本申請(qǐng)涉及微生物遺傳育種技術(shù)和生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于生產(chǎn)DHA(二十二碳六烯酸)的微藻的變異株或突變株。

背景技術(shù)：

DHA(二十二碳六烯酸，C22:6，ω-3)是一種必需脂肪酸，即人體不能自身合成且具有重要生理功能的長(zhǎng)鏈脂肪酸。DHA是人的大腦和視網(wǎng)膜的主要組成成分。總DHA中的20％存在于大腦皮層中，總DHA中的高達(dá)50％存在于視網(wǎng)膜中。因此，DHA對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和視覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育和維持正常智力和視力功能中起重要作用。DHA還在預(yù)防心血管疾病、癌癥、炎癥等中具有重要的生理功能。另外，DHA還是多種海水魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育所需的必需脂肪酸，并且可以提高魚(yú)苗的成活率以及降低白化病發(fā)病率。傳統(tǒng)上DHA從魚(yú)油中獲得，但從魚(yú)油中提取多不飽和脂肪酸(PUFA)存在一些問(wèn)題，例如產(chǎn)量不穩(wěn)定、得率低、成本高及存在其它ω-6PUFA的污染，且隨著漁業(yè)資源的日益緊張，傳統(tǒng)的DHA資源已無(wú)法滿(mǎn)足DHA日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。因此，開(kāi)發(fā)DHA的新資源已成為新的研究熱點(diǎn)。

裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)是一種海洋微藻(或真菌樣微生物)，其已經(jīng)開(kāi)發(fā)為生產(chǎn)DHA和其他多不飽和脂肪酸(PUFA)的商業(yè)資源。裂殖壺菌的生物安全性已被證實(shí)。Hammond等人在大鼠和兔子上對(duì)其進(jìn)行了一系列檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)副作用。

但是，在發(fā)酵過(guò)程中，裂殖壺菌難免發(fā)生菌株種質(zhì)退化，從而導(dǎo)致DHA產(chǎn)率下降。因此，繼續(xù)改進(jìn)菌株種質(zhì)(主要包括生長(zhǎng)速度，尤其是DHA含量)對(duì)于促進(jìn)裂殖壺菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展是重要的。

乙酰輔A羧化酶(ACC,EC6.4.1.2)是一種脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，而除草劑喹禾靈{2-[4-(6-氯-2-喹惡啉氧基)-苯氧基]丙酸乙酯}是該酶的抑制劑。在喹禾靈的存在下，細(xì)胞會(huì)因脂肪酸生物合成受阻而生長(zhǎng)緩慢甚至 死亡。

近年來(lái)，一些研究表明，喹禾靈能夠用于篩選誘變的微藻中EPA含量提高的株系。

Chaturvedi等(2004)用MNNG對(duì)微綠球藻(Nannochloropsis oculata)進(jìn)行誘變，再篩選抗喹禾靈的株系。從篩選得到的株系獲得的結(jié)果表明EPA含量顯著提高。

此外，Chaturvedi等(2006)用EMS對(duì)微綠球藻進(jìn)行誘變，再篩選抗淺藍(lán)菌素及紅霉素的株系。得到的株系的EPA產(chǎn)率分別提高了29％和12％。

Cao Xiaohong等(2007)用DMSO和喹禾靈處理硅藻平滑菱形藻(Nitzschia laevis)，導(dǎo)致藻的EPA含量從3.00％提高到3.58％。

到目前為止，還沒(méi)有報(bào)道抗喹禾靈的裂殖壺菌突變株。即使存在這樣的裂殖壺菌突變株，也不清楚經(jīng)喹禾靈篩選后的突變株的EPA或DHA的含量是否得到提高。此外，到目前為止，并不清楚經(jīng)紫外線輻射誘導(dǎo)的裂殖壺菌突變株是否能夠在喹禾靈篩選中存活。

發(fā)明概述

本申請(qǐng)的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)向裂殖壺菌實(shí)施紫外線輻射誘變、然后利用脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶(例如乙酰輔酶A羧化酶)的抑制劑(包括但不限于喹禾靈(Quizalofop))進(jìn)行定向篩選，能夠得到DHA含量增加的裂殖壺菌變異株或突變株。此外，與天然裂殖壺菌菌株相比，所獲得的變異株或突變株具有高DHA含量以及提高的生長(zhǎng)速度。

因此，第一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┊a(chǎn)生與天然裂殖壺菌菌株相比具有增加的DHA含量的裂殖壺菌變異株的方法，包括利用紫外線(UV)照射誘導(dǎo)裂殖壺菌突變從而產(chǎn)生突變株；使所述突變株與乙酰輔酶A羧化酶的抑制劑接觸；以及選擇與天然裂殖壺菌菌株相比具有增加的DHA含量的裂殖壺菌突變株。

