermalcalorimetry)(數(shù)據(jù)未公開)測(cè)量的BimBH3和BadBH3合成肽的ICs。值非常相似。表3噬菌體展示的BH3-only蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域?qū)Υ俅婊頑cl-2樣蛋白的結(jié)合親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>為了研究BimBH3或BadBH3結(jié)構(gòu)域序列中的特定殘基對(duì)結(jié)合Bcl-2樣促存活蛋白的重要性，產(chǎn)生成組的突變構(gòu)建體，在所述構(gòu)建體中將各殘基單個(gè)地突變成丙氨酸，或在其中丙氨酸或甘氨酸是野生型殘基的位置上，將其突變成谷氨酸。將各突變體作為融合至M13噬菌體上的g3的N端的融合物單價(jià)地在M13噬菌體上表達(dá)，然后就其對(duì)固定的促存活蛋白以及對(duì)抗FLAG抗體的結(jié)合的能力對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。產(chǎn)生在氨基末端都具有FLAG表位的所有構(gòu)建體，因?yàn)閷?duì)抗FLAG抗體的結(jié)合提供了可用于估量各肽之間表達(dá)水平的差異的方法。為了確定用于竟?fàn)嶦LISA中的各突變噬菌體的亞飽和稀釋度，進(jìn)行初步滴定測(cè)定。為了確定突變肽對(duì)促存活蛋白的結(jié)合親和力，則在竟?fàn)嶦LISA中使用在滴定測(cè)定法中確定的亞飽和稀釋度的噬菌體檢測(cè)噬菌體突變體。噬菌體展示的BH3突變體對(duì)Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-2和/或Mcl-l中的一種或多種的結(jié)合的親和力顯示于表4a至4e中。表4a噬菌體展示的BimBH3突變體對(duì)Bc1-Xl、Bcl-w、Bcl-2和Mc卜l的結(jié)合的親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>NB-無結(jié)合倍數(shù)/wt=每野生型倍數(shù)表4b噬菌體展示的BadBH3突變體對(duì)Bcl-XL、Bcl-w和Bcl-2的結(jié)合的親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>表4c<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表4d<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表4e<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>參考表4a.三種突變體A9E、G16E和D1A，即使對(duì)抗FLAG抗體的結(jié)合可與所有其他突變體相當(dāng)，但在最初的滴定中顯示不結(jié)合Bel-xu這表明觀察到的效應(yīng)不是異常表達(dá)的結(jié)果。對(duì)于幾乎5種受試突變體，在BimBH3結(jié)合上ICs。值的變化只隨小于4的因數(shù)而改變。由于A9E、G16E和D17A的結(jié)合很弱，不能獲得這些突變體的實(shí)際定量親和數(shù)據(jù)，然而，L12A和F19A的結(jié)合大約分別比野生型BimBH3弱50和20倍(ICs。=130nM和60nM)。根據(jù)可獲得的不同BH3-only蛋白和促存活Bcl-2樣蛋白之間的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)了解到BH3結(jié)構(gòu)域的袋中。因此預(yù)期這些殘基可明顯促成兩個(gè)家族的蛋白之間的結(jié)合能(如對(duì)于上述L12A和F19A突變體所看到的)的產(chǎn)生。從而基于竟?fàn)帨y(cè)定的結(jié)果，有趣地注意到將其他兩個(gè)疏水殘基突變(除了L12和F19)，18和115突變成丙氨酸不表現(xiàn)具有對(duì)其對(duì)Bcl-XL的結(jié)合的任何顯著影響049BimBH3對(duì)Mc卜l參考表4a。大多數(shù)針對(duì)Mcl-1的受試BimBH3丙氨酸突變體與它們對(duì)Bcl-Xt的結(jié)合能力相比，未表現(xiàn)具有對(duì)結(jié)合的顯著影響。只有兩個(gè)突變，G16E(38倍)和D17A(15倍)對(duì)與Mcl-l的結(jié)合具有顯著的影響，盡管這些影響不如觀察到的對(duì)相同突變體與Bcl-XL的結(jié)合的影響大。此外，與它們和Bc1-Xl的相互作用相反，L12A突變和F19A突變都不具有對(duì)結(jié)合的任何可檢測(cè)的影響。再一次地，通過檢測(cè)對(duì)FLAG抗體的結(jié)合來驗(yàn)證不同突變體在噬菌體表面的表達(dá)。表4a中的結(jié)果總地表明Bim雙突變體L12A/F19A，與任何天然發(fā)生的BH3only蛋白不同，應(yīng)當(dāng)對(duì)于Mcl-l是有選擇性的。實(shí)施例5中顯示了該關(guān)系。BadBH3對(duì)Bcl-xBc卜w和Bcl-2:參考4b。