本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，涉及一種鈣依賴(lài)型蛋白激酶CPK32及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在植物生命周期中，需要經(jīng)歷三次生長(zhǎng)發(fā)育的重要轉(zhuǎn)變。種子萌發(fā)是植物由胚胎發(fā)育到胚后期發(fā)育轉(zhuǎn)變的重要標(biāo)志；第二個(gè)重要的轉(zhuǎn)變是種子萌發(fā)后由幼苗營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)到成熟的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)的變化，此時(shí)植物可以感受并響應(yīng)各種成花誘導(dǎo)信號(hào)；第三個(gè)重要的轉(zhuǎn)變即是成花誘導(dǎo)這一由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)變。開(kāi)花是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的重要轉(zhuǎn)變，是植物發(fā)育成熟的標(biāo)志。成花誘導(dǎo)的成功與否直接關(guān)系到其后代的延續(xù)，其對(duì)于種子的形成也至關(guān)重要。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用上，作物適時(shí)的開(kāi)花對(duì)于引種、育種、穩(wěn)產(chǎn)和增產(chǎn)都有重要的意義。植物的成花誘導(dǎo)受到精細(xì)而復(fù)雜的調(diào)控，以確保植物在適宜的條件下開(kāi)花、結(jié)實(shí)。Ca2+作為重要的第二信使廣泛參與植物對(duì)多種生物和非生物脅迫的響應(yīng)，例如低溫、干旱、鹽脅迫、滲透脅迫、機(jī)械刺激以及病原菌侵染等。鈣在植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著十分重要的作用，如胚胎發(fā)育、種子成熟、種子萌發(fā)及細(xì)胞的極性生長(zhǎng)等方面。在高等生物中，鈣依賴(lài)型蛋白激酶作為植物所特有的鈣感受器蛋白，介導(dǎo)植物體內(nèi)多種鈣信號(hào)傳遞，將外界生物及非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入植物體內(nèi)，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)及多種逆境信號(hào)的傳遞過(guò)程。作為重要的鈣感受器蛋白，CDPK參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、營(yíng)養(yǎng)代謝、病原菌防御反應(yīng)及對(duì)各種生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程。FLC是植物體內(nèi)重要的開(kāi)花抑制因子，是植物開(kāi)花時(shí)間調(diào)控的關(guān)鍵基因，其通過(guò)抑制開(kāi)花促進(jìn)因子基因的表達(dá)發(fā)揮作用。FLC主要在植物的根尖、莖尖等分裂活躍的組織中表達(dá)，其表達(dá)量與對(duì)開(kāi)花的抑制程度呈正相關(guān)。目前，鈣信號(hào)以及鈣依賴(lài)型蛋白激酶介導(dǎo)的磷酸化修飾作用在植物成花誘導(dǎo)過(guò)程中的作用機(jī)制研究還鮮有報(bào)道，因此研究鈣依賴(lài)型蛋白激酶對(duì)植物開(kāi)花時(shí)間的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于調(diào)節(jié)花期、提高結(jié)實(shí)率進(jìn)而調(diào)節(jié)農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要的理論意義和研究?jī)r(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種鈣依賴(lài)型蛋白激酶CPK32及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的鈣依賴(lài)型蛋白激酶CPK32來(lái)自擬南芥，該蛋白包含：(a)由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白；或(b)將SEQIDNO.1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加由SEQIDNO.1衍生的且保持SEQIDNO.1所示的蛋白功能使得植物具有調(diào)節(jié)開(kāi)花時(shí)間的功能蛋白。為了使(a)中的CPK32蛋白便于純化和檢測(cè)，可在由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列FLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-Myc10EQKLISEEDL上述(b)中的CPK32蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的CPK32蛋白的編碼基因可通過(guò)將SEQIDNO.2所示的多核苷酸序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。本發(fā)明提供了編碼所述CPK32蛋白的基因(CPK32基因)。