在本文公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方案中，乙酰輔酶A羧化酶抑制劑是喹禾靈。在具體實(shí)施方案中，與天然裂殖壺菌菌株相比，所選擇到的DHA含量增加的變異株還具有加快的生長(zhǎng)速度，從而使得DHA的生產(chǎn)效率較天然裂 殖壺菌菌株得以提高。

在本文公開(kāi)的另一實(shí)施方案中，相比于裂殖壺菌突變株的起始菌株或天然裂殖壺菌菌株，所述裂殖壺菌突變株的DHA含量提高。通常，相比于經(jīng)過(guò)UV輻射誘導(dǎo)的誘變、進(jìn)行或不進(jìn)行乙酰輔酶A羧化酶抑制劑篩選的裂殖壺菌突變株的起始菌株或天然裂殖壺菌菌株，所述裂殖壺菌突變株的DHA含量提高。

在第二方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝阎硥鼐儺愔?，例如?011年1月21日保藏于位于中國(guó)武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)、保藏號(hào)為CCTCC M 2011024的裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)菌株2010-0321。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與天然裂殖壺菌菌株相比，本文提供的變異株具有增加的DHA含量。在另一實(shí)施方案中，本文提供的變異株是通過(guò)本文公開(kāi)的方法獲得的，該方法包括利用紫外線(UV)照射誘導(dǎo)裂殖壺菌突變從而產(chǎn)生突變株；使所述突變株與乙酰輔酶A羧化酶的抑制劑接觸；以及選擇與天然裂殖壺菌菌株相比具有增加的DHA含量和/或加快的生長(zhǎng)速度的裂殖壺菌變異株。

在第三方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┥a(chǎn)DHA的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本文公開(kāi)的裂殖壺菌變異株，以及任選地包括從培養(yǎng)的裂殖壺菌變異株或其培養(yǎng)基的生物質(zhì)中收集DHA。在一個(gè)實(shí)施方案中，還涉及由此方法產(chǎn)生的生物質(zhì)。

在另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┦称贰＞唧w而言，所述食品含有根據(jù)本文公開(kāi)的方法生產(chǎn)的生物質(zhì)(即，與天然裂殖壺菌菌株相比，具有增加的DHA濃度)或DHA。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示紫外線輻射對(duì)裂殖壺菌的致死作用。

圖2顯示喹禾靈濃度與裂殖壺菌的相應(yīng)致死率的關(guān)系。

圖3顯示對(duì)照菌株(或天然菌株)和一些變異株的生長(zhǎng)速度和DHA含量。

圖4顯示對(duì)照菌株和3個(gè)變異株在50L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中的生長(zhǎng)速度和DHA含量。

圖5顯示對(duì)照菌株與變異株2010-0321的18S rRNA序列的比對(duì)結(jié)果。

發(fā)明詳細(xì)描述

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“菌株”指從單一細(xì)胞或分離菌落獲得的微生物的任何培養(yǎng)物，通常為純的培養(yǎng)物，微生物例如是藻或微藻，包括裂殖壺菌。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)參照菌株X的“變異株”或“突變株”指從參照菌株X得到的任何菌株。在本申請(qǐng)的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“變異株”更特別地指主要通過(guò)對(duì)參照菌株X進(jìn)行突變和選擇而得到的菌株，而術(shù)語(yǔ)“突變株”更特別的指通過(guò)將隨機(jī)或定向誘變技術(shù)應(yīng)用于參照菌株X而得到的菌株。

一旦突變株或變異株具有本文公開(kāi)的各個(gè)方面的特征，尤其是與天然藻類(lèi)或微藻類(lèi)(特別是裂殖壺菌)相比具有更高的或增加的DHA含量時(shí)，其落入本申請(qǐng)請(qǐng)求保護(hù)的保護(hù)范圍中。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“食品”指用于向人類(lèi)或動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)的任何產(chǎn)品。具體而言，食品包括用于喂養(yǎng)嬰兒、兒童、青少年和成人的產(chǎn)品。本文公開(kāi)的食品的全部或部分可以含有通過(guò)本文公開(kāi)的方法獲得的至少一種生物質(zhì)或DHA。本文公開(kāi)的食品也可以含有通常用于農(nóng)業(yè)或食品工業(yè)的其他成分，如添加劑、防腐劑、果類(lèi)或果類(lèi)提取物、調(diào)味劑、著色劑、增稠劑、谷類(lèi)、巧克力等。

