本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是涉及一種經(jīng)修飾的siRNA分子、RNAi分子混合物及其應用。
背景技術(shù)：
：RNAi廣泛存在于自然界的物種中，自AndrewFire和CraigMello等人1998年在線蟲(Caenorhabditiselegans)中首次發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象，Tuschl和PhilSharp等人2001年證實在哺乳動物中也存在RNAi之后，關(guān)于RNAi的機制原理、基因功能和臨床應用等研究取得了一系列的進展；RNAi不僅在防御病毒感染，防轉(zhuǎn)座子跳躍等多種機體保護機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Huntvagneretal,2001；Tuschl,2001；Waterhouseetal,2001；Zamore2001)，其相關(guān)產(chǎn)品也是十分有前景的候選藥物。PPIB(peptidylprolylisomeraseB，肽基脯氨?；悩?gòu)酶B)也稱為親環(huán)素B(cyclophilinB)。親環(huán)素B在體內(nèi)分布廣泛，人類的親環(huán)蛋白B(CyPB)在腎臟中含量很高；PPIB與多種疾病相關(guān)，特別是與自身免疫性疾病關(guān)系密切。同時親環(huán)素B的下降與HCV抑制程度相關(guān)，研究表明親環(huán)素B表達可能影響HCV引起的肝纖維化或肝硬化(中華肝臟病雜志，2012，20(9)，王慧付，付金棟，劉京營等)。另有研究發(fā)現(xiàn)一些親環(huán)素抑制劑可以通過結(jié)合親環(huán)素B，從而抑制HCV的復制。基于PPIB在肝疾病的發(fā)生和發(fā)展中可能起著重要的作用，對以PPIB為靶基因的RNAi試劑的開發(fā)，有利于對PPIB相關(guān)疾病的機制研究與藥物研制?，F(xiàn)有的siRNA分子，通常是每條鏈19nt,3’-突出端有2個dTdT懸垂,參見CN101974533AC。目前的siRNA分子或siRNA分子混合物，還存在設計復雜，且效果不好的缺陷。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一種靶向PPIB基因的siRNA分子，用于抑制PPIB基因的表達，該所述siRNA分子能有效抑制靶基因表達，穩(wěn)定性好且設計簡單。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種抑制PPIB基因表達的siRNA分子,所述siRNA分子的結(jié)構(gòu)為：(1)正義鏈和反義鏈完全互補；(2)正義鏈或反義鏈的長度為17-27nt；(3)正義鏈的一端或兩端的從末端開始連續(xù)5-10個核苷酸經(jīng)過2’-位核糖修飾；如果兩端都有核苷酸經(jīng)過2’-位核糖修飾，則所述的兩端修飾的核苷酸個數(shù)和位置是對稱的；(4)所述siRNA分子為平末端，反義鏈是未修飾的，所述siRNA分子靶向PPIB基因。在其中一個實施例中，所述siRNA分子為平末端，正義鏈和/或反義鏈的的長度為24-26nt；正義鏈的一端或兩端的從末端開始連續(xù)6-8個核苷酸經(jīng)過2’-位核糖修飾。在其中一個實施例中，正義鏈的兩端的從末端開始連續(xù)7個核苷酸經(jīng)過2’-位核糖修飾。在其中一個實施例中，所述2’-核糖修飾是2’-O-甲基修飾。在其中一個實施例中，所述siRNA分子的堿基組成選自所述siRNA分子的堿基組成選自：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8，SEQIDNO.9和SEQIDNO.10，SEQIDNO.11和SEQIDNO.12，SEQIDNO.13和SEQIDNO.14，SEQIDNO.15和SEQIDNO.16，SEQIDNO.17和SEQIDNO.18，SEQIDNO.19和SEQIDNO.20，或siRNA分子序列與選自SEQIDNO.1-SEQIDNO.20的序列一致性(idendity)至少為80％的序列，更優(yōu)選為90％，最優(yōu)選為95％。本發(fā)明的另一目的是提供一種抑制PPIB基因表達的RNAi分子混合物。