本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶分離提純方法。

背景技術(shù)：

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG酶)是由331個氨基組成的分子量約38000的具有活性中心的單體蛋白質(zhì)，其可催化蛋白質(zhì)多肽發(fā)生分子內(nèi)和分子間發(fā)生共價交聯(lián)，從而改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，對蛋白質(zhì)的性質(zhì)如：發(fā)泡性，乳化性，乳化穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性、保水性和凝膠能力等效果顯著，進(jìn)而改善食品的風(fēng)味、口感、質(zhì)地和外觀等。傳統(tǒng)肉類加工工藝通常加入大量的鹽和磷酸，以提高其持水力、連貫性和質(zhì)地。近期，少鹽少磷酸的食物被廣泛推廣，但其質(zhì)地和物理性質(zhì)都不盡如人意。TG酶可以替代部分通常肉制品加工中添加的品質(zhì)改良劑—磷酸鹽，生產(chǎn)低鹽肉制品?？蓱?yīng)用于水產(chǎn)加工品、火腿、香腸、面類、豆腐等等。TG酶在40～45℃、pH6-7的條件下，只需添加0.1-0.3％的量，即可達(dá)到明顯的效果。

枯草芽胞桿菌，是芽胞桿菌屬的一種。單個細(xì)胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌。可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，對此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機(jī)制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶分離提純方法，通過對枯草芽孢桿菌微波誘變育種產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，并對發(fā)酵階段的的枯草芽孢桿菌進(jìn)行超聲處理，有效提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶效率。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶分離提純方法，包括如下具體步驟：

S1、無菌環(huán)境下，用接種環(huán)將保藏的枯草芽孢桿菌涂布于NA斜面培養(yǎng)基中，32℃恒溫培養(yǎng)48h，得到活化后的枯草芽孢桿菌；

S2、將S1中的NA斜面培養(yǎng)基離心棄上清液，將得到的菌體用pH7.0磷酸緩沖溶液洗滌2-3次，將菌體溶解于pH7.0磷酸緩沖溶液中配制菌懸液；

S3、將S2中制得的菌懸液5mL均勻涂布于培養(yǎng)皿底部進(jìn)行微波處理，將微波處理后的菌體分散于生理鹽水中配置菌懸液；

S4、將S3中配置的菌懸液接種于種子培養(yǎng)基中，于32℃水浴搖床內(nèi)，以170r/min培養(yǎng)24h；

S5、將S4中培養(yǎng)后的菌體以5％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間24h；

將發(fā)酵培養(yǎng)基置于超聲水浴中超聲處理10-15min，水浴溫度為35℃，超聲功率為280-350w；

將超聲處理的發(fā)酵培養(yǎng)基置于35℃水浴搖床中，以150-180r/min培養(yǎng)48h，得到發(fā)酵培養(yǎng)液；

S6、將S5中的發(fā)酵培養(yǎng)液離心，將離心后的料液通過微濾膜過濾收集酶液，其中微濾膜為0.2μm膜，微濾溫度為35℃，操作壓差為0.18MPa；

S7、將S6中收集的酶液冷凍干燥后得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。

進(jìn)一步地，S1中所述NA斜面培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其組成為：牛肉膏3g/L、蛋白胨5-10g/L、瓊脂12.5-14g/L、葡萄糖22-24g/L，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4。

進(jìn)一步地，所述S2中離心速率為3000-4000r/min，離心時間為10min。

進(jìn)一步地，S2中所述菌懸液中菌體濃度為1×10⁸個/mL

進(jìn)一步地，所述S3中微波處理條件為微波功率為700-950W，脈沖頻率為2450MHz，處理時間為45s。

進(jìn)一步地，S4所述種子培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10-12g/L、酵母粉5.5-6g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄ 4.5-5.5g/L、KH₂PO₄ 4.5-5.5g/L，用0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2。

進(jìn)一步地，S5中所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20-22g/L、氯化銨3.5g/L、尿素18-20g/L、NaCl 4-5g/L、MgSO₄ 2g/L、KH₂PO₄ 2g/L，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

