本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大豆磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75、編碼蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在植物所必須的營養(yǎng)元素中，磷是非常重要的一個，它參與了植物的生物合成、信號傳導(dǎo)和能量轉(zhuǎn)移等重要生理生化過程。大豆的根系只可以吸收土壤中以無機(jī)磷離子形式存在的磷，然而由于風(fēng)化、侵蝕和金屬離子的氧化固定，土壤中可以被大豆所利用的有效磷含量都比較低。植物的生長發(fā)育，其實就是內(nèi)源信號和環(huán)境因素間不斷相互影響、相互利用的一個動態(tài)平衡過程；這依賴的是植物對外界環(huán)境的感知以及信號通路的及時響應(yīng)，并適當(dāng)?shù)刈龀鲆幌盗猩砩磻?yīng)，從而對自身和外界造成影響。植物一般可以通過兩種方式來達(dá)到這個目的，一是依靠外部Pi濃度和自身信號通路的相互影響；另一種是依靠植物體內(nèi)自身的Pi代謝通路的調(diào)控。植物體內(nèi)自身的Pi代謝平衡的改變會導(dǎo)致磷元素全身供給模式發(fā)生改變，進(jìn)而影響根系表型結(jié)構(gòu)的發(fā)育，而且激活Pi攝入的整個過程依靠的是全身性的系統(tǒng)調(diào)節(jié)來完成的。根據(jù)對分根實驗的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，與Pi吸收相關(guān)的基因和脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因通常是全身性響應(yīng)調(diào)節(jié)的，而與應(yīng)激或激素相關(guān)的基因是局部響應(yīng)調(diào)節(jié)的。所以，植物對磷饑餓的響應(yīng)是一個局部與全身系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)的過程。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子最顯著的特征之一是含有一個或兩個約60個氨基酸的WRKYGQK結(jié)構(gòu)域，這個保守序列并非一成不變，少數(shù)也會有WRRY、WSKY、WKRY、WVKY或WKKY等變異。在其C端有一個非典型的鋅指結(jié)構(gòu)C₂H₂或C₂HC。WRKY轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)它的結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)類型被分為3組，含有兩個結(jié)構(gòu)域的被分在Group I，另外的在其他組，C₂HC類型的鋅指結(jié)構(gòu)被分在Group III，Group II根據(jù)主要氨基酸序列又分為：Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe 5類。

WRKY能夠特異識別W-box(T)(T)TGAC(C/T)順式作用元件并與之結(jié)合啟動下游基因表達(dá)來調(diào)控相關(guān)生理過程，W-box存在于多種參與生理過程基因的啟動子中，并且不只一個，該W-box核心序列TGAC只要有一個氨基酸發(fā)生改變，WRKY與W-box結(jié)合活性就會迅速下降甚至完全消失，對于含有多個W-box的，其中會有一個W-box在結(jié)合上起到關(guān)鍵作用。說明W-box核心序列對于WRKY結(jié)合的必要性。

通過現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因、RNAi、基因芯片、反向遺傳學(xué)等技術(shù)，人們已經(jīng)鑒定并驗證了許多WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能，它們主要與生長發(fā)育、植物非生物脅迫(干旱、冷害、鹽害)和生物脅迫(昆蟲取食和病原物入侵)等有關(guān)。當(dāng)AtWRKY70過表達(dá)時，會增加擬南芥對病原菌的抗性；AtWRKY53是一個葉片衰老早期階段表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子；研究發(fā)現(xiàn)AtWRKY53過表達(dá)的株系顯示出了加速葉片衰老的現(xiàn)象，相反，在RNAi和插入突變的AtWRKY53抑制表達(dá)株系中，葉片衰老的出現(xiàn)時間被相對延遲；這表明AtWRKY53在調(diào)節(jié)葉片衰老方面具有重要的作用；AtWRKY6是另外一個衰老相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過分析幼葉、成熟葉和衰老葉中AtWRKY6的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，在衰老的葉片中，AtWRKY6的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前兩者。

