本發(fā)明一種高效表達的對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因工程菌以及所基因工程菌的構(gòu)建方法和應用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

對羥基苯甲酸-3-羥化酶又稱對羥基苯甲酸-3-單加氧酶，在微生物體內(nèi)參與苯甲酸的好氧生物代謝過程。在苯甲酸的兒茶酚代謝過程中可將對羥基苯甲酸轉(zhuǎn)化為原兒茶酸。原兒茶酸別名：3,4-二羥基苯甲酸，為白色至褐色結(jié)晶性粉末，在空氣中變色。主要存在于鱗始蕨科植物烏蕨的葉，冬青科植物冬的葉等植物中。它是多種中藥如四季青、狗脊、小薊的主要活性成分，也是多種藥物的前體物質(zhì)。其藥理功效具有抗菌作用，體外試驗時對綠膿桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、產(chǎn)堿桿菌及枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑菌作用。亦有祛痰、平喘和解蛇毒的作用，臨床用于治療慢性氣管炎，同時，原兒茶酸能部分對抗腎上腺素和原兒茶醛所致的心肌耗氧量增加；原兒茶酸在輕度改善心功能的情況下,能顯著延長心肌耐缺氧的時間,同時并能減輕因缺氧而引起的血壓下降,使心率減慢。

目前國內(nèi)市場對原兒茶酸需求量逐年增長，其生產(chǎn)方法主要是化學化工法抽提。原兒茶酸的主要來源是從植物中提取，如烏蕨、冬青和紫丁香等。由于原兒茶酸需求量大，且植物資源相對單一,因此，化工法提取原兒茶酸對植物資源的依賴對環(huán)境資源造成一定的破壞，同時，運用化工法提取工藝復雜，步驟繁多，原兒茶酸在多步提取過程中都有不同程度的損耗，更為嚴重的是，在用化學法抽提過程中基于化工原料的使用會產(chǎn)生多重污染物。原兒茶酸的生物法制備主要通過細胞或是酶進行轉(zhuǎn)化的。原兒產(chǎn)酸的細胞轉(zhuǎn)化目前僅見于枯草芽孢桿菌，鄭春英等人在枯草芽孢的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)有原兒茶酸，并進行了定性研究，沒有提及該菌原兒茶酸的產(chǎn)量。原兒茶酸的轉(zhuǎn)化涉及的酶主要是對羥基苯甲酸-3-單加氧酶，目前有從假單胞菌和叢毛單胞菌中純化該酶的報道，但是并沒有利用該酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)原兒茶酸的報道。加之，轉(zhuǎn)化過程需要輔酶NADPH，因此利用酶法直接生產(chǎn)原兒茶酸不切合實際。

本發(fā)明從生物轉(zhuǎn)化角度解決原兒茶酸生產(chǎn)工藝中的各種問題，首次運用生物法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)原兒茶酸。底物對羥基苯甲酸可通過化學方法工業(yè)合成，成本低，易獲取。生物法生產(chǎn)原兒茶酸不但可以減少對植物資源的浪費，提高生產(chǎn)效率，同時降低了生產(chǎn)成本，而且對環(huán)境影響程度小。此外本發(fā)明運用工程菌對原兒茶酸的轉(zhuǎn)化無需進行酶的分離和純化，減少酶的活力損失，同時大大降低了成本，可進行多次反應，且不需添加輔助因子，對于活細胞來說，保持了酶的原始狀態(tài)，酶的穩(wěn)定性更高，對污染的抵抗力更強，細胞生長停滯時間短，反應快，對底物的轉(zhuǎn)化效率更高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，所要解決的技術(shù)問題是原兒茶酸的生物轉(zhuǎn)化問題。

首先，本申請涉及紅球菌R04（Rhodococcus sp.R04），保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，保藏日期為2016年1月19日，保藏編號為CGMCC 1.15467。該菌在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)白色-淺粉色-紅色，在培養(yǎng)的不同時間細胞有球桿變化。

經(jīng)過研究，發(fā)現(xiàn)所述紅球菌R04中含有對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因，能夠編碼對羥基苯甲酸-3-羥化酶，并可以將對羥基苯甲酸轉(zhuǎn)化為原兒茶酸。但是，在所述紅球菌R04中，同樣存在原兒茶酸的消化酶，基本“自產(chǎn)自銷”，無法用該菌直接生產(chǎn)原兒茶酸。因此，需要將該菌所含的對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因利用基因工程的方法進行高效表達。

本申請因而還涉及所述紅球菌R04中的對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因的核苷酸序列，該序列具體如如序列表SEQ ID NO.1所述。同時也涉及所述的對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因編碼的對羥基苯甲酸-3-羥化酶，所述酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所述。