類似地，提供的數(shù)據(jù)表明具有突變F19A的BadBH3結(jié)構(gòu)域?qū)τ贐el-xL是有選擇性的，具有D17A或F23A的BadBH3結(jié)構(gòu)域?qū)τ贐el-Xl和Bel-w是有選擇性。BidBFD對(duì)Bc卜Xl、Bc卜w和Mc卜1:參考表4c。類似地，提供的數(shù)據(jù)表明具有突變18A或A13E的BidBH3結(jié)構(gòu)域?qū)τ贐cl-w是有選擇性的。BakBH3對(duì)Bc卜xL和Mc卜l參考表4e。具有突變V8A或I19A的BakBH3對(duì)于Mcl-1是有選擇性的。類似地雙突變R10A/Q11A對(duì)于Mcl-l是有選擇性的。如表4a至4e中所示的數(shù)據(jù)所反映的，很清楚對(duì)保持(或形成)復(fù)合物具有重要作用的殘基在不同的BH3-only蛋白和促存活蛋白配體之間是不同的。例如BimBH3和Bel-x^之間的相互作用涉及許多殘基包括L12、F19和特別是D17，同時(shí)BadBH3/Bcl-xl相互作用更依賴于L12的接觸。實(shí)施例4L12,D17,F19的詳細(xì)結(jié)構(gòu)－功能分析在通過研究例如上述丙氨酸掃描誘變鑒定了BH3結(jié)構(gòu)域-促存活相互作用的至關(guān)重要的殘基后，則可進(jìn)行這些殘基的系統(tǒng)性替代以確定在這些位點(diǎn)的各位點(diǎn)上可被耐受的氨基酸殘基的物理化學(xué)性質(zhì)。例如，在BimBH3中的對(duì)于對(duì)Bc卜Xl的結(jié)合非常重要的L12的情況下，可估量用其他更大的疏水殘基例如異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸或更小的氨基酸例如纈氨酸取代其的影響。然后將這些結(jié)合親和力與前面描述的野生型序列比較。可在小分子擬肽類藥物設(shè)計(jì)中利用來源于所述實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。在上述實(shí)施例中，如果在用酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸取代后觀察到非常弱的結(jié)合，那么經(jīng)設(shè)計(jì)模擬亮氨酸相互作用的小分子可避免使用上述氨基酸側(cè)鏈中發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀基團(tuán)?？蛇x擇地，如果耐受上述殘基而在親和力上無顯著減少，那么可包含相似大小的環(huán)狀化合物。在BimBH3對(duì)Bcl-xL的結(jié)合的情況下，當(dāng)側(cè)鏈的大小從苯丙氨酸增加至色氨酸，觀察到5至22倍的結(jié)合親和力的累進(jìn)減少(表5)。類似地，側(cè)鏈長(zhǎng)度從纈氨酸至丙氨酸的減少導(dǎo)致親和力減少大約50至80倍。表5具有在BimBH3位點(diǎn)12、17和19上的置換，所述置換不引起低于100nM的對(duì)于4種促存活分子的親和力的減少。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>表5在L12、D17和F19處的BimBH3突變體這些結(jié)果連同結(jié)構(gòu)分析一起提供了用于設(shè)計(jì)模擬Bim在對(duì)Bc1-Xl、Bcl-2、Bcl-w和Mcl-l的結(jié)合上的作用的小分子化合物的合適構(gòu)架。w"-oox逸.2vt.2■2tm.S絮奪龍ss一-，智表5中的數(shù)據(jù)教導(dǎo)如何產(chǎn)生促存活特定BH3序列的方法。因此，包含L12A、L12Q、L12H、D17R、F19D、F19K中的任一個(gè)突變的BimBH3對(duì)于Mcl-1是特異性的，對(duì)于上述突變的組合的選擇也具有相同的效果。實(shí)施例5為進(jìn)一步驗(yàn)證噬菌體展示篩選結(jié)果，在竟?fàn)帨y(cè)定法中使用在BIAcore裝置上進(jìn)行的表面等離子體共振分析和檢測(cè)許多對(duì)應(yīng)于目的序列的肽。在這些實(shí)驗(yàn)中，確定所述肽對(duì)促存活家族的所有成員(即Bcl-2、Bc1-Xl、Bcl-w、Mcl-l和Al)的親和力，這些測(cè)定的結(jié)果顯示于表6中。就其結(jié)合不同促存活Bcl-2樣蛋白的能力檢測(cè)4種其中4個(gè)保守性疏水殘基(18、L12、115和F19)中的每一個(gè)^L單個(gè)地突變成丙氨酸的合成肽。I8A和I15A突變體保持野生型對(duì)促存活蛋白的結(jié)合親和力，這與從噬菌體ELISA獲得的結(jié)合相當(dāng)一致。L12A突變體對(duì)Bcl-2、Bcl-w和Bcl-x^的結(jié)合親和力減少了30至70倍，同時(shí)對(duì)其余兩種促存活蛋白Mcl-1和A1的結(jié)合只受到輕微影響，觀察到的結(jié)合親和力分別減少2和7倍。這些結(jié)果再次與之前描述的^菌體ELISA結(jié)果相當(dāng)一致。F19A突變肽對(duì)不同促存活Bcl-2樣蛋白的結(jié)合似乎只受到輕微影響，其對(duì)Bcl-w的結(jié)合受到的影響最大，觀察到結(jié)合親和力減少8倍。