AtWRKY6/AtWRKY42：早期對WRKY6的研究都集中在衰老和病原菌防御方面，研究表明，WRKY6在葉片衰老期間強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，WRKY6不僅能抑制自身啟動子活性，還能抑制同一亞組的WRKY42的活性，分析表明，有些WRKY啟動子中也存在W-box，從而可以自我調(diào)控和相互調(diào)節(jié)，另一方面，WRKY6正調(diào)控衰老和防御相關(guān)PR1啟動子活性，葉片衰老強(qiáng)烈誘導(dǎo)的SIRK(The senescence-induced receptor kinase)轉(zhuǎn)錄活性依賴于WRKY6。WRKY6通過調(diào)控PHO1(Phosphate1)的表達(dá)來參與擬南芥響應(yīng)Pi饑餓脅迫，PHO1能被Pi饑餓誘導(dǎo)。過表達(dá)WRKY6株系抑制PHO1表達(dá)，使生長受阻、花青素積累以及體內(nèi)Pi含量減少，此外，WRKY42也能結(jié)合PHO1啟動子的W-box抑制PHO1的表達(dá)。還有報道表明，砷通過植物磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體被吸收和移動，WRKY6能被砷誘導(dǎo)，導(dǎo)致Pi響應(yīng)基因的特異性抑制(PHT1；1)。

AtWRKY75最早是從擬南芥芯片數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈誘導(dǎo)PSI基因，并且許多PSI的啟動子中含有W-box。為了破解WRKY75在植物Pi脅迫響應(yīng)中的作用，通過RNAi沉默抑制其表達(dá)，在Pi不足時，該突變體表現(xiàn)出早期花青素積累，包括AtPS1和AtPS2，高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pht1；1和Pht1；4在內(nèi)的一些關(guān)鍵PSI基因表達(dá)減少，推測它們可能參與了Pi運(yùn)輸和信號途徑，這樣就導(dǎo)致Pi吸收和含量減少，也說明在Pi不足時WRKY75對一些Pi動員、吸收、運(yùn)輸以及信號途徑的正調(diào)控，WRKY75的沉默能顯著增加側(cè)根長度，根毛密度和數(shù)量，因此更有利于突變體在更長的時期內(nèi)吸收更多的Pi。在RNA干擾突變植株中，WRKY75對根系生長發(fā)育的調(diào)控與Pi含量無關(guān)，這就表明，WRKY75對植物根系生長發(fā)育調(diào)控的功能行使與Pi饑餓的多少無關(guān)。進(jìn)而推測WRKY75作為根系發(fā)育的組成性負(fù)調(diào)控從而影響Pi的吸收?？偠灾@些數(shù)據(jù)顯示W(wǎng)RKY75在維持植物體內(nèi)Pi平衡中具有重要作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

1、發(fā)明要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明的目的是提供一種大豆磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75。

本發(fā)明的另一個目的是提供該基因所編碼的蛋白。

本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述基因的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明的又一個目的是提供上述基因或重組質(zhì)粒在調(diào)控大豆體內(nèi)磷代謝平衡及培育磷高效利用大豆品種中的應(yīng)用。

2、技術(shù)方案

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種大豆磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75，其核苷酸序列如序列表Seq ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供了一種大豆磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75所編碼的蛋白，其氨基酸序列如序列表Seq ID NO.2所示。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種含有該大豆磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75的重組質(zhì)粒，是將大豆磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75插入pCAMBIA3301植物過量表達(dá)載體和融合表達(dá)載體pJIT-166-GFP中而成的。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了擴(kuò)增所述大豆磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75全長或其任意片段的引物對，該引物對的上游引物如序列表Seq ID No.3所示，下游引物如序列表Seq ID No.4所示。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述的大豆磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75或所述重組質(zhì)粒在調(diào)控大豆體內(nèi)磷代謝平衡中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述的大豆磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75或所述重組質(zhì)粒在培育磷高效利用大豆品種中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，就是將所述磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75通過重組質(zhì)粒導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物相比于目的植物全磷含量明顯升高，側(cè)根及根毛的發(fā)育明顯受到抑制。

