專利名稱：檢測基質金屬蛋白酶活性的多核苷酸序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于熒光蛋白的基因型分子探針，更具體地，本發(fā)明涉及一種檢測基質金屬蛋白酶活性的多核苷酸序列，包含該多核苷酸序列的表達載體，該多核苷酸序列的用途，以及在體檢測該酶活性的方法。
背景技術：
侵襲和轉移是惡性腫瘤的顯著特征，腫瘤細胞外基質(ECM)的降解是腫瘤侵襲轉移的關鍵步驟之一?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是參與細胞外基質降解的重要酶類。研究表明，腫瘤細胞的侵襲和轉移能力與其產生或誘導基質金屬蛋白酶表達的水平密切相關?；|金屬蛋白酶是一個大家族，因其需要Ca++、Zn++等金屬離子作為輔助因子而得名，其家族成員具有相似的結構，一般由5個功能不同的結構域組成(1)疏水信號肽序列；(2)前肽區(qū)，主要作用是保持酶原的穩(wěn)定。當該區(qū)域被外源性酶切斷后，MMPs酶原被激活；(3)催化活性區(qū)，有鋅離子結合位點，對酶催化作用的發(fā)揮至關重要；(4)富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)；(5)羧基末端區(qū)，與酶的底物特異性有關。其中酶催化活性區(qū)和前肽區(qū)具有高度保守性。因此，MMP已經成為抗癌藥物的重要作用靶點。
目前，進入臨床試驗治療癌癥的基質金屬蛋白酶抑制劑只有7種，且大量的藥物尚處于臨床前的研究階段。Christoph Bremer課題組合成的近紅外熒光的MMP-2底物，用于在體檢測惡性腫瘤的MMP-2活性，首次對MMP抑制劑的抗腫瘤效應實現(xiàn)了在體成像研究。然而，由于腫瘤的高度異質性和復雜性，外源性分子探針易受局部微循環(huán)的影響而在腫瘤組織內分布不均一，甚至由于局部血供不暢而無法到達。此外，該類分子探針的制備每次均需新鮮人工合成短肽分子，合成步驟難、成本高。因此，如何在活細胞內或整體動物體內快速、便捷、精確地研究MMP活性，評價MMP抑制劑的抗腫瘤效應，已成為一個亟待解決的問題。
熒光能量共振轉移(FRET)是1948年由Forster首先提出的一對合適的熒光物質可以構成一個能量供體和能量受體對，它們之間由于偶極-偶極的相互作用，激發(fā)供體分子的光子能量可能被傳遞至受體分子，而后受體分子可發(fā)射出光子。近些年，人們將熒光物質標記到所研究的對象上，構建出大量合適的能量供受體對，如CFP/YFP(藍綠色熒光蛋白/黃色熒光蛋白)，通過將它們標記到所研究的對象上，檢測它們的FRET進行核酸、蛋白質、免疫分析等方面的研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種多核苷酸序列，用于檢測基質金屬蛋白酶活性，其適用于在離體、活細胞和整體動物等不同層次上進行基質金屬蛋白酶活性的監(jiān)測及基質金屬蛋白酶抑制劑的高通量篩選。
為達到上述目的，本發(fā)明提供了下述的技術方案。
本發(fā)明提供了一種多核苷酸序列，用于檢測基質金屬蛋白酶活性的探針，其設計原理為將能發(fā)生FRET的熒光蛋白供體/受體對用MMPs識別的肽相連，構建成熒光蛋白供體-MMPs識別序列(MSS)-熒光蛋白受體的融合蛋白。使用pDisplay表達載體將這個探針錨定在細胞膜的外表面，用于檢測分泌到細胞外的MMPs活性。當細胞外液無MMPs時，此FRET探針保持其完整性，熒光蛋白供體和受體之間能夠發(fā)生熒光共振能量轉移；當腫瘤細胞高表達MMPs，分泌到細胞外液中的MMPs活性較高時，F(xiàn)RET探針被MMPs裂解，熒光蛋白供體和受體之間不能夠發(fā)生熒光共振能量轉移。因此，無論是通過FRET熒光成像還是單獨檢測熒光信號，均能靈敏地反映腫瘤細胞的MMPs活性。所述多核苷酸序列包含一個編碼供體熒光蛋白的核苷酸序列；一個編碼受體熒光蛋白的核苷酸序列；以及一個編碼肽接頭的核苷酸序列；該肽接頭連接所述的供體熒光蛋白和所述的受體熒光蛋白；所述的肽接頭為基質金屬蛋白酶家族成員特異性識別的肽接頭。
所述的肽連頭是由LEGGIPVSLRSG氨基酸序列組成。所述的供體熒光蛋白和受體熒光蛋白是可以發(fā)生FRET的供體和受體熒光蛋白對CFP/YFP。
本發(fā)明也提供了一種融合蛋白，其包含
一個供體熒光蛋白；一個受體熒光蛋白；以及一個肽接頭；該肽接頭連接所述的供體熒光蛋白和所述的受體熒光蛋白；所述的肽接頭為基質金屬蛋白酶家族成員特異性識別的肽接頭。該融合蛋白用于檢測基質金屬蛋白酶活性。
本發(fā)明也提供了一種表達載體，其包含上述的多核苷酸序列，所述的表達載體是pDisplay或pET28a。