對(duì)其余促存活蛋白的結(jié)合親和力的減少低于3倍。表6在Biacore儀器上通過表面等離子共振測(cè)量的BimBH3突變合成肽對(duì)促存活Bel-2樣蛋白的結(jié)合親和力相對(duì)野生型BimBH3肽對(duì)Bcl-2樣蛋白的結(jié)合親和力的差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>使用來自噬菌體分析和Biacore的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)可對(duì)于特定促存活蛋白是特異性的序列。因?yàn)榕c其他促存活蛋白相比，Mcl-l似乎耐受大多數(shù)丙氨酸突變，因此其提供了適合檢測(cè)該想法的靶。組合Bim上的L12和F19的丙氨酸置換，因?yàn)檫@些置換似乎都不影響對(duì)Mcl-l的結(jié)合，但對(duì)Bcl-x^Bcl-2和Bel-w結(jié)合具有中等影響。如所預(yù)期的，包含這些突變的BimBH3結(jié)構(gòu)域合成肽對(duì)與Bel-x"Bcl-2和Bel-w的結(jié)合具有顯著的破壞效應(yīng)(在親和力上大于500倍的減少)但基本上保持對(duì)Mcl-l的野生型親和力。實(shí)施例6勿應(yīng)縱迄今已檢測(cè)了26個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的BimBH3肽內(nèi)的不同突變(當(dāng)在噬菌體顆粒上展示時(shí)或作為合成肽時(shí))對(duì)與不同促存活蛋白的結(jié)合的影響。因此接下來重要的是驗(yàn)證當(dāng)整合入全長(zhǎng)Bim蛋白時(shí)觀察到的效應(yīng)是可重現(xiàn)的，以及使數(shù)據(jù)與不同突變的生物學(xué)結(jié)果發(fā)生相關(guān)性。因此將各個(gè)至關(guān)重要的突變體整合入通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的BimS表達(dá)載體。然后在感染后30小時(shí)測(cè)量細(xì)胞的存活率。用消除對(duì)促存活蛋白的結(jié)合的Bim突變體感染的細(xì)胞預(yù)期可保持存活。然而，不影響結(jié)合的突變體應(yīng)當(dāng)保持致死活性。表7中顯示了來自致死測(cè)定的代表性數(shù)據(jù)。如所預(yù)期的，野生型Bim能夠有效地殺死小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，通過碘化丙啶(PI)排除法測(cè)量的細(xì)胞存活率為19%。類似地，當(dāng)將F19A突變整合入全長(zhǎng)Bim蛋白并在MEF中表達(dá)時(shí)，該突變蛋白幾乎與天然Bira—樣有效地殺死細(xì)胞，這與該突變體以接近野生型親和力結(jié)合所有促存活蛋白的能力一致。G16E突變體在游離的合成肽和噬菌體上展示的背景中已喪失大量的對(duì)所有促存活蛋白的親和力，這反映了該突變體不能殺死MEF(93。/。的細(xì)胞存活率)。在D17A突變體的情況下，在噬菌體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，我們不能檢測(cè)到當(dāng)在噬菌體顆粒的表面表達(dá)時(shí)該突變體對(duì)Bel-Xl的任何結(jié)合。與該結(jié)果一致，野生型MEF不表現(xiàn)被BimS(D17A)殺死(89X的細(xì)胞存活率)，這表明，在一些情況下，使用噬菌體展示的肽獲得的結(jié)合數(shù)據(jù)與游離的合成肽相比可以更準(zhǔn)確地反映它們的結(jié)合能力。由Willis等人Ce;7esa"f/"e^3/o/7歷e/^7義1294-1305，2005所做的以前的工作已證明Mcl-1和Bcl-XL的失活都足以產(chǎn)生有效的Bak介導(dǎo)的凋亡(Willis等人，2005同上)。A9E和L12A突變體對(duì)Bel-w、Bel-2和Bel-xL的結(jié)合親和力都具有適度的減少，同時(shí)仍保持接近對(duì)于Mc卜l和Al的野生型親和力。這與當(dāng)兩種突變體在野生型MEF中表達(dá)時(shí)觀察到的中等殺傷一致。當(dāng)整合入全長(zhǎng)Bim蛋白時(shí)也檢測(cè)18A和I15A突變體的殺死能力。與都表明任一突變都不影響促存活蛋白結(jié)合的噬菌體和BIAcore的結(jié)果一致，這些突變體能夠殺死野生型MEF，達(dá)到與天然Bim蛋白相同的程度。作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同突變體殺死Bax/Bak雙缺陷型MEF的能力。如所預(yù)期的，沒有突變體殺死這些細(xì)胞，因?yàn)锽ax和Bak是促進(jìn)(commitment)細(xì)胞死亡所需要的。