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種抑制PPIB基因表達的RNAi分子混合物，其包括有5-10個上述的siRNA分子。所述RNAi分子混合物中不同種的siRNA分子的濃度比為1：1-5。在其中一個實施例中，每種siRNA分子的濃度比為1：1。本發(fā)明的另一目的是提供上述的siRNA分子或上述的RNAi分子混合物的應用。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。上述的siRNA分子或上述的RNAi分子混合物在制備抑制細胞中PPIB基因表達的藥物中的應用。在其中一個實施例中，所述細胞為癌細胞，視網(wǎng)膜病變細胞，自身免疫病細胞，炎性細胞。所述癌細胞為子宮頸癌細胞、肝癌細胞、結(jié)直腸癌細胞、HCV細胞、腎癌細胞、肺癌細胞。本發(fā)明的另一目的是提供一種降低細胞中PPIB基因表達的方法。一種降低細胞中PPIB基因表達的方法，包括以下步驟：方法包括a)獲得上述siRNA分子或其混合物，所述RNAi分子混合物至少包括5,6,7,8,9,10個siRNA；b)將所述siRNA分子或所述RNAi分子混合物遞送進細胞。上述靶向PPIB基因的RNAi分子混合物，其主要優(yōu)勢在于：(1)本發(fā)明只需要經(jīng)過有如上設計的5-10個siRNA分子的混合物(RNAi分子混合物)均能有效抑制靶基因表達，所有的RNAi分子混合物均能確保75％以上的抑制效率，且所述RNAi分子混合物中的siRNA分子序列的堿基不需特殊設計，通過在線工具或其他常規(guī)技術(shù)均可獲得；而在現(xiàn)有技術(shù)中，不是所有設計的siRNA分子都能達到抑制基因表達的效果，一般設計的siRNA僅有50％的概率能抑制靶基因表達，僅25％的siRNA能達到75％以上的抑制效果，從而后續(xù)還需對siRNA進行篩選、優(yōu)化，或?qū)ζ湫ЧM行實驗驗證，費時耗力；而本發(fā)明設計的siRNA分子可以很好的解決這個問題，其核心的設計在于對正義鏈的1個或2個末端5-10個核苷酸進行了2’-位核糖修飾的修飾，特別是siRNA分子為平末端，正義鏈的兩個末端6-8個核苷酸進行了2’-位核糖修飾的修飾時，具有非常好的對靶基因抑制表達的效果。(2)解決了在不同細胞系中、不同轉(zhuǎn)染試劑處理時，siRNA作用不一致的問題，可在多個細胞系中有效沉默靶基因，并且不受轉(zhuǎn)染試劑的影響。(3)增強了RNAi分子的基因沉默效果，RNAi分子間存在協(xié)同增效效應。綜上，本發(fā)明所述RNAi分子混合物提高了寡核酸抑制基因表達的概率，整體上提升了抑制效率；且其在應用過程中，省去了前期對單一RNAi分子的復雜設計、篩選、驗證與優(yōu)化的過程，操作簡單、節(jié)省成本。是一種通用、有效、快速的RNAi工具。附圖說明圖1實施例三中HeLa細胞中不同組合的siRNAs的抑制效果比較示意圖。圖2實施例五中RB-PPI-D4的體外穩(wěn)定性測定結(jié)果示意圖。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。本發(fā)明的一個實施例中公開了一種抑制PPIB基因表達的siRNA分子,其結(jié)構(gòu)為：(1)正義鏈和反義鏈完全互補；(2)正義鏈或反義鏈的長度為17-27nt；(3)正義鏈的一端或兩端的從末端開始連續(xù)5-10個核苷酸經(jīng)過2’-位核糖修飾；如果兩端都有核苷酸經(jīng)過2’-位核糖修飾，則所述的兩端修飾的核苷酸個數(shù)和位置是對稱的；(4)所述siRNA分子為平末端，反義鏈是未修飾的，所述siRNA分子靶向PPIB基因。本發(fā)明的平末端是指siRNA在其整個長度上是雙鏈的，即在分子的任一端都沒有突出的單鏈序列。本發(fā)明的siRNA分子為雙鏈的dsRNA分子，dsRNA分子由兩條鏈組成，每條鏈的長度為17-27個nt,優(yōu)選24-26nt,反義鏈與mRNA完全互補，“互補”是指核堿基之間配對的能力。本發(fā)明中也可用堿基或堿基長度來表示核苷酸或RNA分子鏈的長度。在一些實施例中，正義鏈的5末端的第1-10位和/或3末端的第1-10位任選1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個核苷酸經(jīng)過修飾。