在確定對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因的來源和基因序列后，還需要利用基因工程的方法構(gòu)建高效表達對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因的工程菌。經(jīng)過試驗篩選，最終選擇大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主菌，選擇質(zhì)粒pET21a（+）作為基因載體。

具體的，所述工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1）構(gòu)建重組質(zhì)粒pET21a（+）/pHBA-3H

根據(jù)對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因設(shè)計引物P1 、P2；

引物P1：5'-TAGAATTCAATGCAACCCGCACGGTC-3'

引物P2：5'-TAAAGCTTTCAGCGGTCGGGCCGG-3'

以紅球菌R04菌株的總DNA為模板，以P1、P2為引物，PCR擴增對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因；

PCR反應體系為50μl，反應條件為94℃變性5min后按照如下參數(shù)循環(huán)30次：94℃變性45s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min。最后再于72℃延伸10min。擴增得到對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因的PCR片段，切膠回收。

將pET21a（+）質(zhì)粒與回收片段分別進行HindⅢ和EcorRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶25℃連接1h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至含50mg/L氨芐青霉素的LB固體平板。經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，接入含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，于37℃、200rpm條件下培養(yǎng)10-12h后提取質(zhì)粒。得到pET21a（+）/pHBA-3H重組質(zhì)粒。

2）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及IPTG誘導表達重組大腸桿菌

將步驟1）獲得的重組質(zhì)粒pET21a（+）/pHBA-3H熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至含50mg/L氨芐青霉素的LB固體平板。經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子，接入含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)10-12h，得到包含重組質(zhì)粒pET21a（+）/pHBA-3H的宿主菌E.coli BL21(DE3)。

采用本發(fā)明所得的工程菌，以對羥基苯甲酸為底物，進行發(fā)酵，以獲得原兒茶酸的過程如下：

第一步：液體培養(yǎng)

將所述基因工程菌接入含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨10g/L，酵母膏510g/L，氯化鈉10g/L）, 37℃，200rpm培養(yǎng)8-10h，以2%接種量接種至含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基。

第二步：誘導表達

37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600約為0.6時，加入IPTG至終濃度0.1mM進行誘導，降溫至16℃培養(yǎng)12h后，發(fā)酵液8000rpm，4℃離心10min收集菌體，菌泥用20mM Tris-HCl（PH8.0）洗滌兩次，最后用上述緩沖液重懸菌體。

以對羥基苯甲酸（pHBA）為底物，采用高效液相色譜（HPLC）檢測產(chǎn)物原兒茶酸的含量。反應體系：OD600為3.0的菌液50mL，對羥基苯甲酸200μg/ mL, 反應一段時間后，將1 mL反應液12000rpm，離心5min，取上清液，在波長250nm處檢測原兒茶酸的生成率。

經(jīng)檢測對羥基苯甲酸在每OD菌液中每小時的轉(zhuǎn)化率可達40μmol。

除了上述應用之外，所述工程菌也可以用于提取純化獲得對羥基苯甲酸-3-羥化酶。

與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下有益效果。

（1）本發(fā)明將對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因在大腸桿菌中高效表達，運用生物酶催化法生產(chǎn)原兒茶酸。該方法可用于原兒茶酸的工業(yè)化生產(chǎn)，此方法也為其他重要發(fā)酵產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供一種新思路。

（2）表達產(chǎn)物以活性形式存在于細胞中，產(chǎn)物生成后隨即被泵出細胞，可直接從培養(yǎng)上清中提取產(chǎn)物；無需進行酶的分離和純化等步驟，菌液可重復多次反應，操作簡便且能有效減少酶活力損失。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明。

圖1為本發(fā)明的質(zhì)粒構(gòu)建圖。

圖2為以紅球菌R04基因組為模板PCR后的電泳圖，其中，第1泳道：maker 1kb，第2,3泳道：對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因。

圖3 對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因在大腸桿菌中誘導表達后的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，其中，第1泳道：maker，第2泳道：對照組，含有pET21a（+）空質(zhì)粒的大腸桿菌超聲破碎上清液，第3、4泳道：實驗組，含有重組質(zhì)粒pET21a（+）/pHBA-3H的大腸桿菌超聲破碎上清液。

圖4為對羥基苯甲酸和原兒茶酸標品的高效液相色譜圖。

圖5為對羥基苯甲酸經(jīng)對羥基苯甲酸-3-羥化酶轉(zhuǎn)化后，反應過程中的底物（對羥基苯甲酸）和產(chǎn)物（原兒茶酸）的高效液相分析圖譜。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因的克隆

將紅球菌R04接種于基礎(chǔ)礦物培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用酚-氯仿法提取基因組。