在具體的實(shí)施方案中，食品是乳制品。

本文所用術(shù)語(yǔ)“乳制品”，除了奶之外，還包括源自奶的任何產(chǎn)品，如奶粉、乳酪、冰淇淋、黃油、乳酪、酸奶、發(fā)酵奶；或源自奶的副產(chǎn)物，如抗乳血清和酪蛋白以及各種含有奶或奶組分作為主要成分的制備食品。奶通常來(lái)自奶牛，但是也可以來(lái)自其他哺乳動(dòng)物，如山羊、母綿羊、母馬、駱駝或水牛。這些乳制品合并了通過(guò)本文公開(kāi)的方法生產(chǎn)的DHA或生物質(zhì)。

適于作為本文公開(kāi)的突變/誘變和/或篩選的起始菌株或天然/對(duì)照菌株包括異養(yǎng)的微藻類(lèi)，包括裂殖壺菌屬的成員。裂殖壺菌屬的一個(gè)具體成員是Schizochytrium limacinum?？蓮脑S多公開(kāi)可利用的來(lái)源獲得合適的生物，包括通過(guò)從自然環(huán)境收集。例如，可用于本申請(qǐng)的裂殖壺菌的包括Schizochytrium limacinum SR21、裂殖壺菌(S8)(ATCC 20889)、裂殖 壺菌(LC-RM)(ATCC 18915)和Schizochytrium limacinum IFO 32693(Honda et Yokochi,日本大阪微生物研究所(Institute for Fermentation(IFO).Osaka,Japan)，優(yōu)選Schizochytrium limacinum SR21或Schizochytrium limacinum IFO 32693。

本文所用的任何微生物或生物體的任何具體類(lèi)型包括野生型菌株、突變株或重組株。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)”指藻類(lèi)或微藻類(lèi)(例如本文公開(kāi)的裂殖壺菌或裂殖壺菌變異株等)的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物或細(xì)胞?；蛘?，術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)”指至少部分脫水的藻類(lèi)或微藻類(lèi)培養(yǎng)物、或脫水的培養(yǎng)物。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“約”或“大致”，當(dāng)與數(shù)值一同使用時(shí)，指相比于參照數(shù)值變化1、5或10％以?xún)?nèi)的任何數(shù)值。

本文所用的動(dòng)詞“包含”及其變形詞以非限制性含義使用，表示后面的事項(xiàng)是包括在內(nèi)的，但是并不排除其他未具體提到的事項(xiàng)。

此外，使用不定冠詞“a”或“an”描述元件時(shí)，并不排除存在多個(gè)元件的可能性，除非上下文明確指示或暗示相反的情況。因此，不定冠詞“a”或“an”表示“至少一個(gè)”。

在裂殖壺菌突變的實(shí)施方案中，將裂殖壺菌菌株暴露于紫外線輻射約10秒-140秒(S)，優(yōu)選約20秒-120秒，更優(yōu)選約30秒至100秒，最優(yōu)選約70秒至90秒。在具體實(shí)施方案中，將裂殖壺菌菌株暴露于紫外線輻射的時(shí)間選自約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和90秒。收集活存的菌落并用于乙酰輔酶A羧化酶抑制劑(例如喹禾靈)的定向篩選。

在一個(gè)實(shí)施方案中，將喹禾靈以一定濃度加入到培養(yǎng)基中來(lái)篩選喹禾靈抗性株。在篩選中使用的培養(yǎng)基中喹禾靈的濃度為約5μmol/L至約100μmol/L，或約10μmol/L至90μmol/L，或約50μmol/L至80μmol/L。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中喹禾靈的濃度選自約51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79和80μmol/L培養(yǎng)基。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，喹禾靈的分子式為喹禾靈-p{(R)-2-[4-(6-氯-2-喹噁啉)氧基]苯氧基]丙烯酸酯}，例如精喹禾靈(Quizalofop ethyl)。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，喹禾靈抗性裂殖壺菌菌落的篩選在含有喹禾靈的固體培養(yǎng)基中實(shí)施，然后從該固體培養(yǎng)基中挑選存活的菌落，并將其進(jìn)一步培養(yǎng)在含有喹禾靈的液體或半固體培養(yǎng)基中，以驗(yàn)證該菌落具有喹禾靈抗性。