本發(fā)明也提供了一種在體檢測基質金屬蛋白酶活性的方法包括下列步驟1)用在細胞外表面表達的，包含多核苷酸序列的真核表達載體轉染宿主細胞；2)檢測宿主細胞中的熒光信號變化，確定細胞外的基質金屬蛋白酶活性。
本發(fā)明基于熒光共振能量轉移(FRET)的供體和受體熒光蛋白，構建了可以檢測基質金屬蛋白酶活性的多核苷酸序列基因型分子探針，該探針可以實現(xiàn)離體、活細胞上進行基質金屬蛋白酶活性的監(jiān)測及基質金屬蛋白酶抑制劑的高通量篩選。


圖1A，1B和1C是檢測基質金屬蛋白酶活性的基因型分子探針結構和原理示意圖。
圖2A和2B是光譜掃描檢驗基因型分子探針YFP-LEGGIPVSLRSG-CFP對基質金屬蛋白酶活性及基質金屬蛋白酶抑制劑作用的檢測效果。
圖3是基質金屬蛋白酶抑制劑MMP2抑制劑I和GM6001效應的活細胞水平光學成像檢測。
為了更好地理解本發(fā)明，下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明進行詳細的說明。
具體實施例方式
參考圖1A，圖1B和圖1C，用圖示的形式示意了檢測基質金屬蛋白酶(MMPs)活性的基因型分子探針結構和原理示。圖1A表示，構建好的YFP-MSS-CFP核苷酸序列克隆到pET-28a(購自默克公司)中，可表達六組氨基標簽的融合蛋白YFP-MSS-CFP。圖B表示構建好的YFP-MSS-CFP核苷酸序列克隆到pDisplay_質粒中，在pDisplay_質粒上有Igκ鏈的信號序列和血小板受體因子(PDGFR)的跨膜肽，YFP-MSS-CFP的核苷酸序列插在這兩段之間。這樣YFP-MSS-CFP蛋白表達后可以在信號序列的引導下展示并錨定在細胞的膜上。圖C表示YFP-MSS-CFPdisplay定位在細胞膜上。YFP-MSS-CFPdisplay表達展示并錨定在細胞的膜上后遇到成熟的MMP酶切作用。剪切后的FRET和YFP的熒光信號會降低。
本發(fā)明的實施方式，除非另有說明外，所利用的都是常規(guī)的分子生物學技術，如《分子克隆實驗指南》，第三版，美J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，科學出版社，2002。所述的熒光共振能量轉移的供體和受體熒光蛋白對及基質金屬蛋白酶家族成員特異性識別的肽接頭均是現(xiàn)有技術中已知的，可以用常規(guī)PCR技術從質粒中擴增所需要的供體和受體熒光蛋白對核苷酸序列，通過合成方法或PCR擴增制備基質金屬蛋白酶家族成員特異性識別的肽接頭核苷酸序列，最后用常規(guī)的連接反應進行連接即可。這些技術對本領域技術人員是已知的技術。下面僅以基因型分子探針YFP-LEGGIPVSLRSG-CFP為例，對本發(fā)明的技術方案進行詳細的說明。其它供體和受體熒光蛋白對及肽接頭構成的基因型分子探針的構建可以參考該實施例進行，本發(fā)明不再重復進行敘述。
實施例1構建檢測基質金屬蛋白酶活性的基因型分子探針從pECFP-C1、pEYFP-C1質粒(購自Clontech，USA)，利用下述引物對，通過常規(guī)PCR技術分別克隆CFP，YFP核苷酸序列，并且采用巢式PCR方法對CFPPCR引物從5’端引入氨基酸序列為LEGGIPVSLRSG的接頭肽核苷酸序列，EYFP的正向引物5’-GAAGATCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3’(下劃線為BglII酶切位點)EYFP的反向引物5’-CGCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA-3’(下劃線為XhoI酶切位點)ECFP的采用兩條正向引物分兩次擴增，正向引物15’CTCTTAGATCCGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC3’
正向引物25’-CCGCTCGAGGGTGGAATTCCCGTGTCTCTTAGATCCGGA-3’ECFP反向引物5’-CAACTGCAGCATGCGGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGG-3’(下劃線為PstI酶切位點)。
所述PCR擴增條件如下將以下試劑在0.5mL滅菌離心管中混合DNA模板2μL上游引物0.1μmol/L下游引物0.1μmol/LExTaq酶1μLdNTP50μmol/L10×PCR緩沖液10μl總體積為加水補到100μl94℃45s；55℃45s；72℃90s30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。
