本發(fā)明提供一種肺泡灌洗液宏基因組的提取方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

下呼吸道感染是臨床較為常見的感染，病原菌種類多、耐藥性強(qiáng)。目前病原診斷普遍采用痰培養(yǎng)，但因其易污染，液痰的質(zhì)量難以保障，嚴(yán)重影響診斷的準(zhǔn)確性。肺泡灌洗液與液痰相比，因其直接取材于病變部位，獲得病原菌的機(jī)會多，并能大幅度減少口咽部定植微生物群對標(biāo)本的污染，提高了病原菌的分離率，因此對下呼吸道感染診斷具有更高的特異性和敏感性。采用肺泡灌洗液進(jìn)行病原診斷不僅能夠獲得準(zhǔn)確的病原，同時針對其進(jìn)行細(xì)菌藥物敏感效果試驗(yàn)對臨床抗感染治療更有價(jià)值。

宏基因組包含了微生物群落的所有遺傳信息，宏基因組學(xué)處理群落中各種微生物的分類信息外，也包含了所有微生物的基因信息；因此這種數(shù)據(jù)有利于我們對群落的功能進(jìn)行深入分析。近年來二代測序技術(shù)的快速發(fā)展，環(huán)境微生物的全基因組測序成為可能，在獲得海量的數(shù)據(jù)后，便可全面分析微生物群落結(jié)構(gòu)以及基因功能組成等。例如，近年來諸多學(xué)著應(yīng)用宏基因組技術(shù)對Ⅱ型糖尿病人體腸道菌群多樣性進(jìn)行研究，分析了人體腸道微生物與Ⅱ型糖尿病之間的關(guān)系，對兩者之間的關(guān)系進(jìn)行了深入的研究。

利用宏基因組學(xué)手段進(jìn)行患處微生態(tài)研究可深入解析疾病與病原菌之間的聯(lián)系。進(jìn)行肺部細(xì)菌宏基因組學(xué)研究的關(guān)鍵是細(xì)菌總DNA提取。由于肺泡灌洗液中所含有的細(xì)胞量較少，而且主要是人體細(xì)胞，細(xì)菌的含量非常低；因此如何高效地從肺泡灌洗液中提取細(xì)菌基因組DNA就尤為重要。樣品總DNA的提取方法主要分為直接提取法和間接提取法：直接提取法是先直接裂解樣品中的微生物細(xì)胞使其DNA釋放后進(jìn)行提?。婚g接提取法則先要分離樣品中的微生物，去除雜質(zhì)后，抽提DNA。本發(fā)明采用直接提取方法。然后通過引物設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增細(xì)菌基因片段，可以排除人類基因組的干擾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種安全、簡便、污染少、重復(fù)性好的肺泡灌洗液宏基因組DNA的提取方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種肺泡灌洗液宏基因組的提取方法，包括樣本液化及細(xì)胞破碎，目的DNA的游離以及雜蛋白、鹽離子的去除， DNA吸附， DNA洗脫等步驟。所述肺泡灌洗液宏基因組的提取步驟如下：

（1）樣本液化及細(xì)胞破碎：拿到新鮮的灌洗液樣本后，加入10倍體積的1 mol/L的NaOH溶液，室溫下，靜置10 min；液化完全后，14000 r/min離心5 min，棄上清；加入1ml的去離子水重懸沉淀，并吸取溶液至新的2 ml離心管中；12000 r/min離心5 min，留沉淀待用；在離心管中加入提前于56℃水浴鍋中孵育10min的裂解緩沖液150 μl以及濃度為10 mg/ml并含有3 mmol/L的DTT的溶菌酶20 μl用槍頭吹打混勻；加入濃度為20mg/kg的蛋白酶K溶液40 μl，渦旋混勻30 sec后，56℃孵育10 min，期間每隔5 min 取出一次震蕩均勻；

（2）目的DNA的游離以及雜蛋白、鹽離子的去除：加入800 μl預(yù)熱至65 ℃的CTAB混合緩沖液；70 ℃孵育10 min,然后12000 rpm離心5 min，棄上清，留沉淀；加入300 μl的4 ℃預(yù)冷的無水乙醇和1/2體積的濃度為3 mol/L，pH=5.2的NaAc渦旋混勻30 sec；14000 rpm常溫下離心10min，棄上清，留沉淀；加入TE緩沖液300 μl懸浮DNA；

（3）DNA吸附：取懸浮的DNA于DNA吸附柱中，分別加入70%的pH=5.5的乙醇600 μl漂洗兩次；將吸附柱置于56 ℃下孵育5 min；

（4）DNA洗脫：往DNA吸附柱中加入成分為10 mmol/L的Tris-Cl、1 mmol/L的EDTA、pH=8.0的洗脫液液80 μl；室溫孵育3 min，14000 rpm離心5 min，洗脫得DNA溶液。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

其一，本發(fā)明直接取材于病變部位，獲得病原菌的機(jī)會多。本發(fā)明以肺泡灌洗液為樣本，區(qū)別于傳統(tǒng)以患者痰液為樣本的方法，樣本能夠全面涵蓋肺部的微生物菌群并獲得病原菌宏基因組信息；通過后期設(shè)計(jì)引物特異性擴(kuò)增細(xì)菌基因片段，又可排除人類基因組的干擾。因此提高了診斷的精確度。