按照與天然菌株(例如裂殖壺菌菌株)相比具有加快的生長(zhǎng)速度和增高的DHA含量，進(jìn)一步篩選所選擇的抗喹禾靈的菌落。

由此，通過(guò)包括UV暴露和喹禾靈篩選的本文公開(kāi)的方法獲得的裂殖壺菌變異株與天然裂殖壺菌菌株或起始裂殖壺菌菌株相比，可以產(chǎn)生的DHA的量較高或增加。在具體實(shí)施方案中，在3-7天或5天的培養(yǎng)物或生物質(zhì)中，裂殖壺菌變異株產(chǎn)生DHA的量高于天然菌株或起始菌株至少約10、20、25、30、35、40％，或至少約20、25、30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70％。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于裂殖壺菌變異株的生物質(zhì)干重，裂殖壺菌變異株產(chǎn)生DHA的量為至少1.0％(w/w)，2.0％(w/w)，3.0％(w/w)，3.5％(w/w)，4.0％(w/w)，4.5％(w/w)，5.0％(w/w)，5.5％(w/w)，6.0％(w/w)或6.5％(w/w)。

在另一實(shí)施方案中，優(yōu)選在3-7天的培養(yǎng)、更優(yōu)選在5天的培養(yǎng)中，所篩選的裂殖壺菌變異株的生長(zhǎng)速度高于天然菌株或起始菌株至少約3、4、5、6、7、8、9、10％。

在本申請(qǐng)的其他實(shí)施方案中，與天然菌株或起始菌株相比，所篩選的裂殖壺菌變異株在不同的培養(yǎng)條件下(例如不同的葡萄糖濃度、不同的氮源以及不同的pH值)具有穩(wěn)定的生長(zhǎng)速度和大量產(chǎn)生DHA的能力。

在任選的實(shí)施方案中，可以對(duì)裂殖壺菌變異株的18S RNA進(jìn)行分析，以鑒定相對(duì)于天然菌株或起始菌株的遺傳變異。

在一個(gè)實(shí)施方案中，裂殖壺菌變異株的例子包括但不限于菌株321-1、2010-0321和303-11，特別是菌株2010-0321。

在一個(gè)實(shí)施方案中，為了生產(chǎn)具有較大量DHA的生物質(zhì)，將本文公開(kāi)的裂殖壺菌變異株在適合裂殖壺菌培養(yǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，特別是選自菌株321-1、2010-0321、303-11的菌株，或它們的任意組合，或者菌株2010-0321。

在本文公開(kāi)的實(shí)施方案中，培養(yǎng)條件可由本領(lǐng)域公知的培養(yǎng)方法來(lái)制定，包括在美國(guó)專(zhuān)利5,130,242和美國(guó)專(zhuān)利7,022,512公開(kāi)的方法(將其全部以引用的方式并入本文)，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定最佳培養(yǎng)條件。在其它實(shí)施方案中，可以在任何適合的發(fā)酵罐(例如提供氧來(lái)源的攪拌釜發(fā)酵罐或氣升式發(fā)酵罐)中進(jìn)行培養(yǎng)。可以以一定的水平攪拌微生物，使得溶解氧的濃度足夠支持培養(yǎng)物生長(zhǎng)和DHA產(chǎn)生，同時(shí)，攪拌不剪切或以其它方式損害微生物。溶解氧的合適的水平為至少10％的空氣飽和水平。更特別地，將溶解氧水平保持在大約10％至約50％的空氣飽和水平。本文公開(kāi)的方法中所用的示例性的發(fā)酵罐可以提供1VVM通氣比率，轉(zhuǎn)速為70-100rpm。

在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵罐的容量為至少10至60升，例如10、20、30、40、50或60升。也可以使用容量高至100或150升的發(fā)酵罐。

可以在任何適于維持微生物存活的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。具體而言，可在約15℃至約34℃溫度下培養(yǎng)微生物。優(yōu)選地，將培養(yǎng)溫度保持在約20℃至約28℃，更優(yōu)選約22℃至約27℃。

在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵過(guò)程中的培養(yǎng)基的pH可以為4-10，例如5-8，優(yōu)選6-7。

通常，發(fā)酵持續(xù)10天或更少，或9天或更少，或8天或更少。在一些實(shí)施方案中，發(fā)酵持續(xù)時(shí)間可以是4、5、6或7天或至少4、5、6或7天。

任選地，發(fā)酵持續(xù)時(shí)間可以為150-200小時(shí)，例如，160-190小時(shí)，或170-180小時(shí)。

在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的培養(yǎng)裂殖壺菌變異株的方法中使用的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，其可以包含在商業(yè)操作規(guī)模上能促進(jìn)生長(zhǎng)和DHA產(chǎn)生的組分，包括美國(guó)專(zhuān)利5,130,242和美國(guó)專(zhuān)利7,022,512中列出的組分，通過(guò)引用的方式將上述文獻(xiàn)整體并入本文。