3、有益效果

⑴本發(fā)明所提供的大豆饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75，定位在大豆的第16號染色體Gm16:5308516–5311399區(qū)間，包含有2個外顯子1個內(nèi)含子，讀碼框長度為588bp；在靠近N端有一個最為保守的WRKYGQK結(jié)構(gòu)域，此外該結(jié)構(gòu)域還連有一個C₂H₂型的鋅指結(jié)構(gòu)，屬于大豆GmWRKY家族成員；利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明GmWRKY75基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得全磷含量明顯升高，側(cè)根及根毛的發(fā)育明顯受到抑制的轉(zhuǎn)基因植株；

⑵使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo)型啟動子；為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素、卡那霉素等)；

⑶攜帶有本發(fā)明GmWRKY75的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株；被轉(zhuǎn)化的宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物；

⑷本發(fā)明的基因?qū)Υ蠖贵w內(nèi)磷元素代謝有積極的調(diào)控作用，特別的在培育高磷吸收大豆品種育種中具有重要意義。

附圖說明

圖1為植物中的WRKY蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析與結(jié)構(gòu)分析圖。

圖2為大豆GmWRKY75基因的PCR檢測電泳圖。

圖3為大豆GmWRKY75基因的表達(dá)分析圖。

注：用低磷處理大豆幼苗，分別于0h、12h、1d、2d和3d探索基因表達(dá)量的變化；數(shù)值以3個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

圖4為大豆GmWRKY75基因的植物過量表達(dá)載體構(gòu)建和融合表達(dá)載體構(gòu)建圖。

圖5為轉(zhuǎn)基因擬南芥苗的檢測效果圖。

圖6為pCAMBIA3301和pJIT-166-GFP的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖7為轉(zhuǎn)基因擬南芥總磷含量的測定圖。

圖8為轉(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀L度與數(shù)量的測量圖。

圖9為轉(zhuǎn)基因擬南芥根毛長度與數(shù)量的測量圖。

圖10為轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同MS處理下萌發(fā)生長圖。

圖11為轉(zhuǎn)基因擬南芥開花期水培圖及其收貨種子對比圖。

注：1為WT，2-4為轉(zhuǎn)基因擬南芥。

圖12為大豆GmWRKY75基因的亞細(xì)胞定位圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1：GmWRKY75結(jié)構(gòu)分析

GmWRKY75定位在大豆的第16號染色體，位置為Gm16(5 308 516-5 311 399)，具有2個外顯子1個內(nèi)含子。蛋白結(jié)構(gòu)分析(SMART,http://smart.embl-heidelberg.de/)發(fā)現(xiàn)，如圖1A所示，GmWRKY75的N末端有1個WRKYGQK結(jié)構(gòu)域和1個C₂H₂-type鋅指結(jié)構(gòu)。

以GmWRKY75的氨基酸序列為探針，利用NCBI的BLASTp工具，獲得了Arabidopsis，Gossypium raimondii，Medicago truncatula，Oryza sativa和Phaseolus vulgaris中的WRKY75蛋白：AT5G13080，Gorai013G179400，Medtr7g028415，Os07g0680400and Phvul.001G088200。如圖1B所示，多重比對發(fā)現(xiàn)，這些WRKY75蛋白都包含一個WRKYGQK結(jié)構(gòu)域和1個C-X₄-C-X₂₃-H-X₁-H鋅指結(jié)構(gòu)。之后通過文獻(xiàn)查找，檢索到至今所有報道過參與調(diào)控植物磷酸鹽饑餓調(diào)控的WRKY蛋白：GmWRKY75，AtWRKY75，AtWRKY6，AtWRKY42，AtWRKY45，OsWRKY74和GbWRKY1；然后對上述所有蛋白進(jìn)行分析；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖1C所示，GmWRKY75在WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中屬于IIc亞族。