進(jìn)一步地，所述S6中離心速率為1500-2100r/min，離心時間為5min。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明通過對枯草芽孢桿菌微波誘變育種產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，并對發(fā)酵階段的的枯草芽孢桿菌進(jìn)行超聲處理，低強(qiáng)度的超聲輻射可以降低發(fā)酵液中二氧化碳的溶解度，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，有效提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶效率。

當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點。

具體實施方式

本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實施例1

S1、無菌環(huán)境下，用接種環(huán)將保藏的枯草芽孢桿菌涂布于NA斜面培養(yǎng)基中，32℃恒溫培養(yǎng)48h，得到活化后的枯草芽孢桿菌；

所述NA斜面培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其組成為：牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、瓊脂12.5g/L、葡萄糖22g/L，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.2；

本實施例中，枯草芽孢桿菌保藏編號為CGMCC 1.3358；

S2、將S1中的NA斜面培養(yǎng)基以3000r/min離心10min棄上清液，將得到的菌體用pH7.0磷酸緩沖溶液洗滌2次，將菌體溶解于pH7.0磷酸緩沖溶液中配制菌懸液，其中菌體濃度為1×10⁸個/mL；

S3、將S2中制得的菌懸液5mL均勻涂布于培養(yǎng)皿底部進(jìn)行微波處理，其中培養(yǎng)皿直徑為6cm，微波功率為700W，脈沖頻率為2450MHz，微波處理時間為45s；

將微波處理后的菌體分散于生理鹽水中配置菌懸液，菌體濃度為1×10⁸個/mL；

S4、將S3中配置的菌懸液接種于種子培養(yǎng)基中，于32℃水浴搖床內(nèi)，以170r/min培養(yǎng)24h；

所述種子培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10g/L、酵母粉5.5g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄ 4.5g/L、KH₂PO₄ 4.5g/L，用0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0；

S5、將S4中培養(yǎng)后的菌體以5％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間24h；

將發(fā)酵培養(yǎng)基置于超聲水浴中超聲處理10min，水浴溫度為35℃，超聲功率為280w；

將超聲處理的發(fā)酵培養(yǎng)基置于35℃水浴搖床中，以150r/min培養(yǎng)48h，得到發(fā)酵培養(yǎng)液；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g/L、氯化銨3.5g/L、尿素18g/L、NaCl 4g/L、MgSO₄ 2g/L、KH₂PO₄ 2g/L，用0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0；

S6、將S5中的發(fā)酵培養(yǎng)液以1500r/min離心5min，將離心后的料液通過微濾膜過濾收集酶液，其中微濾膜為0.2μm膜，微濾溫度為35℃，操作壓差為0.18MPa；

S7、將S6中收集的酶液冷凍干燥后得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。

實施例2

S1、無菌環(huán)境下，用接種環(huán)將保藏的枯草芽孢桿菌涂布于NA斜面培養(yǎng)基中，32℃恒溫培養(yǎng)48h，得到活化后的枯草芽孢桿菌；

所述NA斜面培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其組成為：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、瓊脂14g/L、葡萄糖24g/L，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.4；

本實施例中，枯草芽孢桿菌保藏編號為CGMCC 1.3358；

S2、將S1中的NA斜面培養(yǎng)基以4000r/min離心10min棄上清液，將得到的菌體用pH7.0磷酸緩沖溶液洗滌3次，將菌體溶解于pH7.0磷酸緩沖溶液中配制菌懸液，其中菌體濃度為1×10⁸個/mL；

S3、將S2中制得的菌懸液5mL均勻涂布于培養(yǎng)皿底部進(jìn)行微波處理，其中培養(yǎng)皿直徑為8cm，微波功率為950W，脈沖頻率為2450MHz，微波處理時間為45s；