具體而言，本文公開(kāi)的用于培養(yǎng)裂殖壺菌變異株以生產(chǎn)DHA的培養(yǎng)基包含碳源和有機(jī)或無(wú)機(jī)氮源。

在一實(shí)施方案中，碳源包括葡萄糖、各種淀粉、糖蜜、粉碎的玉米或其組合。在一實(shí)施方案中，氮源可以包括但不限于硝酸鹽、尿素、銨鹽、氨基酸、酵母浸膏等。培養(yǎng)基中還可以提供可同化的磷源(例如，磷酸鹽)和/或硫源(例如，硫酸鹽)。

培養(yǎng)基還可以含有其它的輔助發(fā)酵的物質(zhì)，例如螯合劑(例如檸檬酸)，抗發(fā)泡劑(例如大豆油)，維生素(例如硫胺和/或核黃素)，以及必需的催化金屬(例如堿土金屬，例如鎂或鈣，或鋅或鐵和/或諸如銅和鈷的其他金屬)。

在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還可以含有微生物生長(zhǎng)因子，其是未規(guī)定的或規(guī)定的能增強(qiáng)單細(xì)胞微生物的異養(yǎng)生長(zhǎng)的化合物。

用于培養(yǎng)裂殖壺菌的示例性培養(yǎng)基可以參見(jiàn)Jiang and Chen,Process Biochemistry 35(2000)1205-1209；Jiang and Chen,Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,(1999)Vol.23,508-513；Vazhappilly and Chen,Journal of the American Oil Chemists Society,(1998)Vol.75,No.3p393-397。

作為一個(gè)例子，本文公開(kāi)的方法中使用的培養(yǎng)基包含：葡萄糖40-60g/L；酵母浸膏10-15g/L；谷氨酸4-8g/L；氯化鈉2.4-4.0g/L；硫酸鎂3.0-6.0g/L；硫酸銨3.0-6.0g/L。在一實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法中使用的培養(yǎng)基由以下組成：葡萄糖40-60g/L；酵母浸膏10-15g/L；谷氨酸鈉4-8g/L；氯化鈉2.4-4.0g/L；硫酸鎂3.0-6.0g/L；以及硫酸銨3.0-6.0g/L。本文中使用的培養(yǎng)基的一個(gè)實(shí)例由以下組成：葡萄糖60g/L；酵母浸膏15g/L；谷氨酸鈉4g/L；氯化鈉3g/L；硫酸鎂5g/L；以及硫酸銨5g/L。

可以通過(guò)例如離心、絮凝或過(guò)濾的手段來(lái)收獲生物體或生物質(zhì)，并可立即處理或干燥用于以后處理。任選地，可以提取脂質(zhì)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)”包括磷脂、游離脂肪酸、脂肪酸的酯、三酰甘油、二?；视王?、單?；视王?、溶血磷脂、脂肪酸鹽、磷脂、固醇和固醇酯、類(lèi)胡蘿卡素、葉黃素(例如，氧合類(lèi)胡蘿素)、碳?xì)浠衔铩⒁约氨绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其他脂質(zhì)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解的，本文公開(kāi)的DHA可為這些不同脂質(zhì)的形式，并且不限于游離的脂肪酸，其可以是本文公開(kāi)的食品中的形式。根據(jù)使用的提取技術(shù)，可提取脂質(zhì)的不同 形式或組分。

可用有效量的溶劑提取脂質(zhì)。在提取中所用的合適的溶劑中，通常用極性溶劑(例如，氯仿/甲醇)提取極性脂質(zhì)(例如，磷脂)，通常用非極性溶劑(例如，己烷)提取中性脂質(zhì)(例如，三酰甘油)。具體的溶劑可以為純己烷。己烷與干生物質(zhì)的合適的比例為大約4升己烷/千克干生物質(zhì)。在具體實(shí)施方案中，將己烷與生物質(zhì)在攪拌反應(yīng)容器中、在大約50℃的溫度下、混合大約2小時(shí)?；旌虾?，將生物質(zhì)過(guò)濾并與含油的己烷分離。通過(guò)蒸餾技術(shù)從油中移除己烷。常規(guī)的含油種子加工設(shè)備適合用于實(shí)施過(guò)濾、分離和蒸餾。如果需要或適合于具體應(yīng)用，可進(jìn)行額外的加工步驟。脂質(zhì)回收的可選方法描述在下列文獻(xiàn)中，將這些文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文：發(fā)明名稱(chēng)為“Method for the Fractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Materials”的PCT國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)WO01/76715；發(fā)明名稱(chēng)為“Method For The Fractionation Of Oil And Polar Lipid-Containing Native Raw Materials Using Alcohol And Centrifugation”的PCT國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)WO 01/76385；發(fā)明名稱(chēng)為“Solventless Extraction Process”的PCT國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)WO 00/153512。

