本發(fā)明涉及植物基因工程技術領域，提供了一個水稻抗白葉枯病和細菌性條斑病基因OsHsp18.0-CI及其應用，該基因表達量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對細菌性條斑病和白葉枯病菌的抗性明顯增強。

背景技術：

植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細菌、真菌和線蟲等。病原物侵入植物導致兩種結(jié)果：(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應，殺死病原物或阻止其生長。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預防病害同時又保護環(huán)境的根本出路。

植物的抗病反應是多基因參與調(diào)控的復雜過程。參與植物抗病反應的基因分為兩類：(1)抗病基因，又稱R(resistance)基因和(2)抗病相關基因。

根據(jù)目前人們對抗病基因功能的認識，這類基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或間接與病原蛋白相互作用，啟動植物體內(nèi)的抗病信號傳導路徑(Jones和Dangl，2006，Nature444：323-329；Zipfel，2014，Trends in immunology，35：345-351)?？共』蚪閷У目共》磻獜姡呛芎玫幕蛸Y源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：(1)抗病基因的資源有限；(2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病范圍有限；(3)因為病原的快速突變，一個抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。

抗病相關基因是指除抗病基因外所有參與抗病反應的基因，它們的編碼產(chǎn)物參與合成植物體內(nèi)抗病信號分子、參與信號傳導或參與防衛(wèi)反應等。這類基因的共同特點是病原誘導后它們的表達量升高或減少，因此人們可以根據(jù)病原誘導前后基因的表達量的差異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關基因(Maleck等，2000，Nature Genet.26：403-410；Schenk等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:11655-11660；Zhou等，2002，Science in China 45:449-467)。目前，人們對抗病相關基因的認識有限。根據(jù)已有報道，絕大多數(shù)抗病相關基因單獨作用時的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開發(fā)的基因資源：(1)由于絕大多數(shù)抗病相關基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類基因是具有持久抗性的基因資源；(2)大多數(shù)抗病相關基因參與的抗病反應沒有病原特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；(3)這類基因的資源豐富。但是，水稻中雖然鑒定了很多抗病相關基因(Zhou等，2002，Science in China Series C-Life Sciences 45:449-467；Chu等，2004，Molecular Genetics and Genomics 271:111-120)，這些基因在水稻抗病反應中的作用機理、以及單個抗病相關基因是否會引起水稻抗病表型的改變都不清楚。

水稻是世界上重要的糧食作物，白葉枯病和細菌性條斑病是水稻生產(chǎn)中兩種重要的細菌性病害，嚴重影響著水稻生產(chǎn)的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，了解病害的發(fā)病機制，有助于利用高效途徑改良水稻品種的抗性，控制病害的發(fā)生，減少或避免植物病害所帶來的損失。分離克隆抗病相關基因是對水稻抗病機理研究的前提。目前已報道克隆了至少37個水稻白葉枯病的主效抗病基因，但這些抗病基因除Xa21外，大多只對少數(shù)的生理小種具有抗性，抗譜較窄。目前尚未在水稻中克隆到細菌性條斑病的主效抗病基因，僅在玉米種克隆到一個非寄主抗病基因Rxo1(Zhao等，2005，Proc.Nati.Acad.Sci USA 102：15383-15388)。已有的試驗結(jié)果顯示，抗病相關基因能夠參與到植物免疫系統(tǒng)的信號路徑中，通過激活或增強免疫信號來提高植物對病害的抗性，例如水稻中抗水稻細菌性條斑病菌基因DEPG1，OsWRKY45-1，OsPGIP4(Guo等,2012，Mol.Biol.rep.39：3491-3504；Tao等,2009，Plant Physiol.151：936-948；Feng等,2016，Planta 243：1297-1308)等。另外，與抗病基因的應用相比，抗病相關基因的應用能提供植物更為廣譜及長效的抗性，甚至對多種病害提供抗性例如超量表達Os2H16提高水稻對白葉枯病和紋枯病的抗性(Li等，2013，Plant Cel l Tiss.Org.115：429-441)。通過超量作為抗病反應正調(diào)控因子的抗病相關基因的功能進行水稻品種的改良，將進一步增強植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術所不能達到的。因此如何利用水稻抗病基因的克隆獲得抗病植株成為亟待解決的問題之一。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術的情況，提供了一個從水稻中分離克隆出的抗病相關基因OsHsp18.0-CI完整編碼區(qū)段的DNA片段，利用這個基因改良水稻或其它植物抵御病害的能力。其基因的序列如序列表SEQ ID NO.1所示，或者基本上相當于SEQ ID NO.1所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO.1所示序列的亞片段。該基因片段表達量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對細菌性條斑病和白葉枯病菌的抗性明顯增強，可見采用超量表達之后可以賦予植物對由細菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)和白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害產(chǎn)生抗病反應，獲得高抗病植株。