其二，本發(fā)明對樣本進(jìn)行了液化處理，降低了樣本粘度，提高了DNA洗脫效率。相比于拿到樣本后直接處理的傳統(tǒng)方法，本發(fā)明對針對樣本設(shè)計(jì)了特異性的液化方案。因?yàn)楸緲颖救∽曰颊叩姆尾?，難以避免取材時溶液中含有病人的痰液等，而痰液在后續(xù)處理中難以完全除去；這給用DNA吸附柱洗脫DNA帶來了麻煩，因?yàn)檫@樣廢液會阻塞吸附柱，使DNA無法洗脫下來，滯留在柱子上，降低了提取到的DNA產(chǎn)量。本發(fā)明將樣本液化，降低了樣本的粘性，大大提高了洗脫效率。

其三，本發(fā)明使得樣本中細(xì)菌裂解更加充分。因?yàn)榉闻莨嘞匆褐形⑸锞悍N類的多樣性，有些細(xì)菌對溶菌酶不敏感，難以破壁；本發(fā)明在裂解細(xì)胞過程中在溶菌酶中添加DTT，增加了細(xì)菌對溶菌酶的敏感性，使其更加容易裂解。

此外，使用本發(fā)明所制得的DNA純度更高。本實(shí)驗(yàn)中使用的CTAB混合緩沖液（0.1%的β-巰基乙醇(v/v)，1.5 mol/L的NaCl,5%的PVP-40(v/v)，3%的CTAB（w/v）），能夠很好的去除肺泡灌洗液中腐殖質(zhì)和其他雜質(zhì)，提高后續(xù)DNA的純度。

附圖說明

圖1為不同灌洗液樣本基因組的16S rDNA的V3-V4區(qū)PCR擴(kuò)增電泳圖。其中M泳道為DNA Marker；G1-G7分別為不同灌洗液樣本基因組模板的PCR產(chǎn)物。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例

一種肺泡灌洗液宏基因組的提取方法，首先在臨床上取慢性阻塞性疾病患者支氣管肺泡灌洗液，然后提取其肺泡灌洗液中微生物宏基因組。具體的步驟包括：

（1）樣本液化及細(xì)胞破碎：拿到新鮮的灌洗液樣本后，加入10倍體積的1 mol/L的NaOH溶液，室溫下，靜置10 min；液化完全后，14000 r/min離心5 min，棄上清，留沉淀；加入1 ml的去離子水重懸沉淀，并吸取溶液至新的2 ml離心管中；12000-r/min離心5min，留沉淀待用；在離心管中加入提前于56 ℃水浴鍋中孵育10 min的裂解緩沖液150 μl以及濃度為10 mg/ml并含有3 mmol/L的DTT的溶菌酶20 μl用槍頭吹打重懸；加入濃度為20 mg/kg的蛋白酶K溶液40μl，渦旋混勻30 sec后，56 ℃ 孵育10 min，期間每隔5 min 取出一次震蕩均勻；

（2）目的DNA的游離以及雜蛋白、鹽離子的去除：加入800μl預(yù)熱至65℃的CTAB混合緩沖液；70℃ 孵育10 min，然后12000 rpm離心5 min，棄上清，留沉淀；加入300 μl的4℃預(yù)冷的無水乙醇和1/2體積的濃度為3 mol/L，pH=5.2的NaAc渦旋混勻30 sec；14000 rpm常溫下離心10 min，棄上清，留沉淀；加入TE緩沖液300 μl懸浮DNA；

（3）DNA吸附：取懸浮的DNA于DNA吸附柱中，分別加入70%的pH=5.5的乙醇600 μl漂洗兩次；將吸附柱置于56℃下孵育5 min；

（4）DNA洗脫：往DNA吸附柱中加入成分為10 mmol/L的Tris-Cl、1 mmol/L的EDTA、pH=8.0的洗脫液80 μl；室溫孵育3 min，14000 rpm離心5 min，洗脫得DNA溶液。

（5）將取得的DNA溶液，使用Nanodrop 2000進(jìn)行DNA含量的測定。

以本發(fā)明為試驗(yàn)組，普通提取方法為對照組，兩種方法提取肺泡灌洗液宏基因組的效果分別如表1所示。然后進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增16S rDNA V3-V4區(qū)，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，排除人類基因組的干擾，確定微生物總DNA的質(zhì)量。其中16S rDNA V3-V4引物為：

319F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'

806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'

表1 兩種方法提取肺泡灌洗液微生物宏基因組的效果對比

從表1可以看出按照本發(fā)明方法提取的DNA濃度高于常規(guī)方法提取所得基因組濃度，滿足測序、PCR反應(yīng)等分子生物學(xué)操作的濃度要求；其次，A260/280的比值均位于1.8-2.0范圍內(nèi)，說明本發(fā)明提取所得DNA純度高。因此說明本發(fā)明提高了樣品基因組提取率，提取肺泡灌洗液宏基因組效果十分理想。

以上述兩組基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得16S rRNA V3-V4片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果見圖1。圖1顯示試驗(yàn)組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一、長度符合預(yù)期值且條帶比對照組更為明亮，說明PCR過程特異性高、擴(kuò)增效果好，滿足后續(xù)分子生物學(xué)研究使用。試驗(yàn)組的PCR效果也更優(yōu)于對照組。該結(jié)果進(jìn)一步論證了本發(fā)明達(dá)到了理想的技術(shù)效果。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

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