其核苷酸序列為：i)SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO.2所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或iii)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO.2所示序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白的核苷酸序列，所述嚴(yán)格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。本發(fā)明提供了含有所述CPK32基因的生物材料。所述生物材料為重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、重組菌或宿主細(xì)胞?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有CPK32基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。使用CPK32基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用CPK32基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以開(kāi)花時(shí)間為表型篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體具體可為在Super1300載體的多克隆位點(diǎn)插入所述CPK32基因得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體更具體可為將Super1300載體XbaⅠ和SacⅠ之間的小片段取代為序列表的SEQIDNO.2所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)所述CPK32蛋白的應(yīng)用，為如下至少一種：調(diào)控植物的開(kāi)花時(shí)間；或調(diào)控植物抽薹時(shí)的葉片數(shù)；或調(diào)控植物體內(nèi)FLC基因的表達(dá)。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了CPK32蛋白或其編碼基因或含有該編碼基因的生物材料在調(diào)控植物開(kāi)花時(shí)間中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了CPK32蛋白或其編碼基因或含有該編碼基因的生物材料在促進(jìn)植物開(kāi)花時(shí)間提前中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了CPK32蛋白或其編碼基因或含有該編碼基因的生物材料在調(diào)控植物抽薹時(shí)的葉片數(shù)目中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，本發(fā)明CPK32蛋白或其編碼基因或含有該編碼基因的生物材料在減少植物抽薹時(shí)的葉片數(shù)目中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了CPK32蛋白或其編碼基因或含有該編碼基因的生物材料在調(diào)控植物中FLC的表達(dá)量中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了CPK32蛋白或其編碼基因或含有該編碼基因的生物材料在降低植物中FLC的表達(dá)量中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了CPK32蛋白或其編碼基因或含有該編碼基因的生物材料在調(diào)節(jié)植物開(kāi)花表型中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了CPK32蛋白或其編碼基因或含有該編碼基因的生物材料在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了CPK32蛋白或其編碼基因或含有該編碼基因的生物材料在植物種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥，例如擬南芥cpk32突變株。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述CPK32基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物滿足如下至少一種表型：調(diào)節(jié)所述目的植物的開(kāi)花時(shí)間；或調(diào)節(jié)所述目的植物抽薹時(shí)的葉片數(shù)目；或調(diào)節(jié)所述目的植物中FLC的表達(dá)量。攜帶有所述CPK32基因的重組表達(dá)載體可通過(guò)Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥，例如擬南芥cpk32突變株。本發(fā)明提供了一種用于克隆擬南芥CPK32蛋白編碼基因開(kāi)放閱讀框的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQIDNO.5-6所示。本發(fā)明還提供了一種用于克隆擬南芥CPK32基因組的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQIDNO.7-8所示。所述擬南芥CPK32基因組的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本發(fā)明中，通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了將CPK32基因?qū)肽康闹参镏泻竽軌蛘{(diào)節(jié)目的植物的開(kāi)花時(shí)間、調(diào)節(jié)抽薹時(shí)的葉片數(shù)目或調(diào)節(jié)目的植物中FLC的表達(dá)量。