雖然利用具體的生物和方法描述了本申請(qǐng)，但是意圖包括根據(jù)本文的教導(dǎo)可獲得的所有生物和方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)的情況下，能夠任何替換、修改和優(yōu)化。而且，本文所涉及的諸如步驟、條件以及菌株等要素可根據(jù)需要任意組合，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。

提供以下實(shí)施例僅僅出于示例性說(shuō)明的目的，并不意圖限制所要求保護(hù)的主題的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1紫外線輻射對(duì)裂殖壺菌的突變作用

Schizochytrium limacinum SR21在以下實(shí)施例中被用作對(duì)照或天然菌株。將Schizochytrium limacinum SR21接種于培養(yǎng)皿上，分別暴露于紫外線輻射0秒(對(duì)照)、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、90秒和100秒(實(shí)驗(yàn)組)。輻射后，將培養(yǎng)皿避光放置24h，對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿上的 菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)照組的菌落數(shù)定義為100％，相應(yīng)地計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的致死率(圖1)。從圖1可以看出，隨著輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，裂殖壺菌的致死率隨之增高，顯示出劑量依賴(lài)效應(yīng)。具體地，選用70秒-90秒的輻射時(shí)間(裂殖壺菌的致死率為60％-80％)在裂殖壺菌中進(jìn)行誘變。

所用培養(yǎng)條件為：

A培養(yǎng)基組成如下：

葡萄糖55g/L

酵母浸膏10g/L

谷氨酸鈉5g/L

氯化鈉2.4g/L

硫酸鎂4.0g/L

硫酸銨4.0g/L

余量為水。

B培養(yǎng)溫度：22-27℃；以及

C初始pH：5.0-7.0。

實(shí)施例2對(duì)裂殖壺菌的喹禾靈篩選

在裂殖壺菌培養(yǎng)基中加入精喹禾靈，添加濃度分別為0μmol/L、10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L、70μmol/L、80μmol/L和90μmol/L。將對(duì)照組(0μmol/L)的菌落數(shù)定義為100％。對(duì)各組菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，基于對(duì)照組中的菌落數(shù)計(jì)算致死率(圖2)。從圖2可以看出，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，裂殖壺菌的致死率與喹禾靈的濃度呈正相關(guān)關(guān)系。選用50μmol/L到80μmol/L的喹禾靈濃度進(jìn)行抗性菌株篩選。

為方便操作，在培養(yǎng)基中添加喹禾靈，接種在紫外線輻射中存活的菌株以進(jìn)行進(jìn)一步定向篩選。

所篩選出的菌株可在含有喹禾靈的液體或半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以確認(rèn)其具有喹禾靈抗性。

培養(yǎng)條件為：

A培養(yǎng)基組成如下：

葡萄糖60g/L

酵母浸膏15g/L

谷氨酸鈉4g/L

氯化鈉3g/L

硫酸鎂5.0g/L

硫酸銨5.0g/L

余量為水。

B培養(yǎng)溫度：22-27℃；以及

C初始pH：5.0-7.0。

實(shí)施例3天然菌株和變異株在生長(zhǎng)速度和DHA含量上的差異

按照實(shí)施例2篩選和確認(rèn)后，獲得超過(guò)200株喹禾靈抗性裂殖壺菌菌株。然后，以生長(zhǎng)速度加快和DHA含量提高為指標(biāo)，進(jìn)一步對(duì)這些喹禾靈抗性裂殖壺菌菌株篩選兩輪。第一輪后篩選出20-50株，第二輪后篩選出3株。篩選出的三個(gè)菌株中的每一個(gè)在生長(zhǎng)速度和DHA含量上都高與對(duì)照(天然)菌株大于10％。