實施例2：大豆磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75的克隆

(1)設(shè)計引物，提取RNA，反轉(zhuǎn)cDNA：

用RNAiso Reagent(購自TaKaRa)提取低磷處理5天后的大豆品種科豐1號根部總RNA，經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性；cDNA的合成按照TaKaRa公司SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II試劑盒說明操作。擴(kuò)增基因GmWRKY75的引物序列為：

Seq ID NO.3：GmWRKY75-F 5’-ATGGAGAATTATTCTATGTTGTTCC-3’；

Seq ID NO.4：GmWRKY75-R 5’-AAAGGGAGTGTATATTTTCATC-3’。

(2)PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：

步驟一：按照以下組份順序配制PCR反應(yīng)液(50μL體系)：ExTaq酶mix(25μL)，GmWRKY75-F(1μL)，GmWRKY75-R(1μL)，cDNA(1μL)，ddH₂O(22μL)；

步驟二：設(shè)定反應(yīng)程序為：95℃，5min；(94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，60sec；30個循環(huán))；72℃，10min；4℃保存；

步驟三：PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，如圖2所示，經(jīng)過15分鐘的瓊脂糖凝膠電泳，獲得了588bp大小的單一條帶，與目的基因大小一致，回收純化后將PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T Simple質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隔夜培養(yǎng)挑取單菌落，培養(yǎng)過夜后進(jìn)行菌檢，將正確的PCR條帶送測序；根據(jù)測序結(jié)果，保存插入片段正確的菌液并提取質(zhì)粒。

實施例3：大豆磷饑餓轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY75的熒光定量分析

(1)選取處理時間分別為0h、12h、1d、2d和3d的大豆根與葉的cDNA樣品為材料，選用的熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒為IQ SYBR Green(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)；

(2)設(shè)計引物

針對GmWRKY75基因序列設(shè)計熒光定量特異性引物為：

Seq ID NO.5：上游引物5’-TGTGAGTGATGAGTTAGGTGGTTCC-3’；

Seq ID NO.6：下游引物5’-AACAGCTTTTTGGCCATACTTCCTC-3’。

內(nèi)參基因選用Tubulin，引物序列如下：

Seq ID NO.7：上游引物5’-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3’；

Seq ID NO.8：下游引物5’-CACTTACGCATCACATAGCA-3’。

(3)熒光定量PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：

步驟一：按照以下組份順序配制PCR反應(yīng)體系(20μL體系)：2×SuperReal PreMix(SYBR Green)(10μL)，引物(各0.5μL)，cDNA(2μL)，ddH₂O(7μL)；

步驟二：使用CFX96Touch(Bio-Rad)實時熒光定量PCR儀，設(shè)定PCR反應(yīng)程序為，95℃，15min；(95℃，10sec；60℃，30sec；40個循環(huán))；

步驟三：熒光定量PCR所獲得的結(jié)果，均采用2^-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量，具體方法如下，以正常磷環(huán)境下生長0h、12h、1d、2d和3d的大豆根和葉組織cDNA的C_t值為對照組，以低磷環(huán)境下生長0h、12h、1d、2d和3d的大豆根和葉組織cDNA的C_t值為處理組；設(shè)0d的Δ值為1，計算出處理0h、12h、1d、2d和3d相較于0d時的表達(dá)倍數(shù)；公式如下：2^-ΔΔCt＝[(C_ttreated-C_t control)sampleA-(C_t treated-C_t control)sampleB]；三次生物學(xué)重復(fù)所計算出的數(shù)據(jù)，與對照組數(shù)據(jù)在Excel 2007軟件中進(jìn)行Student’s t-test檢測，獲得處理組相對表達(dá)量變化三次生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差，以*P＝0.05；**P＝0.01；***P＝0.001的標(biāo)準(zhǔn)繪制成圖。

如圖3所示，低磷環(huán)境的誘導(dǎo)下，大豆葉中GmWRKY75的表達(dá)隨著磷饑餓脅迫時間的延長在處理1天后，相對表達(dá)量顯著升高；而大豆根中GmWRKY75的表達(dá)隨著磷饑餓脅迫時間的延長在處理2天后，相對表達(dá)量顯著升高。說明低磷環(huán)境會誘導(dǎo)GmWRKY75基因的表達(dá)。