構(gòu)建表達載體所用的引物加設(shè)酶切位點，引物序列如下：

上游引物（含EcoRⅠ）：5'-TAGAATTCAATGCAACCCGCACGGTC-3'

下游引物（含HindⅢ）：5'-TAAAGCTTTCAGCGGTCGGGCCGG-3'

上述引物由上海生工生物工程有限公司合成。

基因PCR條件：PCR反應體系為50μl，94℃變性5min后按照如下參數(shù)循環(huán)30次：94℃變性45s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min。最后再于72℃延伸10min。擴增得到1285bp的PCR片段（對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因的PCR片段），凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物（圖2）并進行膠回收。

實施例2

pET21a（+）/pHBA-3H 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將pET21a（+）質(zhì)粒與回收片段分別進行HindⅢ和EcorRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶25℃連接1h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至含50mg/L氨芐青霉素的LB固體平板。經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，接入含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，于37℃，200rpm條件下培養(yǎng)10-12h后提取質(zhì)粒，得到pET21a（+）/pHBA-3H重組質(zhì)粒，并測序確認重組質(zhì)粒的閱讀框正確。

實施例3

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及IPTG誘導表達重組大腸桿菌。

將獲得的重組質(zhì)粒和pET21a（+）空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至含50mg/L氨芐青霉素的LB固體平板。經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)，挑取含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌及含有pET21a（+）空質(zhì)粒的對照大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，接入含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)8-10h。

以2%接種量接種至含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基。37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600約為0.6時，加入IPTG至終濃度0.1mM進行誘導，降溫至16℃培養(yǎng)12h后，發(fā)酵液8000rpm，4℃離心10min收集菌體，菌泥用20mM Tris-HCl（PH8.0）重懸。超聲破碎細胞（功率400W, 超聲6s，間歇6s，共2min），12000rpm離心10min，取上清，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白表達（圖3）。

實施例4

對羥基苯甲酸的轉(zhuǎn)化

以對羥基苯甲酸（pHBA）為底物，采用高效液相色譜（HPLC）檢測產(chǎn)物原兒茶酸的含量。Waters C18 [4.6×150mm，5 μm]色譜柱；流動相：9%乙腈和91%的水（用磷酸調(diào)PH至2.5）；柱溫：室溫；檢測波長250nm；流速：1 mL/min；進樣量：20μL。

反應體系：OD600為3.0的菌液50mL，對羥基苯甲酸200μg/ mL, 反應一段時間后，將1 mL反應液12000rpm，離心5min，取上清液，在波長250nm處檢測原兒茶酸的生成率。經(jīng)檢測對羥基苯甲酸在每OD菌液中每小時的轉(zhuǎn)化率可達40μmol。

本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來概述。因此，無論從哪一點來看，本發(fā)明的上述實施方案都只能認為是對本發(fā)明的說明而不能限制發(fā)明，權(quán)利要求書指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說明并未指出本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何變化，都應認為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。