本發(fā)明的鈣依賴(lài)型蛋白激酶CPK32對(duì)于改良作物的開(kāi)花時(shí)間具有重要調(diào)節(jié)作用，在作物的種質(zhì)資源改良中具有較大應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1A為長(zhǎng)日照光周期條件下野生型Col-0、cpk32突變體擬南芥及株系1、株系2和株系3表型觀察。MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)7天的幼苗，移栽到營(yíng)養(yǎng)土中長(zhǎng)日照光周期條件下繼續(xù)培養(yǎng)，材料抽薹后照相記錄。圖1B為長(zhǎng)日照光周期條件下，萌發(fā)40天后，野生型Col-0、cpk32突變體及株系1、株系2和株系3抽薹時(shí)的葉片數(shù)統(tǒng)計(jì)。MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)7天的幼苗，移栽到營(yíng)養(yǎng)土中長(zhǎng)日照光周期條件下繼續(xù)培養(yǎng)，材料抽薹后統(tǒng)計(jì)總?cè)~片數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)值顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，t檢驗(yàn)，n＝100，**P<0.01。圖1C為短日照光周期條件下野生型Col-0、cpk32突變體及株系1、株系2和株系3表型觀察。MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)7天的幼苗，移栽到營(yíng)養(yǎng)土中短日照光周期(SD：8小時(shí)光照/16小時(shí)黑暗)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，材料抽薹后照相記錄。圖1D為短日照光周期條件下，萌發(fā)120天后，野生型Col-0、cpk32突變體及株系1、株系2和株系3抽薹時(shí)的葉片數(shù)統(tǒng)計(jì)。MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)7天的幼苗，移栽到營(yíng)養(yǎng)土中短日照光周期條件下繼續(xù)培養(yǎng)，材料抽薹后統(tǒng)計(jì)總?cè)~片數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)值顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，t檢驗(yàn)，n＝30，**P<0.01。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的擬南芥cpk32突變體及其恢復(fù)突變材料株系1、株系2和株系3的經(jīng)過(guò)GA處理及其對(duì)照處理?xiàng)l件下抽薹時(shí)的葉片數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)7天的幼苗，移栽到營(yíng)養(yǎng)土中長(zhǎng)日照光周期條件下繼續(xù)培養(yǎng)，噴施100μM的GA直至材料開(kāi)花，材料抽薹后統(tǒng)計(jì)總?cè)~片數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)值顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，t檢驗(yàn)，n＝100，**P<0.01。圖3長(zhǎng)日照光周期條件下，野生型Col-0、cpk32突變體及株系1、株系2和株系3春化處理前后抽薹時(shí)的總?cè)~片數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)7天的幼苗，轉(zhuǎn)移到4℃培養(yǎng)4-6周后，移栽到營(yíng)養(yǎng)土中長(zhǎng)日照光周期條件下繼續(xù)培養(yǎng)，材料抽薹后統(tǒng)計(jì)總?cè)~片數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)值顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，t檢驗(yàn)，n＝100，**P<0.01。圖4本發(fā)明實(shí)施例3的Northernblot分析野生型Col-0、cpk32突變體及株系1、株系2和株系3中FLC基因的表達(dá)水平。長(zhǎng)日照條件下MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7天的幼苗提取總RNA。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。以下實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。Super1300載體：購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司，貨號(hào)為addgene0595。農(nóng)桿菌菌株GV3101：CloughSJ,BentAF(1998)Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.16:735-743。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，用Col-0表示。從ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)購(gòu)買(mǎi)編號(hào)為SALK_112665的T-DNA插入突變體(插入位置位于CPK32基因的啟動(dòng)子上)，將其命名為擬南芥cpk32突變株。