用低熔點瓊脂糖凝膠法回收YFP PCR擴增產物，經純化，連接到pGEM-T載體上；1.2μg pGEM-T Vector12μl YFP PCR回收DNA10u T4 DNA Ligase1μl 10×Ligation Buffer共10μl。
將10μL連接產物加入50μL感受態(tài)細胞中，冰上放置1h；42℃熱激90s；冰浴3min；加入400μL無抗性LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h；離心，10000r/min，1min；棄掉350μL上清液，將菌體重懸，均勻涂在帶有適當抗性的平板上，37℃靜置培養(yǎng)14-20h，至長出大小適當、均一性較好的菌落。用上述菌落作模板，進行PCR，對PCR產物進行瓊脂糖電泳，鑒定含有目的基因的受體菌。將YFP構建到pGEM-T上，此質粒為命名為pGEM-YFP。用BglII和XhoI雙切鑒定插入的方向，因為我們要利用pGEM-T載體上的PstI酶切位點，這樣可以將CFP插入到XhoI和PstI位點上。
將pGEM-YFP和CFP PCR回收片段分別用XhoI和PstI雙切，用T4DNA連接酶將CFP插入到XhoI和PstI位點，構建成質粒pGEM-YC。將pGEM-YC用BglII和SalI 37℃酶解，回收YFP-LEGGIPVSLRSG-CFP的cDNA片段。然后將YFP-LEGGIPVSLRSG-CFP片段插入到pDisplay的BglII和SalI位點構建成pDisplay-YC。
采用轉染試劑將pDisplay-YC質粒轉染MDA-MB 435s細胞(由武漢大學中國典藏培養(yǎng)物保藏中心提供)(高表達MMPs)。轉染后48h，用含800μg/ml G418的培養(yǎng)液篩選細胞兩周，獲得穩(wěn)定表達熒光的細胞株，接著采用96孔板有限稀釋法進行單克隆細胞的篩選，獲得表達熒光的單克隆細胞株，選取其中熒光表達量最高的單克隆細胞株作為實驗細胞株。
利用FRET成像技術在活細胞內實時監(jiān)測了MMPs的活性及MMPs抑制劑GM6001的作用。利用三通道熒光顯微成像連續(xù)監(jiān)測MMPs抑制劑GM6001和MMP2 Inhibitor I對高表達MMP的腫瘤細胞的作用。利用YFP熒光分析MMP抑制作用。參考圖3，YFP-LEGGIPVSLRSG-CFPdisplay穩(wěn)定表達的MDA-MB 435s細胞用10μM的MMP2 inhibitor I和40μM處理。用三通道方法檢測細胞的熒光，細胞的熒光每24小時記錄一次(24h，圖上排；48h，圖中排；72h，圖下排)，并記錄CFP，YFP，及FRET三通道的信號。與對照組(B2，C2)相比，MMP2 inhibitor I(E3，F(xiàn)3)和GM6001(H3，13)明顯增強了YFP的熒光。
將pGEM-YC用BglII和SalI 37℃酶解，將pET28a質粒用BamH I和Xho I酶切，用DNA回收試劑盒回收目的DNA片段。由于BamHI/BglII和SalI/XhoI為兩對同尾酶，用T4DNA連接酶可將YFP-LEGGIPVSLRSG-CFP的cDNA片段定向克隆到pET-28a的BamHI和XhoI位點。構建的質粒命名為pET-28a-YC，轉化DH5α受體菌，挑選陽性克隆。從陽性克隆中提出質粒，轉化BL21*(DE3)受體菌。由于pET28a-YC質粒上有乳糖操縱子，所以將pET28a-YC質粒轉化到工程菌BL21(DE3)中在乳糖類似物IPTG的誘導下可大量表達YFP-LEGGIPVSLRSG-CFP蛋白。用常規(guī)的蛋白質提純方法提純YFP-LEGGIPVSLRSG-CFP蛋白，將20nmol/L的MMP2與3.5μmol/L的YFP-LEGGIPVSLRSG-CFP熒光探針混合，反應混合物立即用熒光分光光度計掃描，每兩分鐘記錄一次。所使用的熒光的激發(fā)光源是433nm，對460-600nm的發(fā)射光光強信號，每2min記錄一次，見圖2A。1，10-phenathroline被體外用作于MMP2的抑制劑。FRET比值分析0μmol/L，250μmol/L，500μmol/L和1mmol/L不同1，10-phenathroline濃度對MMP2的抑制效果，見圖2B。由此可見，本發(fā)明構建的基因型分子探針所表達的YFP-LEGGIPVSLRSG-CFP蛋白質具有被基質金屬蛋白酶MMP-2識別酶解的活性。并且1，10-phenathroline可以抑制MMP的活性。因而，利用此探針標記基質金屬蛋白酶活性的方法有望實現(xiàn)抗腫瘤藥物MMPs抑制劑的藥物篩選。