發(fā)明人首先提供了一個從水稻中分離克隆出的抗病相關基因OsHsp18.0-CI完整編碼區(qū)段的DNA片段，該片段來源于水稻(Oryza sativa)圣稻806，其通過特殊設計的引物擴增水稻圣稻806基因組DNA獲得，其中所述的引物包括引物1，5′-TGAGAATTGAGATCACCCTCTT-3′其序列如序列表SEQ ID NO.3所示，引物2，5′-GGACCAGATTTGACGCTTTTAT-3′其序列如序列表SEQ ID NO.4所示，最終獲得的基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

之后利用強啟動子驅(qū)動和基于RNA干擾(RNA interference，RNAi)原理的轉(zhuǎn)基因技術，將OsHsp18.0-CI基因的超量表達載體和RNAi載體轉(zhuǎn)入水稻品種圣稻806，超量及抑制水稻中OsHsp18.0-CI基因的表達。OsHsp18.0-CI基因表達量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對細菌性條斑病菌和白葉枯病菌的抗性明顯增強，表達量顯著降低的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對細菌性條斑病菌和白葉枯病菌的抗性明顯減弱，證明OsHsp18.0-CI基因在水稻抗白葉枯病中發(fā)揮重要作用。因此證實了超量表達該基因后可以賦予植物對由細菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)和白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害產(chǎn)生抗病反應，獲得高抗病植株。采用這種轉(zhuǎn)基因技術創(chuàng)造抗病植物是傳統(tǒng)育種技術所不能達到的，之所以采用上述的方法，主要是由于將克隆的抗病相關基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用遺傳轉(zhuǎn)化技術在植物中累加多個抗性基因，而不會產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術中伴隨出現(xiàn)的連鎖基因組序列。而抗病相關基因的克隆是克服傳統(tǒng)育種不能植物種間轉(zhuǎn)移抗病相關基因問題的前提。

除了利用本發(fā)明所提供的基因之外，還可以采用其基因的核苷酸序列基本上相當于SEQ ID NO.1所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO.1所示序列的亞片段，也就是說只要具備SEQ ID NO.1所示的DNA序列的基因片段均可以取得類似的效果。

綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人在國際上首次提供了一個從水稻中分離克隆出的抗病相關基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，OsHsp18.0-CI，并驗證了該基因的功能，利用其功能最終發(fā)現(xiàn)采用超量表達之后可以賦予植物對由細菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)和白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害產(chǎn)生抗病反應，獲得高抗病植株。

附圖說明

圖1.用定量RT-PCR技術檢測圣稻806分別接種細菌性條斑病菌RS105和白葉枯病菌PXO99后OsHsp18.0-CI基因的表達模式結(jié)果示意圖；

圖中黑色柱形圖表示接種RS105后基因的表達，灰色的柱形圖表示的是接種PXO99后基因的表達，可以看到在接種0h、6h、12h、24h和72h后取樣的檢測結(jié)果。以0h為對照，可見在接種RS105 12h和24h后，OsHsp18.0-CI基因表達與對照相比有明顯的提高；接種PXO99后6h、12h和24h OsHsp18.0-CI基因都有顯著的上調(diào)表達；

圖2.OsHsp18.0-CI基因超量表達和抑制表達T₀代遺傳轉(zhuǎn)化植株接種細菌性條斑病菌RS105兩周后結(jié)果示意灰度圖；

圖中，“WT”為野生型圣稻806；抑制表達T₀代遺傳轉(zhuǎn)化植株(OsHsp18.0-CI RNAi)接種細菌性條斑病菌RS105兩周后形成的病斑明顯比圣稻806(對照)的長；該基因超量表達的T₀代轉(zhuǎn)化植株(OsHsp18.0-CI OE)接種細菌性條斑病菌RS105兩周后形成的病斑明顯比圣稻806(對照)的短；