實施例4：大豆GmWRKY75基因在擬南芥中的表達(dá)

(1)GmWRKY75的植物表達(dá)載體所使用的載體為pCAMBIA3301，pCAMBIA3301-GmWRKY75載體的構(gòu)建方法為雙酶切法，設(shè)計特異性引物，加Nco I、Bgl II酶切位點和保護(hù)堿基，特異性引物為：

Seq ID NO.9：上游引物如下

5’-CATGCCATGGATGGAGAATTATTCTAT-3’；

Seq ID NO.10：下游引物如下

5’-GAAGATCTTTAAAAGGGAGTGTATATTTTC-3’；

(2)經(jīng)過PCR反應(yīng)程序及PCR產(chǎn)物回收，然后對PCR產(chǎn)物回收和空載pCAMBIA3301進(jìn)行雙酶切，回收純化正確的片段進(jìn)行連接。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落，培養(yǎng)后進(jìn)行測序，選取正確測序結(jié)果提取質(zhì)粒，獲得pCAMBIA3301-GmWRKY75質(zhì)粒(如圖6A所示)，并進(jìn)行雙酶切檢測再次檢驗質(zhì)粒是否正確，如圖4所示，瓊脂糖凝膠電泳獲得了與目的基因大小一致的條帶，證實實驗結(jié)果真實可信。

(3)將正確含有目的基因的植物表達(dá)載體利用滴花法轉(zhuǎn)化擬南芥，具體步驟如下：

步驟一：在擬南芥生生長至剛開花時，剪斷主莖以促進(jìn)側(cè)枝花序生長；

步驟二：當(dāng)花蕾露白時，培養(yǎng)帶有pEarleygate103-GmWRKY75的農(nóng)桿菌，200rpm 28℃條件下?lián)u菌至OD₆₀₀值達(dá)到1.2-1.8，4000rpm 4℃離心10min；

步驟三：用5％的蔗糖溶液重懸2次，將OD值稀釋到0.8-1.0；

步驟四：加入表面活性劑Silwet L-77(用量0.01％)混勻菌液；

步驟五：用槍頭將菌液滴到花蕾上，重復(fù)一次；

步驟六：用黑色塑料袋套袋，暗培養(yǎng)一天后正常培養(yǎng)；

步驟七：在花期中可多次侵染；

步驟八：待種子成熟后，分株收種。

(4)陽性轉(zhuǎn)基因苗的篩選，具體步驟如下：

步驟一：選取適量的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子，使用含有20mg·L-1Bar的1/2MS培養(yǎng)基，對擬南芥種子進(jìn)行培養(yǎng)；。

步驟二：培養(yǎng)2周后進(jìn)行觀察，若植株為陽性苗則可以在篩選培養(yǎng)基上正常生長至長出2片真葉，并且根系發(fā)達(dá)，而野生型植株和轉(zhuǎn)基因陰性植株則不能正常生長；

步驟三：將初步鑒定的陽性苗轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)至即將抽薹；

步驟四：取葉片提取DNA進(jìn)行PCR檢測，陽性苗繼續(xù)培養(yǎng)收種；

步驟五：重復(fù)上述收種、消毒、培養(yǎng)、鑒定的過程，待繁殖到T₃代進(jìn)行功能驗證。

(5)熒光定量PCR的方法檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中GmWRKY75的表達(dá)量

實驗材料為擬南芥WT，擬南芥突變體wrky75和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株OXWRKY75；熒光定量PCR驗證突變體中AtWRKY75的表達(dá)量和過表達(dá)株系中GmWRKY75的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖5A所示，wrky75中AtWRKY75表達(dá)幾乎為0；如圖5B所示，過表達(dá)株系(OXWRKY75-13和OXWRKY75-14)中GmWRKY75的表達(dá)均大幅高于AtWRKY75，說明擬南芥突變體wrky75和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株OXWRKY75均達(dá)到了實驗要求。