表7當(dāng)在野生型和Bax/Bak雙缺陷型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)中表達(dá)為全長(zhǎng)蛋白(BimS)時(shí)，永生化的MEF被Bim突變體殺死BlmSi突變體在野生型MEF中的存活％—在Bax-/-Bak-/-MEFs中的存活%wtBlmS19卯BlmSA9E5593BlmSU2A5791B，mSG16E9397BlmSD17A8994BlmSF19A2287本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到此處描述的發(fā)明除了明確描述的實(shí)施方案外易于改變和修改。要理解本發(fā)明包括所有此類改變和修飾。本發(fā)明也包括本說明書中提及的或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，包括單個(gè)地或集體地步驟、特征、組合物和化合物，以及任何兩個(gè)或更多個(gè)所述步驟或特征的任何和所有組合。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>FairiieW。Z.尸ra紐/"fijqw柳/owflfwfPw訴c。"ow抓171-178,2002FixiVwr/n及w":1760-1764，19訴Glickm旭wcr/.,J5/o;wWScr柳7:3-10，2002Hajduke/CAg怖:2315-2317，1999;Hindse/a/.SAfflOJowr"W";1497-1507,2003HuangandStrasser，Ce///仍:839-842,2000Johnson"r/tfer"wA///we/JcjinJWo/ecA加/ogyww/外flrrw。qy,Johnstonew。/.,CW/7站:153-164，2002KunkelefW.她Ao必級(jí)125-139,1991KunASc/麵"7:1078-1082,1992Langcr,Sc/幼ce2移:1527-1533,1990Letaiw。/.，C朋ce/"Ce//2:183-192,2002;LugovskoywJj/wCAe加5ocW4:1234-1240，2002PattonMrf5totec/j7&141-143，19卯Pellect;hiaef。Z,，Wotf及evDrMgDtecov:2U-219,2002Pe加sefa"2000,鄉(xiāng)ra;Sttttl欲ef1997,SifproiPezzutoe/a/.,Eds"ChapmanandHaU，NewYork,1993Printw。/.尸rocW"r/5WWWPJ:12424-12431,1998PutneyandBurke,WW所o紐cA/tf:153-157,1998Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEdition^MackPublishingCompany,Easton,PA,l卿Sam咖nrf/尸/w，/Vkww卿/你l19-135,1996Sayani抑dChien,Crtt及evT^er￡>rwgOwrter辦W/3:85-184,1996Sidhue/a/,A/erto必五n^wo/32&'333-363,2000Strassere/a/.,Wflft/re34&331-333,19卯Suntres肌dShek，"Ao/w/Vi。rmaco/你23-28,1994SzokaandPapahadjopoulos,及ev5toengP:467-508，1980vandeWaterbee邁dandOifford,MzfitevZ)rwgZ)tec2:192-204，2003Vauxeffl〖.,Mrfww3":440"442,l卯8Vutla<"A簡(jiǎn)5W戰(zhàn)5-8,1996Wdwa/.,5W畫2":727-730,2001Wells,JWe//wwfef>K7/no〖202:2699-2705,1991Willise(G-rtMa"^Z3eve/o/we/rf/P..1294-1305,2005Wilson-Annan"crf.Jb腦a/o/CW/J/o/o幼嵐'877-咖,2003Wohnslande/a/.,JA/fOww^:923-930,2001WoodkiViarw及wP:260265,1992Y助wJC"6說o(w/月ow她似&加'620-630,2000ZalipskyW"/.,JWocwj/wgCAe加(5:705-708,1995Zh旭g,Wo/及ev2tocovJ:101-102，200權(quán)利要求1.產(chǎn)生促存活Bc1-2家族成員的拮抗劑的方法，所述方法包括步驟a.突變來自BH3-only促凋亡蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；b.將突變的BH3結(jié)構(gòu)域與促存活Bc1-2家族成員接觸；c.檢測(cè)突變的BH3結(jié)構(gòu)域與促存活Bc1-2家族成員之間的結(jié)合的存在或不存在，從而鑒定促凋亡蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域中與BH3結(jié)構(gòu)域和促存活Bc1-2家族成員的結(jié)合相互作用相關(guān)的氨基酸殘基；和d.產(chǎn)生拮抗劑，所述拮抗劑模擬在BH3結(jié)構(gòu)域與Bc1-2蛋白之間發(fā)生結(jié)合所必需的氨基酸處的野生型BH3結(jié)構(gòu)域。