圖3.OsHsp18.0-CI基因超量表達植株OE-7T₁代材料接種細菌性條斑病菌RS105兩周后發(fā)病結(jié)果示意圖；

圖中縱坐標表示每個單株接種RS105兩周后的發(fā)病長度，“WT”為遺傳轉(zhuǎn)化受體野生型圣稻806，“﹡﹡”表示與對照圣稻806的發(fā)病長度相比，轉(zhuǎn)化材料發(fā)病長度極顯著降低(t檢驗，P<0.01),“﹡”表示與對照圣稻806的發(fā)病長度相比，轉(zhuǎn)化材料發(fā)病長度顯著降低(t檢驗，P<0.05)，圖中瓊脂糖凝膠電泳照片中條帶是每個單株中抗潮霉素基因Hpt的PCR擴增示意圖，能擴增出Hpt基因的即為陽性轉(zhuǎn)化材料；

圖4.OsHsp18.0-CI基因超量表達植株OE-11T₁代材料接種細菌性條斑病菌RS105兩周后發(fā)病結(jié)果示意圖；

圖中縱坐標表示每個單株接種RS105兩周后的發(fā)病長度，“WT”為遺傳轉(zhuǎn)化受體野生型圣稻806，“﹡﹡”表示與對照圣稻806的發(fā)病長度相比，轉(zhuǎn)化材料發(fā)病長度極顯著降低(t檢驗，P<0.01),“﹡”表示與對照圣稻806的發(fā)病長度相比，轉(zhuǎn)化材料發(fā)病長度顯著降低(t檢驗，P<0.05)，圖中瓊脂糖凝膠電泳照片中條帶是每個單株中抗潮霉素基因Hpt的PCR擴增示意圖，能擴增出Hpt基因的即為陽性轉(zhuǎn)化材料；

圖5.OsHsp18.0-CI基因抑制表達植株RNAi-9T₁代材料接種細菌性條斑病菌RS105兩周后發(fā)病結(jié)果示意圖；

圖中縱坐標表示每個單株接種RS105兩周后的發(fā)病長度，“WT”為遺傳轉(zhuǎn)化受體野生型圣稻806，“﹡﹡”表示與對照圣稻806的發(fā)病長度相比，轉(zhuǎn)化材料發(fā)病長度極顯著增加(t檢驗，P<0.01),“﹡”表示與對照圣稻806的發(fā)病長度相比，轉(zhuǎn)化材料發(fā)病長度顯著增加(t檢驗，P<0.05)，圖中瓊脂糖凝膠電泳照片中條帶是每個單株中抗潮霉素基因Hpt的PCR擴增示意圖，能擴增出Hpt基因的即為陽性轉(zhuǎn)化材料；

圖6.OsHsp18.0-CI基因抑制表達植株RNAi-12T₁代材料接種細菌性條斑病菌RS105兩周后發(fā)病結(jié)果示意圖；

圖中縱坐標表示每個單株接種RS105兩周后的發(fā)病長度，“WT”為遺傳轉(zhuǎn)化受體野生型圣稻806，“﹡﹡”表示與對照圣稻806的發(fā)病長度相比，轉(zhuǎn)化材料發(fā)病長度極顯著增加(t檢驗，P<0.01),“﹡”表示與對照圣稻806的發(fā)病長度相比，轉(zhuǎn)化材料發(fā)病長度顯著增加(t檢驗，P<0.05)，圖中瓊脂糖凝膠電泳照片中條帶是每個單株中抗潮霉素基因Hpt的PCR擴增示意圖，能擴增出Hpt基因的即為陽性轉(zhuǎn)化材料；

圖7.OsHsp18.0-CI基因抑制和超量表達的轉(zhuǎn)化植株T₂代接種細菌性條斑病菌RS105兩周后發(fā)病結(jié)果示意圖，

圖中WT為野生型圣稻806，OE-7為OsHsp18.0-CI基因超量表達植株OE-7T₁代材料，OE-11為OsHsp18.0-CI基因超量表達植株OE-11T₁代材料，RNAi-9為OsHsp18.0-CI基因抑制表達植株RNAi-9T₁代材料，RNAi-12為OsHsp18.0-CI基因抑制表達植株RNAi-12T₁代材料；