在一些實施例中，正義鏈的5末端的第1-7位的核苷酸和3末端的第1-7位的核苷酸經(jīng)過過2’-位核糖修飾。所述2’-核糖修飾是2’-O-甲基修飾。該修飾一方面提升了體外或體內(nèi)抑制試驗中對核酸酶的抗性；另一方面有利于儲存和運輸。本發(fā)明的正義鏈修飾可起到：(1)增強siRNA分子穩(wěn)定性，尤其是在血清中的穩(wěn)定性提高。(2)減少siRNA分子脫靶性；(3)提高siRNA分子特異性；(4)減少免疫激活反應等作用。所述“特異性”指siRNA與靶mRNA間具有必要程度的互補性以誘導靶基因的抑制，而對非mRNA無抑制作用或僅有極小的抑制作用。在其中某些實施方案中，RNAi分子選自包括RB-PPI-D1、RB-PPI-D2、RB-PPI-D3、RB-PPI-D4、RB-PPI-D5、RB-PPI-D6、RB-PPI-D7、RB-PPI-D8、RB-PPI-D9、RB-PPI-D10中的任一個，或與上siRNA分子序列一致性(idendity)至少為80％，更優(yōu)選為90％，最優(yōu)選為95％的序列。本發(fā)明其中一個實施例中，所述RNAi分子混合物在不同細胞系中、不同轉(zhuǎn)染試劑處理時可以確保至少75％的靶基因抑制效果。本發(fā)明的“抑制”或類似表達可指RNA或蛋白水平或相關(guān)生化指標的表達、活性或指標相對陰性對照的降低。本發(fā)明的RNAi分子混合物針對PPIB基因的mRNA不同區(qū)域。本發(fā)明所述的抑制PPIB基因表達的RNAi分子混合物，其包括有至少5個根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述siRNA分子。在其中一個實施例中，其包括有6或7個所述siRNA分子。目前，文獻中涉及到的RNAi分子混合物，常常是有至少幾十個以上的siRNA分子構(gòu)成siRNA池(pool)，其優(yōu)勢在于可以提高基因沉默的命中率。而在本發(fā)明中，根據(jù)上述我們改進的siRNA設計法則，可達到減少pool應用時的siRNA分子個數(shù)，同時提升了抑制基因表達的效果。本發(fā)明中，RNAi分子混合物中單個RNAi分子的濃度可以是隨機的，其最低濃度和最高濃度的siRNA的濃度范圍可以為1：1至1：5，優(yōu)選單個siRNA分子的濃度相等；單個RNAi分子間不會有活性的干擾。本發(fā)明的siRNA分子的抑制效率至少為45％，50％，60％，65％，70％，75％，80％；本發(fā)明的RNAi分子混合物的抑制效率至少為75％，80％，85％，90％。在其中一個方案中，涉及本發(fā)明的RNAi分子或其混合物在抑制細胞中靶基因表達的用途，所述靶細胞可以為真核生物細胞或原核生物細胞，原核生物細胞如植物細胞等，真核生物細胞包括哺乳動物細胞細胞，優(yōu)選嚙齒類動物細胞、靈長類動物細胞，人類細胞；細胞可以來源于多種組織或器官，如血液，淋巴，骨髓，腦，血管，肝，肺，骨，乳腺，軟骨，宮頸，結(jié)腸，角膜，胚胎，腎，肌肉，卵巢，胰腺，前列腺，皮膚，腸，脾，胃等；細胞種類可為多種，包括成纖維細胞，肌細胞，心肌細胞等，或是處于病理狀態(tài)的細胞，如癌癥細胞(如子宮頸癌、肝細胞癌、肺癌或腎細胞癌)，視網(wǎng)膜病變細胞，自身免疫病細胞，炎性細胞(包括銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等)、病毒疾病細胞(如HIV丙型肝炎)和心血管疾病細胞等。優(yōu)選靶細胞中的靶基因表達，更優(yōu)選靶細胞中的靶基因高水平表達。在一個方案中，所述細胞為HeLa、293T、A549、HUVEC細胞。將所述siRNA分子或所述RNAi分子混合物遞送進細胞，本發(fā)明是通過向細胞引入siRNA分子或其混合物，抑制靶基因的表達；引入可以為直接引入或間接引入，除使用轉(zhuǎn)染試劑外，其他已知的各種將RNAi分子遞送如細胞的方式都可采用，如注射、載體轉(zhuǎn)染(載體可以是質(zhì)?；虿《?、電穿孔，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，或?qū)⑵渑c特異結(jié)合細胞表面所表達的受體或抗原的肽或抗體連接的定向施用等。實施例一：寡核酸的設計設計的所有單個siRNA分子均能靶向靶基因(如表1),RNAi分子混合物由5-10個siRNA分子組成，siRNA每條鏈長度為25-mer,平末端；AS鏈和SS鏈完全互補，AS鏈與靶基因完全互補，SS的5’末端和3’末端的各有7個連續(xù)的核苷酸經(jīng)過2’-O-Me修飾。