實施例5：轉(zhuǎn)基因植株全磷含量的測定，具體步驟如下：

分別檢測了野生型(WT)、突變體wrky75和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株OXWRKY75中的全磷含量。分別將20日齡的WT、wrky75和OXWRKY75置于正常磷(625μM KH₂PO₄)條件下和低磷(6.25μM KH₂PO₄)條件下培養(yǎng)，然后取整株幼苗進(jìn)行后續(xù)實驗。

步驟一：稱取0.02g左右的樣品干重，加入8mL ddH₂O和2mL HNO₃，用微波消解系統(tǒng)(Milestone ETHOS)200℃消煮10min，冷卻至室溫后，用ddH₂O定容至10mL；

步驟二：用PerkinElmer Optima 2100DV ICP-OES system對樣品總磷含量進(jìn)行測定；

步驟三：用磷標(biāo)樣(1000μg/mL)稀釋不同濃度，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

如圖7所示，發(fā)現(xiàn)與WT相比，在正常環(huán)境和低磷環(huán)境中OXWRKY75的全磷含量均明顯升高，而突變體wrky75的全磷含量并沒有明顯變化。

實施例6：GmWRKY75轉(zhuǎn)基因植株根系統(tǒng)的觀察

(1)將生長于1/2MS培養(yǎng)基中10天的擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移到正常磷MS和low P培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天。使用愛普生EPSON Perfection V700/V750掃描整株后，使用winRHIZO根系分析系統(tǒng)分析相關(guān)信息。

(2)根毛形態(tài)分析：將生長在1/2MS培養(yǎng)基中10天的擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移到全磷MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，使用體視鏡(OLYMPUS MVX10)拍攝初生根，使用ImageJ來測定該區(qū)域內(nèi)(5mm)的根毛的長度和根毛的總數(shù)。

擬南芥根的構(gòu)造包括三個部分，即初生根、側(cè)根和根毛。初生根分生組織通過細(xì)胞的分裂，可以不停增加新的細(xì)胞是根部可以無限的生長；側(cè)根的形成增加了根系探索的能力；而根毛的形成可以增加初生根和側(cè)根的總表面面積。當(dāng)遇到營養(yǎng)缺乏時，它們形態(tài)就會發(fā)生改變從而影響根的構(gòu)造和植物在土壤中的狀態(tài)。通常情況下，缺磷條件下植物的初生根生長會被抑制，而側(cè)根的發(fā)育會被增強(qiáng)。

如圖8和圖9所示，與野生型擬南芥相比，兩個GmWRKY75過表達(dá)擬南芥株系(OX75-13和OX75-14)側(cè)根的總長度、分枝數(shù)和根毛的數(shù)量在低磷環(huán)境下均顯著下降，結(jié)果證明GmWRKY75的過表達(dá)會抑制擬南芥?zhèn)雀透陌l(fā)育。

實施例7：GmWRKY75轉(zhuǎn)擬南芥植株的觀察

(1)把野生型WT和GmWRKY75轉(zhuǎn)基因株系放置在的不同磷濃度梯度的萌發(fā)培養(yǎng)基上，設(shè)置3個重復(fù)，3個梯度分別是：正常的1/2MS(2.35mM)中磷酸鹽含量、缺磷(減少10^-1，0.235mM)和嚴(yán)重缺磷(減少10^-2，0.0235mM)的1/2MS，觀察野生型和轉(zhuǎn)基因株系生長狀況。

(2)正常1/2MS上萌發(fā)的幼苗4葉后移栽到模擬低磷水培(10^-1倍)溶液，水培集裝箱內(nèi)放置加氧泵，每周換一次營養(yǎng)液，挑選野生型做對照，和GmWRKY75轉(zhuǎn)基因株系，觀察擬南芥的開花結(jié)實狀況。