圖8.OsHsp18.0-CI基因抑制和超量表達的轉(zhuǎn)化植株T₂代接種水稻白葉枯病菌PXO99兩周后發(fā)病結(jié)果示意灰度圖；

圖9.OsHsp18.0-CI基因抑制和超量表達的轉(zhuǎn)化植株T₂代接種水稻白葉枯病菌PXO99兩周后發(fā)病結(jié)果示意圖，

圖中WT為野生型圣稻806，OE-7為OsHsp18.0-CI基因超量表達植株OE-7T₂代材料，OE-11為OsHsp18.0-CI基因超量表達植株OE-11T₂代材料，RNAi-9為OsHsp18.0-CI基因抑制表達植株RNAi-9T₂代材料，RNAi-12為OsHsp18.0-CI基因抑制表達植株RNAi-12T₂代材料。

具體實施方式

以下實施例中進一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領域現(xiàn)有技術；實施例1：OsHsp18.0-CI基因的分離克隆和結(jié)構分析

1.從水稻品種中分離克隆OsHsp18.0-CI基因

采用TIANGEN公司的植物基因組DNA提取試劑盒按照說明書抽提水稻品種圣稻806的基因組DNA,以該DNA為模板，通過PCR技術，利用引物1(5′-TGAGAATTGAGATCACCCTCTT-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.3所示)和引物2(5′-GGACCAGATTTGACGCTTTTAT-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.4所示)擴增獲得OsHsp18.0-CI基因的DNA片段。

其PCR反應程序為預變性98℃2min，變性98℃10s，退火55℃25s，延伸72℃30s，反應30個循環(huán)，后延伸72℃5min。所獲得的基因命名為OsHsp18.0-CI，其核苷酸序列如SEQ NO.1所示，其中第75-557位為編碼堿基，編碼一種小分子量的熱激蛋白，由161個氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

實施例2：OsHsp18.0-CI基因在水稻品種中的表達模式分析

為了證實OsHsp18.0-CI基因參與抗病反應的調(diào)控，我們采用定量RT-PCR技術分析了水稻材料圣稻806在接種細菌性條斑病菌RS105和白葉枯病菌PXO99后OsHsp18.0-CI基因的表達模式。分別在接種后0h、6h、12h、24h和72h取接種葉片，抽提總RNA。利用iQ^TM5定量PCR儀(Bio-Rad公司)、SYBR Green熒光嵌入染料做定量RT-PCR分析接種后不同時間點OsHsp18.0-CI基因的表達差異。定量RT-PCR技術中的OsHsp18.0-CI基因特異PCR引物是引物3，5′-GGTGGAGAGCTTCGATTCGA-3′其序列如序列表SEQ ID NO.5所示和引物4，5′-GGACCAGATTTGACGCTTTTATTT-3′其序列如序列表SEQ ID NO.6所示。以水稻肌動蛋白的RT-PCR產(chǎn)物作為樣品量一致性對照，肌動蛋白PCR引物序列是OsActin 1F(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′其序列如序列表SEQ ID NO.7所示)和OsActin 1R(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.8所示)。

分析結(jié)果顯示水稻材料圣稻806接種細菌性條斑病菌后，12h和24hOsHsp18.0-CI基因的表達量12.2和15.7倍(圖1)，說明OsHsp18.0-CI基因能被細菌性條斑病菌顯著誘導表達；接種白葉枯病菌6h后，OsHsp18.0-CI基因上調(diào)了3倍，12h和24h分別上調(diào)了3.3和5.1倍，說明OsHsp18.0-CI也能被白葉枯病菌誘導表達。

實施例3：OsHsp18.0-CI基因的植物表達載體構建

本發(fā)明所用載體是pU1301。以圣稻806DNA為模板，用引物5(5′-ATGGGTACCTGAGAATTGAGATCACCCTCTT-3′，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶KpnI識別位點，其序列如序列表SEQ ID NO.9所示)和引物6(5′-CGGGATCCGGACCAGATTTGACGCTTT-3′，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識別位點，其序列如序列表SEQ ID NO.10所示)擴增基因片段，PCR反應程序如下：預變性98℃2min，變性98℃10s，退火56℃25s，延伸72℃30s，反應30個循環(huán)，后延伸72℃5min，獲得SEQ ID NO.1的片段。

PCR產(chǎn)物用KpnI和BamHI進行酶切，同時用KpnI和BamHI酶切攜帶玉米泛素啟動子的遺傳轉(zhuǎn)化載體pU1301，酶切完畢，純化酶切產(chǎn)物。用OsHsp18.0-CI基因的酶切片段和載體做連接反應,通過酶切篩選陽性克隆；命名為pU1301::OsHsp18.0-CI，用于超量表達使用。