所用培養(yǎng)條件為：

A培養(yǎng)基組成如下：

葡萄糖60g/L

酵母浸膏15g/L

谷氨酸鈉4g/L

氯化鈉3g/L

硫酸鎂5.0g/L

硫酸銨5.0g/L

余量為水。

B培養(yǎng)溫度：22-27℃；以及

C初始pH：5.0-7.0。

圖3顯示出對(duì)照菌株(最左側(cè))和經(jīng)過(guò)紫外輻射誘變和隨后的喹禾靈篩選的部分變異株的生物質(zhì)和DHA含量。從圖3中看出，某些突變株在生長(zhǎng)速度和DHA含量上都低于對(duì)照菌株，如321-6、321-7和321-8；某些突變株在生長(zhǎng)速度和DHA含量上與對(duì)照菌株無(wú)顯著差異，如321-4、321-5、321-19。在多個(gè)突變株中，DHA含量提高，如321-1、2010-0321、321-12、321-13、321-14、321-15、321-16、321-17和321-18。321-1和2010-0321表現(xiàn)突出，比對(duì)照菌株的生長(zhǎng)速度分別提高了10.5％和31.5％，DHA含量分別提高了64.5％和66.4％。

除這兩個(gè)突變株之外，突變株303-11也表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)速度和DHA含量。

挑選321-1、2010-0321和303-11這3個(gè)變異株進(jìn)行實(shí)施例4-7中的測(cè)試，以驗(yàn)證通過(guò)本申請(qǐng)的方法獲得的變異株具有DHA含量高、生長(zhǎng)速度快的性質(zhì)，并能夠在不同的培養(yǎng)條件下穩(wěn)定保持上述性質(zhì)。

實(shí)施例4-7的實(shí)驗(yàn)中所用的通用培養(yǎng)條件為：

A培養(yǎng)基組成如下：

葡萄糖60g/L

酵母浸膏15g/L

谷氨酸鈉4g/L

氯化鈉3g/L

硫酸鎂5.0g/L

硫酸銨5.0g/L

余量為水。

B培養(yǎng)溫度：22-27℃；以及

C初始pH：5.0-7.0。

D50L發(fā)酵罐，通氣比率為1VVM，轉(zhuǎn)速為70～100RPM，

E培養(yǎng)周期4-7天。

實(shí)施例4對(duì)照菌株與321-1、2010-0321及303-11在不同葡萄糖濃度下培養(yǎng)的生長(zhǎng)速度和DHA含量

除了葡萄糖濃度之外，培養(yǎng)條件與上文所述的通用培養(yǎng)條件相同。

為了比較對(duì)照(天然)菌株和突變菌株321-1、2010-0321和303-11對(duì)不同培養(yǎng)條件的反應(yīng)并進(jìn)一步證實(shí)篩選出的菌株超過(guò)對(duì)照菌株的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行了一系列測(cè)試和比較。在本實(shí)施例中，比較了在不同碳源濃度下培養(yǎng)的對(duì)照菌株和突變菌株的生長(zhǎng)速度和DHA含量，其中用不同測(cè)試濃度 的碳源替換原始培養(yǎng)基中的碳源。從表1可以看出，在不同的葡萄糖濃度(50g/L、60g/L和70g/L)條件下，3個(gè)突變株中觀察到的結(jié)果優(yōu)于對(duì)照菌株，其中結(jié)果最好的是2010-0321，其次是321-1和303-11。

表1對(duì)照菌株和3個(gè)突變菌株在不同葡萄糖濃度條件下的生長(zhǎng)速度和DHA含量

g/L.d：每天每升培養(yǎng)基的生物質(zhì)重量。

w/w％：DHA重量占干細(xì)胞重量的百分比。

實(shí)施例5對(duì)照菌株與菌株321-1、2010-0321及303-11在不同氮源培養(yǎng)下的生長(zhǎng)速度和DHA含量

除了氮源之外，培養(yǎng)條件與上文所述的通用培養(yǎng)條件相同。

進(jìn)行本實(shí)施例是為了比較在不同氮源培養(yǎng)下對(duì)照(天然)菌株和突變菌株321-1、2010-0321和303-11的生長(zhǎng)速度和DHA含量。利用以下氮源替換原始培養(yǎng)基中的氮源：(a)酵母浸膏(20g/L)、(b)酵母浸膏(20g/L)+谷氨酸鈉(10g/L)、(c)酵母浸膏(40g/L)+谷氨酸鈉(10g/L)、以及(d)玉米漿(40g/L)+谷氨酸鈉(10g/L)。如表2所示，當(dāng)在不同氮源下培養(yǎng)時(shí)，突變菌株321-1和2010-0321在生長(zhǎng)速度和DHA含量都優(yōu)于對(duì)照菌株，其中菌株2010-0321在DHA含量方面優(yōu)于321-1，而303-11僅在DHA含量方面高于對(duì)照菌株。