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述拮抗劑對(duì)于選自Bcl-2、Bc1-Xl、Bcl-w、Mcl-l和Al的促存活蛋白是特異性的。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述拮抗劑基于選自Noxa、Bim、Puma、Bmf、'Bad、Bik、Hrk和Bid的BH3-only蛋白的結(jié)構(gòu)。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述Bcl-2拮抗劑抑制癌癥細(xì)胞的促存活蛋白。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述癌癥選自ABL1原癌基因、AIDS相關(guān)性癌癥、聽神經(jīng)瘤、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞樣白血病、嚢性腺樣癌、腎上腺皮質(zhì)癌、特發(fā)性骨髄外化生、斑殼、軟組織腺泡狀肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性貧血、星形細(xì)胞瘤、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、基底細(xì)胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦和兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、類癌瘤、子宮頸癌、兒童期腦腫瘤、兒童期癌、兒童期非白血性白血病、兒童期軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病、結(jié)腸直腸癌、皮膚T淋巴細(xì)胞瘤、隆凸性皮膚纖維肉瘤、結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤、導(dǎo)管癌、內(nèi)分泌癌、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏肉瘤、肝外膽管癌、眼癌、目艮黑素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、輸卵管癌、范可尼貧血、纖維肉瘤、膽嚢癌、胃癌、胃腸癌、胃腸類癌瘤、泌尿生殖器腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、妊娠性滋養(yǎng)層細(xì)胞病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、婦科癌癥、血液腫瘤、毛細(xì)胞性白血病、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、遺傳性乳腺癌、組織細(xì)胞增多病、何杰金病、人乳頭狀瘤病毒、葡萄胎、高血鈣癥、喉咽癌、眼內(nèi)黑色素瘤、胰島細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥、喉癌、平滑肌肉瘤、非白血性白血病、李弗勞明綜合征、唇癌、脂肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水腫、淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、男性乳癌、腎的惡性棒狀腫瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑素瘤、Merkel細(xì)胞癌、間皮瘤、轉(zhuǎn)移癌、口腔癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤綜合征、萆樣肉芽腫、骨髄增生異常綜合征、骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻癌、鼻咽癌、腎胚細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤病、nijmegen染色體斷裂綜合征、非黑素瘤皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌-(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造瘺術(shù)卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、甲狀旁腺腫瘤、腮腺癌、陰莖癌、原始神經(jīng)外胚層腫瘤、腦下垂體癌、真性紅細(xì)胞增多癥、前列腺癌、rare-cancers-and-associated-disorders、腎細(xì)胞癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、先天性血管萎縮性皮膚異色病、涎腺惡性腫瘤、肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、惡性皮膚網(wǎng)狀細(xì)胞增多綜合征、