表1靶基因靶基因名稱登錄號PPIB肽基脯氨?；悩?gòu)酶BNM_000942表2siRNA序列實施例二不同細胞系中RCL-02的抑制效果比較1細胞培養(yǎng)方法：將HeLa、293T、A549和HUVEC細胞(均來源于ATCC)用0.25％的胰酶胰酶消化，稀釋后接種到24孔板，800μL/孔，以24h后長滿30-40％為宜，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。2細胞轉(zhuǎn)染與實時熒光定量PCR將RCL-02(100nM)轉(zhuǎn)入4種不同的細胞系(293T,HeLa,A549與HUVEC)，轉(zhuǎn)染試劑分別為riboFECT(5μL每孔)和LF2K(1μL每孔)。RCL-02表示7個雙鏈siRNA分子的組合,7個雙鏈siRNA分子為RB-PPI-D1、RB-PPI-D2、RB-PPI-D3、RB-PPI-D4、RB-PPI-D5、RB-PPI-D6、RB-PPI-D7，各單個siRNA分子在組合物中的含量是均等的，即1:1:1:1:1:1:1的配比。riboFECT(50μL)轉(zhuǎn)染體系：5μLriboFECT(廣州市銳博生物科技有限公司C10511-05)，5μLsiRNA組RCL-02(終濃度100nM)和40μL轉(zhuǎn)染緩沖液。LF2K(100μL轉(zhuǎn)染體系)：1μLLF2K(Invitrogen11668019)，5μLsiRNA組RCL-02(終濃度100nM)和94μLOpti-MEM細胞培養(yǎng)基(ThermoFisherScientific，31985070)轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞，Trizol法提取RNA，進行RealTimePCR，ReverseTranscriptionmix反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于反轉(zhuǎn)錄(廣州市銳博生物科技有限公司，C10170)，得到siRNA轉(zhuǎn)染細胞的cDNA，以cDNA為模板，用對應的引物對進行RT-PCR擴增，以人的看家基因actin作為內(nèi)參基因，利用Real-timePCR試劑盒SYBRPremix(2×)(BIO-RAD750000131)，按照常規(guī)方法，進行實時熒光定量PCR反應。一個樣品的9個重復(3個生物學重復用于細胞轉(zhuǎn)染，在qPCR時每個重復做3個復孔)的Ct誤差在±0.5，然后用CFX2.1進行相對定量分析。SPSS19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)分析，數(shù)表中數(shù)據(jù)為其平均值，P值均<0.05。NC陰性對照組：轉(zhuǎn)染的siRNA為無關(guān)非特異siRNA。N空白對照組：正常細胞，無siRNA轉(zhuǎn)染。Real-TimePCR抑制率計算方式：NC陰性對照組mRNA的相對表達水平為1。引物為：h-PPIB-qPCR-FGGCAAGCATGTGGTGTTTGGSEQIDNO.21h-PPIB-qPCR-RGGTTTATCCCGGCTGTCTGTCSEQIDNO.22h-actin-qPCR-FTCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGSEQIDNO.23h-actin-qPCR-RACATCTGCTGGAAGGTGGACASEQIDNO.24Real-TimePCR結(jié)果如下表所示：表3不同細胞系中抑制率比較結(jié)果表明，相對NC對照(NC對照表達率為1)，在不同的細胞系中，使用不同的轉(zhuǎn)染試劑，RCL-02均能達到80％以上的抑制效果。實施例三HeLa細胞中RCL-03，RCL-02的抑制效果比較RCL-04表示5個雙鏈siRNA分子的組合,即RB-PPI-D2、RB-PPI-D3、RB-PPI-D4、RB-PPI-D5、RB-PPI-D6的組合物，RCL-03表示6個雙鏈siRNA分子的組合,即RB-PPI-D2、RB-PPI-D3、RB-PPI-D4、RB-PPI-D5、RB-PPI-D6、RB-PPI-D7的組合物，RCL-01表示10個雙鏈siRNA分子的組合,即RB-PPI-D1、RB-PPI-D2、RB-PPI-D3、RB-PPI-D4、RB-PPI-D5、RB-PPI-D6、RB-PPI-D7、RB-PPI-D8、RB-PPI-D9、RB-PPI-D10的組合物。