同時，本發(fā)明采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術，通過抑制水稻品種圣稻806中OsHsp18.0-CI基因的表達，驗證該基因的功能。本發(fā)明用引物7(5′-AAGACTAGTGGTACCGCATCTTCCCGTCCTTCC-3′，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SpeI和KpnI識別位點，其序列如序列表SEQ ID NO.11所示)和引物8(5′-AAGGAGCTCGGATCCGGACCAGATTTGACGCTTT-3′，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI識別位點，其序列如序列表SEQ ID NO.12所示)，OsHsp18.0-CI基因DNA片段為模板，PCR擴增待轉(zhuǎn)化的DNA片段，PCR反應程序如下：預變性98℃2min，變性98℃10s，退火56℃25s，延伸72℃30s，反應30個循環(huán)，后延伸72℃5min。

構建OsHsp18.0-CI基因片段的第一重復鏈(正向鏈)：用KpnI和BamHI消化部分PCR產(chǎn)物及載體ds1301(如圖4所示)，消化完全后在75℃水浴10min滅活限制性內(nèi)切酶，置于冰上，用T4DNA連接酶進行連接反應。熱激后獲得的克隆質(zhì)粒用引物7和8擴增篩選陽性克隆。

構建OsHsp18.0-CI基因片段的第二重復鏈(反向鏈)：用SpeI和SacI消化剩余的PCR產(chǎn)物和上述篩選出的連接了第一重復鏈的陽性克隆質(zhì)粒，消化完全后再75℃水浴10min滅活限制性內(nèi)切酶，置于冰上，用T4DNA連接酶進行連接反應。熱激后獲得的克隆質(zhì)粒用SacI和SpeI雙酶切消化反應篩選陽性克隆，命名為ds1301：：OsHsp18.0-CI，作為抑制表達載體。

將構建好的超量和抑制表達載體pU1301：：OsHsp18.0-CI和ds1301：：OsHsp18.0-CI電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞EHA105，保存菌株用作農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化。

實施例4：OsHsp18.0-CI基因的功能驗證

采用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Lin和Zhang，2005，Plant Cel l Rep.23：540-547)將超量和抑制表達載體導入水稻品種圣稻806。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株分別被命名為OE和RNAi。

本發(fā)明分別獲得超量和抑制表達OsHsp18.0-CI基因的獨立轉(zhuǎn)化植株19和25株，分別命名OE-1至19和RNAi-1至25。

超量表達的轉(zhuǎn)化植株分別用玉米泛素啟動子特異引物UbiF(5′-TTTTAGCCCTGCCTTCATACGC-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.13所示)和OsHsp18.0-CI基因的特異引物2(5′-CGGGATCCGGACCAGATTTGACGCTTT-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.9所示)以及載體的篩選標記Hpt基因側(cè)翼序列設計引物HptF(5′-GATCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.14所示)/HptR(5′-GTACTTCTACACAGCCATCGGTCCA-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.15所示)分別對獲得轉(zhuǎn)化植株進行陽性鑒定，以兩對引物鑒定均為陽性的材料作為陽性植株。用ds1301載體上二鏈克隆位點的側(cè)翼序列設計引物S2F2(5′-TTCTAATCCCCAATCCAAA-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.16所示)/S2R2(5′-TAGGCGTCTCGCATATCTC-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.17所示)以及載體的篩選標記Hpt基因引物分別對獲得的抑制表達OsHsp18.0-CI的轉(zhuǎn)化材料進行陽性鑒定，以兩對引物鑒定均為陽性的材料作為陽性植株，進行陽性鑒定的PCR反應程序如下：預變性94℃3min，變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，反應30個循環(huán)，后延伸72℃5min。

采用活體穿刺法在幼苗期接種細菌性條斑病菌RS105，發(fā)現(xiàn)超量植株抗性有不同程度的增強，抑制植株抗性有不同程度的減弱；與轉(zhuǎn)基因的受體水稻圣稻806相比，抗性增強的轉(zhuǎn)化植株的病斑長度縮短了0.3cm-0.8cm，抗性減弱的轉(zhuǎn)化植株的病斑長度變長了0.2cm-1.0cm(表1)(如圖2所示)。