將微波處理后的菌體分散于生理鹽水中配置菌懸液，菌體濃度為1×10⁸個/mL；

S4、將S3中配置的菌懸液接種于種子培養(yǎng)基中，于32℃水浴搖床內(nèi)，以170r/min培養(yǎng)24h；

所述種子培養(yǎng)基組成為：蛋白12g/L、酵母粉6g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄ 5.5g/L、KH₂PO₄ 5.5g/L，用0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0；

S5、將S4中培養(yǎng)后的菌體以5％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間24h；

將發(fā)酵培養(yǎng)基置于超聲水浴中超聲處理15min，水浴溫度為35℃，超聲功率為350w；

將超聲處理的發(fā)酵培養(yǎng)基置于35℃水浴搖床中，以180r/min培養(yǎng)48h，得到發(fā)酵培養(yǎng)液；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖22g/L、氯化銨3.5g/L、尿素20g/L、NaCl 5g/L、MgSO₄ 2g/L、KH₂PO₄ 2g/L，用0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0；

S6、將S5中的發(fā)酵培養(yǎng)液以2100r/min離心5min，將離心后的料液通過微濾膜過濾收集酶液，其中微濾膜為0.2μm膜，微濾溫度為35℃，操作壓差為0.18MPa；

S7、將S6中收集的酶液冷凍干燥后得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。

實施例3

S1、無菌環(huán)境下，用接種環(huán)將保藏的枯草芽孢桿菌涂布于NA斜面培養(yǎng)基中，32℃恒溫培養(yǎng)48h，得到活化后的枯草芽孢桿菌；

所述NA斜面培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其組成為：牛肉膏3g/L、蛋白胨7g/L、瓊脂13g/L、葡萄糖21g/L，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.3；

本實施例中，枯草芽孢桿菌保藏編號為CGMCC 1.3358；

S2、將S1中的NA斜面培養(yǎng)基以3500r/min離心10min棄上清液，將得到的菌體用pH7.0磷酸緩沖溶液洗滌2次，將菌體溶解于pH7.0磷酸緩沖溶液中配制菌懸液，其中菌體濃度為1×10⁸個/mL；

S3、將S2中制得的菌懸液5mL均勻涂布于培養(yǎng)皿底部進(jìn)行微波處理，其中培養(yǎng)皿直徑為7cm，微波功率為800W，脈沖頻率為2450MHz，微波處理時間為45s；

將微波處理后的菌體分散于生理鹽水中配置菌懸液，菌體濃度為1×10⁸個/mL；

S4、將S3中配置的菌懸液接種于種子培養(yǎng)基中，于32℃水浴搖床內(nèi)，以170r/min培養(yǎng)24h；

所述種子培養(yǎng)基組成為：蛋白胨11g/L、酵母粉5.7g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄ 5g/L、KH₂PO₄ 5g/L，用0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0；

S5、將S4中培養(yǎng)后的菌體以5％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間24h；

將發(fā)酵培養(yǎng)基置于超聲水浴中超聲處理13min，水浴溫度為35℃，超聲功率為320w；

將超聲處理的發(fā)酵培養(yǎng)基置于35℃水浴搖床中，以165r/min培養(yǎng)48h，得到發(fā)酵培養(yǎng)液；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖21g/L、氯化銨3.5g/L、尿素19g/L、NaCl 4.5g/L、MgSO₄ 2g/L、KH₂PO₄ 2g/L，用0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0；

S6、將S5中的發(fā)酵培養(yǎng)液以1800r/min離心5min，將離心后的料液通過微濾膜過濾收集酶液，其中微濾膜為0.2μm膜，微濾溫度為35℃，操作壓差為0.18MPa；

S7、將S6中收集的酶液冷凍干燥后得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。

本發(fā)明通過對枯草芽孢桿菌微波誘變育種產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，并對發(fā)酵階段的的枯草芽孢桿菌進(jìn)行超聲處理，低強(qiáng)度的超聲輻射可以降低發(fā)酵液中二氧化碳的溶解度，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，有效提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶效率。

以上內(nèi)容僅僅是對本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。