序列表<110>華中科技大學<120>檢測基質金屬蛋白酶活性的多核苷酸序列<130>WH20061044<140>200610125589.3<141>2006年12月27日<160>6<210>1<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用做EYFP的正向引物<400>1gaagatctat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcac 37<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用做EYFP的反向引物<400>2cgctcgagct tgtacagctc gtccatgccg aga 33<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用做ECFP的正向引物1<400>3ctcttagatc cggaatggtg agcaagggcg aggagc 36<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用做ECFP的正向引物2<400>4ccgctcgagg gtggaattcc cgtgtctctt agatccgga 39<210>5<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用做ECFP的反向引物<400>5caactgcagc atgcgggcgg cggtcacgaa ctccagcagg 40<210>6<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>連接供體熒光蛋白和受體熒光蛋白；為基質金屬蛋白酶家族成員特異性識別的肽接頭。
<400>6Leu Glu Gly Gly Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly15 10
權利要求
1.一種多核苷酸序列，其包含一個編碼供體熒光蛋白的核苷酸序列；一個編碼受體熒光蛋白的核苷酸序列；以及一個編碼肽接頭的核苷酸序列；該肽接頭連接所述的供體熒光蛋白和所述的受體熒光蛋白；所述的肽接頭為基質金屬蛋白酶家族成員特異性識別的肽接頭。
2.如權利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于所述的肽接頭是由LEGGIPVSLRSG氨基酸序列所編碼的。
3.如權利要求1或2所述的多核苷酸序列，其特征在于所述的供體熒光蛋白和受體熒光蛋白是CFP/YFP供體和受體熒光蛋白對。
4.一種融合蛋白，其包含一個供體熒光蛋白；一個受體熒光蛋白；以及一個肽接頭；該肽接頭連接所述的供體熒光蛋白和所述的受體熒光蛋白；所述的肽接頭為基質金屬蛋白酶家族成員特異性識別的肽接頭。
5.如權利要求4所述的融合蛋白，其特征在于所述的肽接頭是由LEGGIPVSLRSG氨基酸序列所編碼的。
6.如權利要求4或5所述的融合蛋白，其特征在于所述的供體熒光蛋白和受體熒光蛋白是CFP/YFP供體和受體熒光蛋白對。
7.一種表達載體，其特征在于其包含權利要求1所述的多核苷酸序列。
8.如權利要求7所述的表達載體，該表達載體是pDisplay或pET28a。
9.權利要求1所述的多核苷酸序列用于檢測基質金屬蛋白酶活性的用途。
10.權利要求4所述的融合蛋白用于檢測基質金屬蛋白酶活性的用途。
11.權利要求7所述的表達載體用于檢測基質金屬蛋白酶活性的用途。
12.一種在體檢測基質金屬蛋白酶活性的方法，包括下列步驟1)將在細胞外表面上表達的，包含權利要求1所述多核苷酸序列的真核表達載體轉染到宿主細胞中；2)檢測宿主細胞中的熒光信號變化，確定細胞外的基質金屬蛋白酶活性。
13.如權利要求12所述的一種在體檢測基質金屬蛋白酶活性的方法，其中該真核表達載體是包含權利要求1所述多核苷酸序列的pDisplay。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測基質金屬蛋白酶活性的多核苷酸序列，其包含一個編碼供體熒光蛋白的核苷酸序列；一個編碼受體熒光蛋白的核苷酸序列；以及一個編碼肽接頭的核苷酸序列；該肽接頭連接所述的供體熒光蛋白和所述的受體熒光蛋白；所述的肽接頭為基質金屬蛋白酶家族成員特異性識別的肽接頭。該多核苷酸序列適用于在離體、活細胞層次上進行基質金屬蛋白酶活性的監(jiān)測及基質金屬蛋白酶抑制劑的篩選。
文檔編號C07K19/00GK101037710SQ200610125589
公開日2007年9月19日 申請日期2006年12月27日 優(yōu)先權日2006年12月27日
發(fā)明者駱清銘, 張智紅, 楊杰, 曾紹群 申請人:華中科技大學