表1.部分T₀代轉(zhuǎn)化植株對細菌性條斑病菌RS105的反應

為進一步驗證轉(zhuǎn)化植株的抗病能力是否與OsHsp18.0-CI基因的表達量相關，本發(fā)明分別對表1中所列的超量和抑制轉(zhuǎn)化植株，抽提總RNA，利用iQ^TM5定量PCR儀(Bio-Rad公司)、SYBR Green熒光嵌入染料做定量RT-PCR分析，比較轉(zhuǎn)化植株和對照材料中OsHsp18.0-CI基因表達量。其中超量植株的PCR反應引物是引物3(5′-GGTGGAGAGCTTCGATTCGA-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.5所示)和引物4(5′-GGACCAGATTTGACGCTTTTATTT-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.6所示)；抑制植株的PCR引物是引物9(5′-CAACCAAAAAACAGCAAGACACA-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.18所示)和引物10(5′-CCCAGAGGTCGAGGGAGAAG-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.19所示)，分別以水稻肌動蛋白的RT-PCR產(chǎn)物作為樣品量一致性對照。

實驗結(jié)果顯示OsHsp18.0-CI基因的表達量與植株的抗性密切相關(表1)?？共⌒栽鰪姷霓D(zhuǎn)化植株中OsHsp18.0-CI基因的表達量與對照材料圣稻806相比顯著增加，抗病性減弱的轉(zhuǎn)化植株中OsHsp18.0-CI基因的表達量與對照材料圣稻806相比顯著減少。該結(jié)果說明了OsHsp18.0-CI基因的編碼產(chǎn)物在水稻抗白葉枯病反應發(fā)揮正調(diào)控因子的作用。可見采用超量表達之后可以賦予植物對由細菌性條斑病菌所引起的病害產(chǎn)生抗病反應，獲得高抗病植株。

為進一步證實OsHsp18.0-CI基因在水稻對細菌性條斑病菌抗性中的作用，本發(fā)明從T₀代的超量和抑制轉(zhuǎn)化植株中各選取了2個株系進行T₁代和T₂代的重復接種驗證。結(jié)果顯示，2個T₁代株系中，OsHsp18.0-CI基因超量表達的轉(zhuǎn)化植株(含載體pU1301：：OsHsp18.0-CI)抗性顯著高于對照圣稻806(P<0.05),而不含pU1301：：OsHsp18.0-CI載體的植株對R105的抗性與對照圣稻806無顯著差異(圖3和圖4)。同樣，OsHsp18.0-CI基因抑制表達的2個T₁代轉(zhuǎn)化植株(含載體ds1301::OsHsp18.0-CI)對RS105的抗性顯著減弱(P<0.05)，而不含ds1301：OsHsp18.0-CI載體的植株對R105的抗性與對照圣稻806無顯著差異(圖5和圖6)。T2代植株的接種試驗也顯示了同樣結(jié)果，如圖7所示。這進一步說明了基因OsHsp18.0-CI在水稻對細菌性條斑病抗性中的作用?？梢姴捎贸勘磉_OsHsp18.0-CI之后可以賦予植物對由細菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)所引起的病害產(chǎn)生抗病反應，從而可以改良水稻對細菌性條斑病菌的抗性。

另外，對OsHsp18.0-CI基因超量和抑制表達的T₂代轉(zhuǎn)化植株進行了水稻白葉枯病抗性的鑒定。對獲得T₂代轉(zhuǎn)化植株在孕穗期接種白葉枯病菌PXO99，每個單株接種5片完全伸展的葉片，接種后14天進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，以圣稻806作為對照材料，進行t檢驗分析。結(jié)果顯示，與對照圣稻806發(fā)病長度8.70±0.4cm相比，OsHsp18.0-CI超量表達的植株接種PXO99后的發(fā)病長度為7.2-8.2cm，均達到了顯著差異水平(P<0.05),表明超量表達OsHsp18.0-CI基因能夠增加水稻對白葉枯病的抗性(圖8和圖9)；而抑制OsHsp18.0-CI表達的轉(zhuǎn)化植株接種PXO99后發(fā)病長度為8.9-11.2cm，比野生型圣稻806發(fā)病長度顯著增加(P<0.05)。上述結(jié)果說明超量表達OsHsp18.0-CI之后也可以賦予植物對由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害產(chǎn)生抗病反應，從而可以改良水稻對白葉枯病的抗性。