從圖10中可以明顯看出，隨著磷濃度的缺乏加重，表型也發(fā)生不同程度的缺磷癥狀。特別在10^-2嚴(yán)重缺磷的MS上，幼苗表現(xiàn)了葉色濃綠，葉柄和幼莖呈紫紅色，側(cè)根發(fā)達(dá)根毛濃密，而且是野生型植株幾乎都不能正常生長，大部分都死亡，而轉(zhuǎn)基因的陽性苗還可以成活，說明GmWRKY75轉(zhuǎn)錄因子在低磷脅迫下響應(yīng)，具有一定的耐低磷環(huán)境的功能。

將在正常的1/2MS上萌發(fā)的野生型和轉(zhuǎn)基因株系長到4片真葉后移栽到模擬的低磷(10^-1MS)水培環(huán)境下，營養(yǎng)液中放置加氧泵，每三天換一次營養(yǎng)液，直至開花結(jié)實，觀察對植株營養(yǎng)生長的影響。

從圖11A中可以明顯看出，野生型在模擬低磷水培下不能正常生長，植株矮小發(fā)育遲緩，葉片小而深綠，表現(xiàn)出缺磷的初步癥狀，開花期明顯延遲。從圖11B后期結(jié)實情況看，野生型莢數(shù)明顯少于轉(zhuǎn)基因株系，且多數(shù)莢果癟小，種子發(fā)育不成熟。

實施例8：GmWRKY75的亞細(xì)胞定位

(1)GmWRKY75的亞細(xì)胞定位所使用的載體為pJIT-166-GFP，pJIT-166-GFP-GmWRKY75載體的構(gòu)建方法為雙酶切法，設(shè)計特異性引物，加Xba I、BamH I酶切位點和保護(hù)堿基。

特異性引物為：

Seq ID NO.11：上游引物如下

5’-GCTCTAGAATGGAGAATTATTCTATGTTGTTCCC-3’；

Seq ID NO.12：下游引物如下

5’-CGGGATCCAAAGGGAGTGTATATTTTCATC-3’；

經(jīng)過PCR反應(yīng)程序及PCR產(chǎn)物回收，然后對PCR產(chǎn)物回收和空載pJIT-166-GFP進(jìn)行雙酶切，回收純化正確的片段進(jìn)行連接。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落，培養(yǎng)后進(jìn)行測序，選取正確測序結(jié)果提取質(zhì)粒，獲得pJIT-166-GFP-GmWRKY75質(zhì)粒(如圖6B所示)，并進(jìn)行雙酶切檢測再次檢驗質(zhì)粒是否正確，瓊脂糖凝膠電泳獲得了與目的基因大小一致的條帶，證實實驗結(jié)果真實可信(如圖4所示)。

(2)使用基因槍轟擊洋蔥內(nèi)表皮和PEG轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體兩種方法來探究GmWRKY75在植物細(xì)胞中的定位。

A.基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮法，具體步驟如下：

步驟一：使用新鮮洋蔥，將其鱗莖切成適量大小，剝?nèi)?nèi)表皮迅速貼到等滲的MS培養(yǎng)基上，倒置25℃暗培養(yǎng)過夜；

步驟二：制備微彈：在1.5mL的無菌離心管中加入8.5μL金粉，渦旋2min，使其均勻懸浮；在該管中依次加入5μL質(zhì)粒DNA(1μg/μL)，10μL CaCl₂(2.5M)，4μL亞精胺(0.1M)，渦旋2-3min充分混勻，4℃靜置10min；10000rpm離心10s，棄上清，加入140μL70％乙醇，渦旋2min；重復(fù)上一步；加入10μL無水乙醇重懸，充分混勻；

步驟三：基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，通過基因槍將包裹DNA的金粉微彈轟擊至洋蔥表皮細(xì)胞中，25℃暗培養(yǎng)20h后，將洋蔥表皮置于載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光的位置。

觀察結(jié)果如圖12所示，從圖中可以看出，熒光信號很強(qiáng)，空載中綠色熒光分布在整個細(xì)胞中，而pJIT166-GFP-GmWRKY75的綠色熒光只在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，說明這2個轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核內(nèi)，在核內(nèi)行使功能。