經(jīng)測(cè)序，擬南芥cpk32突變株為純合突變株，T-DNA插入在起始密碼子ATG前第368位，造成CPK32在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均顯著低于Col-0。MS液體培養(yǎng)基(pH5.8)：每升含1650mgNH4NO3，1900mgKNO3，370mgMgSO4·7H2O，170mgKH2PO4，440mgCaCl2·2H2O，22.3mgMnSO4·4H2O，0.83mgKI，0.025mgCuSO4·5H2O，6.25mgH3BO5，0.025mgCoCl·6H2O，8.65mgZnSO4·7H2O，0.25mgNa2MoO4·2H2O，27.8mgFeSO4·7H2O和37.3mgNa2-EDTA，用電阻大于18MΩ的去離子水定容至1L。MS固體培養(yǎng)基：在MS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，每升加入30g蔗糖、8g瓊脂粉。實(shí)施例1CPK32蛋白及其編碼基因和基因組核酸序列的克隆(1)CPK32蛋白編碼基因的克隆Trizol(Invitrogen)法提取擬南芥長(zhǎng)日照光周期生長(zhǎng)室(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)培養(yǎng)7天的幼苗(100-200mg)總RNA，經(jīng)甲醛變性RNA瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。按照SUPERSCRIPTII的使用說(shuō)明合成單鏈cDNA。將合成的單鏈cDNA稀釋10倍并作為模板DNA，采用Primer1和Primer2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)。Primer1：5'-gctctagaATGGGTAATTGTTGCG-3'；(SEQIDNO.5)Primer2：5'-cgagctcTCATCTTGTATCACCA-3'(SEQIDNO.6)。PCR體系(50μL)：5μL10×Ex-taqPCRBuffer，4μL2.5mMdNTPmix，2.5μLPrimer1(10μM)，2.5μLPrimer2(10μM)，1μL模板DNA，1.5μLDMSO，0.5μLEx-taqDNAPolymerase(2U/μL)。PCR程序：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘45秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘，10℃保存PCR產(chǎn)物?；厥占s1617bp的PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體，依次進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物中具有SEQIDNO.2所示的開(kāi)放閱讀框，編碼SEQIDNO.1所示的蛋白質(zhì)，重組載體命名為pMD18-T-CPK32-CDS。將序列表中的SEQIDNO.1所示蛋白命名為CPK32蛋白。將編碼CPK32蛋白的基因命名為CPK32基因，其開(kāi)放閱讀框如SEQIDNO.2所示。(2)CPK32蛋白基因組核酸序列的克隆CTAB法提取擬南芥長(zhǎng)日照光周期生長(zhǎng)室(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)培養(yǎng)7天的幼苗DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的完整性。以基因組DNA為模板，采用Primer3和Primer4組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)。Primer3：5'-ggatccGTATTTCAGGAATGGAATTTCGAACCCACTAA-3'；(SEQIDNO.7)Primer4：5'-gtcgacTCATCTTGTATCACCATTGACCTGCAACGA-3'(SEQIDNO.8)。PCR體系(50μL)：5μL5×PhusionPCRBuffer，4μL2.5mMdNTPmix，2.5μLPrimer1(10μM)，2.5μLPrimer2(10μM)，1μL模板DNA，1.5μLDMSO，0.5μLPhusionDNAPolymerase(2U/μL)。PCR程序：98℃預(yù)變性3分鐘；98℃20秒，60℃20秒，72℃2分鐘30秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5秒，10℃保存PCR產(chǎn)物?；厥占s4300bp的PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體，依次進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物中具有如SEQIDNO.3所示CPK32基因組核酸序列，其轉(zhuǎn)錄后經(jīng)剪切加工編碼SEQIDNO.2所示開(kāi)放閱讀框及SEQIDNO.1所示蛋白氨基酸序列，重組載體命名為pMD18-T-CPK32-GENOME。實(shí)施例2CPK32蛋白的功能驗(yàn)證一、構(gòu)建重組質(zhì)粒1、以pMD18-T-CPK32-GENOME質(zhì)粒DNA分子為模板，采用Primer3和Primer4組成的引物對(duì)(SEQIDNO.7-8所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收約4300bp的DNA片段。