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌(SCLC)、小腸癌、軟組織肉瘤、脊髓瘤、皮膚鱗狀細(xì)l包癌(squainous-cel卜carci醒a(bǔ)-(skin))、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌(thymuscancer)、甲狀腺癌、移行細(xì)胞癌(膀胱)(transitional-cell-cancer-(bladder))、移行細(xì)胞癌(腎臟-骨盆-/-輸尿管)、滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、輸尿管癌、泌尿系統(tǒng)腫瘤、異地排尿(uroplakins)、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、外陰癌、華氏巨球蛋白血癥和維爾姆斯氏腫瘤。6.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述拮抗劑抑制促存活蛋白。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。8.治療受試者中的癌癥的方法，所述方法包括在在足以誘導(dǎo)癌癥的凋亡或減輕癌癥癥狀的時(shí)間和條件下給所述受試者施用有效量的通過權(quán)利要求1的方法鑒定的促存活Bcl-2蛋白的拮抗劑。9.權(quán)利要求8的方法，其中將所述拮抗劑與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑混合以形成藥物組合物。10.權(quán)利要求8或9的方法，其中通過呼吸、氣管內(nèi)、經(jīng)鼻咽、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、顱內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、大腦內(nèi)、鼻內(nèi)、輸注、口服、經(jīng)直腸、貼附和植入途徑施用所述拮抗劑。11.預(yù)防或改善受試者中的過度增生性疾病的方法，所述方法包括有效量的促存活Bcl-2蛋白的拮抗劑。12.權(quán)利要求11的方法，其中將所述拮抗劑與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑混合以形成藥物組合物。13.權(quán)利要求11或12的方法，其中通過呼吸、氣管內(nèi)、經(jīng)鼻咽、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、顱內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、大腦內(nèi)、鼻內(nèi)、輸注、口服、經(jīng)直腸、貼附和植入途徑施用所述拮抗劑。14.在SEQIDN0:1至10的一個(gè)或多個(gè)中所示的至少一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上具有非野生型BH3-only結(jié)構(gòu)域序列的拮抗劑。15.權(quán)利要求14要求的拮抗劑，其包括具有L12A/F19A、具有對(duì)Mcl-l的選擇性的Bini。16.權(quán)利要求14的拮抗劑，其包括具有D17A或F23A、喪失對(duì)Bcl-2而不是Bcl-xt或Bc1-w的結(jié)合的Bad。17.權(quán)利要求14的拮抗劑，其包括具有F19A、具有對(duì)Bcl-Xt的選擇性的Bad。18.權(quán)利要求14的拮抗劑，其包括具有18A或A13E、具有對(duì)Bcli的選擇性的Bid。19.權(quán)利要求14的拮抗劑，其包括具有V8A或119A、具有對(duì)Mcl-l的選擇性的Bak。20.權(quán)利要求14的拮抗劑，其包括具有R10A或Q11A、具有對(duì)Mcl-l的選擇性的Bak。21.權(quán)利要求14的拮抗劑，其包括具有L12至A或G或T或Q或H置換的Bim或具有D17至R置換的Bim或具有F19至D或K置換的Bim、且具有對(duì)Mcl-1的選擇性的Bim。22.權(quán)利要求14的拮抗劑，其包括具有L12Y和F19至R、H、N或E置換的Bim、且是具有對(duì)Bcl-2的選擇性給合的Bim。全文摘要本發(fā)明通常涉及用于調(diào)節(jié)靶細(xì)胞或細(xì)胞群體中的凋亡的治療性分子。更特別地，本發(fā)明提供了抑制促存活分子的和能夠誘導(dǎo)或促進(jìn)靶細(xì)胞或細(xì)胞群體例如癌細(xì)胞的凋死亡的治療劑。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生或選擇該治療分子和包含所述治療分子的藥物組合物的方法。文檔編號(hào)A61P35/00GK101248177SQ200680030608公開日2008年8月20日申請(qǐng)日期2006年6月23日優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日發(fā)明者D·C·S·黃,E·F·李,P·M·科爾曼,W·D·費(fèi)爾利申請(qǐng)人:沃爾特及伊萊薩霍爾醫(yī)學(xué)研究院