各單個siRNA分子在組合物中的含量是均等的，即都是1:1的配比(附圖中為5對組合代表RCL-04實驗組，6對組合代表RCL-03實驗組，7對組合代表RCL-02實驗組、10對組合代表RCL-01實驗組)。1細胞培養(yǎng)將HeLa細胞(細胞來源于ATCC)接種培養(yǎng)24h后觀察細胞，狀態(tài)良好開始轉(zhuǎn)染。2細胞轉(zhuǎn)染與實時熒光定量PCR反應(1)100μL轉(zhuǎn)染體系：1μLLF2K(Invitrogen11668019)，5μL(100nM)RCL-02，RCL-03分別和94μLOpti-MEM細胞培養(yǎng)基(ThermoFisherScientific，31985070)。(2)細胞培養(yǎng)板的每個孔中加入上述100μL轉(zhuǎn)染體系，轉(zhuǎn)染48h后，收集細胞，Trizol法提取RNA，ReverseTranscriptionmix反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于反轉(zhuǎn)錄(廣州市銳博生物科技有限公司，C10170)，Real-timePCR試劑盒SYBRPremix(2×)(BIO-RAD750000131)按照常規(guī)方法進行實時熒光定量PCR反應。引物為：h-PPIB-qPCR-FGGCAAGCATGTGGTGTTTGGSEQIDNO.21h-PPIB-qPCR-RGGTTTATCCCGGCTGTCTGTCSEQIDNO.22(3)Real-TimePCR結(jié)果如請見圖1。結(jié)果表明，不同組合的siRNAs均能起到高效抑制靶基因的作用,抑制率在75％以上。其中，RCL-02實驗組與RCL-01實驗組的都非常好。實施例四HeLa細胞中RCL-03與單個siRNA分子的靶基因抑制率比較1細胞培養(yǎng)將HeLa細胞(細胞來源于ATCC)接種培養(yǎng)24h后觀察細胞，狀態(tài)良好開始轉(zhuǎn)染。2細胞轉(zhuǎn)染與實時熒光定量PCR反應(1)100μL轉(zhuǎn)染體系：1μLLF2K(Invitrogen11668019)，5μL(100nM)RCL-02或5μL(100nM)單個siRNA分別和94μLOpti-MEM細胞培養(yǎng)基(ThermoFisherScientific，31985070)。(2)細胞培養(yǎng)板的每個孔中加入上述100μL轉(zhuǎn)染體系，轉(zhuǎn)染48h后，收集細胞，Trizol法提取RNA，ReverseTranscriptionmix反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于反轉(zhuǎn)錄(廣州市銳博生物科技有限公司，C10170)，Real-timePCR試劑盒SYBRPremix(2×)(BIO-RAD750000131)按照常規(guī)方法進行實時熒光定量PCR反應。引物為：h-PPIB-qPCR-FGGCAAGCATGTGGTGTTTGGh-PPIB-qPCR-RGGTTTATCCCGGCTGTCTGTC(3)Real-TimePCR結(jié)果如下表所示：表5HeLa細胞中RCL-02與單個siRNA分子的抑制率比較結(jié)果表明，組合siRNAsRCL-02的抑制率大于80％，且與同等濃度的單個siRNA分子相比，起到了協(xié)同增效的作用。(D2代表RB-PPI-D2，D3代表RB-PPI-D3，以此類推)。實施例5體外穩(wěn)定性測定將RB-PPI-D4經(jīng)無RNA酶水稀釋至5μM后加入等體積的新鮮大鼠血清(為上海遠慕生物科技有限公司產(chǎn)品),然后在37℃孵育0-24小時，取樣進行電泳觀察不同siRNA的完整性。結(jié)果如圖2顯示：siRNA在血清中穩(wěn)定，6h內(nèi)基本沒有降解，12內(nèi)沒有顯著降解，預計其在體內(nèi)具有更好的效力。其它RB-PPI-Dx(x為D1-D10)，其實驗結(jié)果相同，具體圖省略。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。當前第1頁1 2 3