2、用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ雙酶切步驟1得到的DNA片段，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ雙酶切pCAMBIA1300載體(該質(zhì)粒又稱(chēng)植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-AT，GENBANKACCESSIONNO.FJ362601，VERSIONFJ362601.1，GI:213876770)，回收約10000bp左右的載體骨架。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒甲。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒甲進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將pCAMBIA1300載體BamHⅠ和SalⅠ之間的小片段取代為序列表中的SEQIDNO.3所示的雙鏈DNA分子。5、以pMD18-T-CPK32-CDS質(zhì)粒DNA分子為模板，采用Primer1和Primer2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收約1617bp的DNA片段。Primer1：5'-gctctagaATGGGTAATTGTTGCG-3'；Primer2：5'-cgagctcTCATCTTGTATCACCA-3'。6、用限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ雙酶切步驟5得到的DNA片段，回收酶切產(chǎn)物。7、用限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ雙酶切Super1300載體，回收約10000bp左右的載體骨架。8、將步驟6的酶切產(chǎn)物和步驟7的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒乙。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒乙進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將Super1300載體XbaⅠ和SacⅠ之間的小片段取代為序列表的SEQIDNO.2所示的多核苷酸分子。二、培育轉(zhuǎn)基因植物1、將重組質(zhì)粒甲導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101，得到重組農(nóng)桿菌。2、采用花芽浸泡法(CloughandBent,Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJournal1998,16:735-743)，用步驟1得到的重組農(nóng)桿菌侵染擬南芥cpk32突變株，收獲T1代種子。T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株，T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株。在含50μg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基平板上篩選T1代植株并進(jìn)行T2代和T3代的分離比統(tǒng)計(jì)，在T3代得到轉(zhuǎn)CPK32基因擬南芥單拷貝純合株系，隨機(jī)取三個(gè)株系，命名為株系1、株系2和株系3。三、表型檢測(cè)待測(cè)植物分別為：株系1的T3代植株、株系2的T3代植株、株系3的T3代植株、擬南芥cpk32突變株和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥Col-0。開(kāi)花時(shí)間表型觀察：取適量干燥的擬南芥種子于1.5mL的離心管中，加入1mL消毒液(0.5％NaClO+0.01％TritonX-100)，輕彈離心管使種子與消毒液充分接觸，翻轉(zhuǎn)混勻消毒10-15分鐘，吸出消毒液，用無(wú)菌水反復(fù)漂洗3-5次，充分洗掉殘留的消毒液，懸浮于無(wú)菌水。4℃低溫處理3-4天后，用槍頭將種子點(diǎn)播于固體培養(yǎng)基上；放入22℃光照培養(yǎng)箱/生長(zhǎng)室中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為80-120μmol·m-2·s-1。一周后，幼苗移栽入蛭石:營(yíng)養(yǎng)土為1:1的盆土中，于生長(zhǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：22±1℃；光周期：16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，相對(duì)濕度60％，光照強(qiáng)度為80-120μmol·m-2·s-1。植物材料每周澆一次水。(1)光周期處理移栽到土中的野生型和突變體幼苗放置于溫室中，分別在長(zhǎng)日照(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)和短日照(8小時(shí)光照/16小時(shí)黑暗)條件下生長(zhǎng)，抽薹后統(tǒng)計(jì)蓮座葉和莖生葉的總?cè)~片數(shù)目。(2)春化處理移栽到土中的野生型和突變體幼苗分別在4℃弱光條件下處理至少6周，然后移到長(zhǎng)日照條件下繼續(xù)生長(zhǎng)，抽薹后統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)目。(3)GA處理野生型及突變體幼苗生長(zhǎng)在長(zhǎng)日照條件下，從長(zhǎng)出真葉開(kāi)始每周?chē)娛?00μM的GA三次，對(duì)照噴施相應(yīng)的乙醇溶液(100mM的GA3母液用50％的乙醇配制)，抽薹后統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)目。