表2對(duì)照菌株和3個(gè)突變菌株在不同氮源下培養(yǎng)的生長(zhǎng)速度

g/L.d：每天每升培養(yǎng)基的生物質(zhì)重量。

w/w％：DHA重量占干細(xì)胞重量的百分比。

實(shí)施例6對(duì)照菌株與菌株321-1、2010-0321及303-11在不同pH值下培養(yǎng)的生長(zhǎng)速度與DHA含量

除了pH值之外，培養(yǎng)條件與上文所述的通用培養(yǎng)條件相同。

進(jìn)行本實(shí)施例是為了評(píng)價(jià)對(duì)照(天然)菌株與3個(gè)突變菌株在不同pH值(表3)下培養(yǎng)的生長(zhǎng)速度和DHA含量。如表3所示，菌株321-1和2010-0321的生長(zhǎng)速度和DHA積累高于對(duì)照菌株；與對(duì)照菌株相比，突變菌株303-11在生長(zhǎng)速度上沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，在DHA積累上表現(xiàn)出微弱優(yōu)勢(shì)。

表3對(duì)照菌株和3個(gè)突變菌株在不同pH條件下的生長(zhǎng)速度

g/L.d：每天每升培養(yǎng)基的生物質(zhì)重量。

w/w％：DHA重量占干細(xì)胞重量的百分比。

實(shí)施例7對(duì)照菌株與菌株321-1、2010-0321及303-11在50升發(fā)酵罐中培養(yǎng)的生長(zhǎng)速度與DHA含量

進(jìn)行本實(shí)施例是為了評(píng)價(jià)對(duì)照(天然)菌株和菌株321-1、2010-0321及303-11在50L發(fā)酵罐培養(yǎng)中的生長(zhǎng)速度和DHA積累(圖4)。在上文所述的通用培養(yǎng)條件下培養(yǎng)菌株。與對(duì)照菌株相比，菌株321-1表現(xiàn)出生物 質(zhì)提高了9.5％，DHA含量提高了16.7％；菌株2010-0321表現(xiàn)出生物質(zhì)提高了6.7％，DHA含量提高了48.1％；菌株303-11表現(xiàn)出生物質(zhì)與對(duì)照菌株基本相同，DHA含量?jī)H提高了7.9％。

綜合比較，在3個(gè)突變菌株中，表現(xiàn)最突出的是2010-0321，尤其是在DHA含量方面。

實(shí)施例8對(duì)照菌株與菌株2010-0321在生物化學(xué)組成上的差異

表4和表5顯示了對(duì)照(天然)菌株與菌株2010-0321在生物化學(xué)組成上的差異，包括蛋白質(zhì)、氨基酸和脂肪酸組成的差異。蛋白質(zhì)含量用凱氏定氮法測(cè)定。用氨基酸分析儀分析氨基酸含量。用脂質(zhì)分析儀分析脂肪含量。

從表4看出，菌株2010-0321的蛋白含量(23.8％)高于對(duì)照菌株(22.3％)。與此相符的是，菌株2010-0321在大多數(shù)氨基酸的含量也高于對(duì)照菌株。

從表5看出，菌株2010-0321與對(duì)照菌株在脂肪酸組成上具有顯著差異。首先，菌株2010-0321的C16:0含量(8.2％)高于對(duì)照菌株(7.7％)；其次，菌株2010-0321中缺失C16:1，而對(duì)照菌株C16:1的含量為1.0％；第三，菌株2010-0321的DHA(C22:6)含量顯著高于對(duì)照菌株。

表4對(duì)照菌株和菌株2010-0321在蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成上的差異

表5對(duì)照菌株和菌株2010-0321在脂肪酸組成上的差異(w/w％，基于生物質(zhì)干重)

實(shí)施例9對(duì)照菌株與菌株2010-0321 18S rRNA基因序列比對(duì)

通過(guò)裂解法提取測(cè)試菌株的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用正向引物5’-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3’(SEQ ID NO:3)和反向引物：5’-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3’(SEQ ID NO:4)擴(kuò)增18S RNA?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，并使用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞。選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。用Blast軟件對(duì)對(duì)照(天然)菌株和菌株2010-0321的18S RNA的序列進(jìn)行比對(duì)和比較。結(jié)果顯示于圖5。

圖5顯示了對(duì)照菌株與菌株2010-0321的18S rRNA基因的用于同源性比較的比對(duì)。如圖所示，對(duì)照菌株的18S rRNA基因(SEQ ID NO:1)長(zhǎng)度為1757bp，而菌株2010-0321的18S rRNA基因(SEQ ID NO:2)長(zhǎng)度為1751bp，其中9個(gè)堿基對(duì)發(fā)生了變異。對(duì)照菌株與菌株2010-0321的18S rRNA基因的同源性百分比為99％。