<110> 山西大學

<120> 一種含有對羥基苯甲酸-3-羥化酶基因的紅球菌及含有該基因的工程菌構(gòu)建

方法和應用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1284

<212> DNA

<213> 紅球菌R04（Rhodococcus sp.R04）

<400> 1

ttgaacgaga agtcagcgta tgcggtggga gaggcgcacg acactcgacg ggacgcgaat 60

cggatacgcg cagcaaagga cgaacacatg aatgcaaccc gcacggtcgt caccaccgaa 120

gtcggcatcg tcggcggcgg cccggcaggt ctcatgctct cccacctcct cgcgaaggcg 180

gggatcgaca acatcgtcgt cgaaaaacgt gatcacgaga ccatccggac cacccaccgt 240

gcggggatcc tcgagcacgg ctcggtgtcg ctgctcaccg agagcggagt cgacacccgt 300

gtcctgaacg aagggcaccg ccacgacggc atcgatctgc gcttcggagg tgagagccac 360

cgcatcgatt tccgggacct cgtgggtgag tcggtgtggt tgtatccgca gaacgaggtc 420

ttcgtcgacc tggccgcctc gcgcgaacgc gacggtggcg atgtgcgcta cagcgtctgc 480

gacacagagg ttctcgacat caccaccgac acaccgaaga tccggttcac cgaatccgac 540

ggcacgccgg tcgagatccg gtgccgcatc ctagtcggag ccgacggatc acagagcatc 600

tgccgcaagg cgattcccgg cgacgtccgc accgaccact tcatcgagta ccccttcgca 660

tggttcggga tcctcaccga agctccaccg agtgcacccg aattgatcta tgcgcgttct 720

gatcacggat tcgccctcat cagtcaacgc aacgagtcgg tgcagcggat gtacttccag 780

tgcgatccgt ccgaggacgc gtcgacgtgg agcgaggacc ggatctggga cgagcttcag 840

aggcgtgtcg acggccccga cggtttcgaa ctgaagcgcg gccccatctt cgagcagatg 900

gtcctgccgt tccgctcgta cgtgtgcgaa ccgatgcggc acggaaacct cttcctggca 960

ggcgatgccg gccataccgt tccgccgacc ggtgccaagg ggctcaacct cgccctggcc 1020

gacgtccggg tgctcttccg cgcgctcgac tcgttcttct ccaccggctc gtccgacctg 1080

ctcgacgcct acagcgacac ggcgctgcag cgcgtgtgga aggcgcagaa cttctcgtac 1140

tggatgacct cgatgcttca cacccgtgag gacgcaacgc cattcgagaa caaacgggca 1200

ctgggcgaac tcgccgcggt cgtcggctcc cggtacggac agcagtatct tgcggaggcg 1260

tacacgggcc ggcccgaccg ctga 1284

<210> 2

<211> 427

<212> PRT

<213> 紅球菌R04（Rhodococcus sp.R04）

<400> 1

Leu Asn Glu Lys Ser Ala Tyr Ala Val Gly Glu Ala His Asp Thr

1 5 10 15

Arg Arg Asp Ala Asn Arg Ile Arg Ala Ala Lys Asp Glu His Met

20 25 30

Asn Ala Thr Arg Thr Val Val Thr Thr Glu Val Gly Ile Val Gly

35 40 45

Gly Gly Pro Ala Gly Leu Met Leu Ser His Leu Leu Ala Lys Ala

50 55 60

Gly Ile Asp Asn Ile Val Val Glu Lys Arg Asp His Glu Thr Ile

65 70 75

Arg Thr Thr His Arg Ala Gly Ile Leu Glu His Gly Ser Val Ser

80 85 90

Leu Leu Thr Glu Ser Gly Val Asp Thr Arg Val Leu Asn Glu Gly

95 100 105

His Arg His Asp Gly Ile Asp Leu Arg Phe Gly Gly Glu Ser His

110 115 120

Arg Ile Asp Phe Arg Asp Leu Val Gly Glu Ser Val Trp Leu Tyr

125 130 135

Pro Gln Asn Glu Val Phe Val Asp Leu Ala Ala Ser Arg Glu Arg

140 145 150

Asp Gly Gly Asp Val Arg Tyr Ser Val Cys Asp Thr Glu Val Leu

155 160 165

Asp Ile Thr Thr Asp Thr Pro Lys Ile Arg Phe Thr Glu Ser Asp

170 175 180

Gly Thr Pro Val Glu Ile Arg Cys Arg Ile Leu Val Gly Ala Asp

185 190 195

Gly Ser Gln Ser Ile Cys Arg Lys Ala Ile Pro Gly Asp Val Arg

200 205 210

Thr Asp His Phe Ile Glu Tyr Pro Phe Ala Trp Phe Gly Ile Leu

215 220 225

Thr Glu Ala Pro Pro Ser Ala Pro Glu Leu Ile Tyr Ala Arg Ser

230 235 240

Asp His Gly Phe Ala Leu Ile Ser Gln Arg Asn Glu Ser Val Gln

245 250 255

Arg Met Tyr Phe Gln Cys Asp Pro Ser Glu Asp Ala Ser Thr Trp

260 265 270

Ser Glu Asp Arg Ile Trp Asp Glu Leu Gln Arg Arg Val Asp Gly

275 280 285

Pro Asp Gly Phe Glu Leu Lys Arg Gly Pro Ile Phe Glu Gln Met

290 295 300

Val Leu Pro Phe Arg Ser Tyr Val Cys Glu Pro Met Arg His Gly

305 310 315

Asn Leu Phe Leu Ala Gly Asp Ala Gly His Thr Val Pro Pro Thr

320 325 330

Gly Ala Lys Gly Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Val Arg Val Leu

335 340 345

Phe Arg Ala Leu Asp Ser Phe Phe Ser Thr Gly Ser Ser Asp Leu

350 355 360

Leu Asp Ala Tyr Ser Asp Thr Ala Leu Gln Arg Val Trp Lys Ala

365 370 375

Gln Asn Phe Ser Tyr Trp Met Thr Ser Met Leu His Thr Arg Glu

380 385 390

Asp Ala Thr Pro Phe Glu Asn Lys Arg Ala Leu Gly Glu Leu Ala

395 400 405

Ala Val Val Gly Ser Arg Tyr Gly Gln Gln Tyr Leu Ala Glu Ala

410 415 420

Tyr Thr Gly Arg Pro Asp Arg***

425