表型觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不論是在長(zhǎng)日照還是在短日照光周期條件下，與野生型擬南芥相比，cpk32突變體擬南芥均表現(xiàn)出晚花表型，且抽薹時(shí)的葉片數(shù)目顯著多于野生型擬南芥材料，在長(zhǎng)日照和短日照光周期條件下，cpk32突變體抽薹時(shí)的總?cè)~片數(shù)目分別是野生型對(duì)照材料的134％和137％。株系1、株系2和株系3無(wú)論是在開(kāi)花時(shí)間還是抽薹時(shí)的葉片數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果均能夠恢復(fù)到野生型擬南芥的水平。短日照條件下，cpk32突變體擬南芥的開(kāi)花時(shí)間顯著晚于在長(zhǎng)日照光周期條件下，而且抽薹時(shí)的葉片數(shù)也顯著多于長(zhǎng)日照條件下。這就說(shuō)明cpk32突變體擬南芥能夠正常地感受和傳遞光周期信號(hào)，因此CPK32不是通過(guò)光周期途徑參與對(duì)擬南芥開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控(見(jiàn)圖1A-圖1D)。進(jìn)一步說(shuō)明CPK32能夠促進(jìn)開(kāi)花時(shí)間提前，減少抽薹時(shí)葉片數(shù)數(shù)目。春化處理后擬南芥cpk32突變體抽薹時(shí)的葉片數(shù)目顯著少于對(duì)照處理材料(春化處理為對(duì)照處理的76％)，Col-0和擬南芥cpk32突變體的恢復(fù)突變材料株系1、株系2和株系3抽薹時(shí)的葉片數(shù)也少于對(duì)照處理材料。擬南芥cpk32突變體抽薹時(shí)的葉片數(shù)仍然多于野生型擬南芥，說(shuō)明擬南芥cpk32突變體能夠正常地響應(yīng)春化處理，CPK32是通過(guò)春化途徑之外的其它途徑參與擬南芥開(kāi)花時(shí)間調(diào)控(見(jiàn)圖2)。GA處理能顯著促進(jìn)擬南芥cpk32突變體開(kāi)花，擬南芥cpk32突變體抽薹時(shí)的葉片數(shù)目顯著少于對(duì)照處理(GA處理為對(duì)照處理的79％)，而且GA處理之后擬南芥cpk32突變體抽薹時(shí)的葉片數(shù)仍然多于野生型擬南芥對(duì)照材料，說(shuō)明CPK32基因的突變并不影響該突變體對(duì)GA的響應(yīng)，CPK32是通過(guò)GA途徑之外的其它途徑參與擬南芥開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控(見(jiàn)圖3)。實(shí)施例3FLC表達(dá)量檢測(cè)待測(cè)植物分別為：株系1的T3代植株、株系2的T3代植株、株系3的T3代植株、擬南芥cpk32突變株和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥Col-0。實(shí)驗(yàn)材料在長(zhǎng)日照光周期(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)生長(zhǎng)7天后，Trizol法提取總RNA。(1)甲醛變性膠1.2％瓊脂糖膠于1×MOPS(MOPS0.2M，NaAc(2)樣品準(zhǔn)備：取15-20μgRNA到1.5mLRNase-free離心管中，加DEPC水至20μL，加20μL樣品緩沖液，在65℃加熱5分鐘后，冰上冷卻，加3μLLoadingbuffer，混勻。(3)把膠放入電泳槽中，用1×MOPS溶液把膠覆蓋，預(yù)電泳15分鐘。(4)點(diǎn)樣，100-120V(5V/cm)，電泳2-2.5小時(shí)。(5)電泳期間，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜所需溶液(10×SSC，1.5MNaCl，0.15Msodiumcitrate)，1條17×25cm的濾紙條，大量吸水紙。毛細(xì)管吸印轉(zhuǎn)移(1)電泳完畢，將凝膠在10×SSC溶液中清洗一遍，去除凝膠上沒(méi)有點(diǎn)樣的部分，并在左上角切去一小角以作為凝膠定位的標(biāo)記。(2)在搪瓷盤(pán)內(nèi)加入10×SSC溶液，用一塊玻璃板作為平臺(tái)，在其上平鋪一張17×25cm的濾紙條，完全濕透后，用玻璃棒趕走濾紙和玻璃板之間的氣泡。(3)裁剪一張和凝膠大小相同的帶正電的Hybond-N+尼龍膜，然后將Hybond-N+膜浸入10×SSC溶液中至少10分鐘。(4)將凝膠倒扣在平臺(tái)的濾紙中央，用玻璃棒趕走凝膠和濾紙之間的氣泡。(5)用parafilm在凝膠四周?chē)蝗Γ源俗鳛槠琳?，阻止轉(zhuǎn)膜液直接流至膠上方的吸水紙中。然后將尼龍膜置于凝膠上，趕走氣泡。(6)在尼龍膜上放3-4張浸濕的濾紙，在其上放置一疊5-8cm厚的吸水紙，然后在上面放置400g重物。(7)前期，每30分鐘更換浸透的吸水紙，重復(fù)3次。(8)RNA轉(zhuǎn)移24小時(shí)，中間更換浸透的吸水紙2-3次。(9)轉(zhuǎn)膜完畢，取出尼龍膜紫外交聯(lián)2分鐘，使RNA固定于(10)將膜于真空干燥儀中，80℃處理2小時(shí)。標(biāo)記探針探針模板的準(zhǔn)備Trizol(Invitrogen)法提取擬南芥長(zhǎng)日照光周期生長(zhǎng)室(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)培養(yǎng)7天的幼苗(100-200mg)的總RNA，經(jīng)甲醛變性RNA瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。按照SUPERSCRIPTII的使用說(shuō)明合成單鏈cDNA。將合成的單鏈cDNA稀釋10倍并作為模板DNA，采用Primer5和Primer6組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增SEQIDNO.4。Primer5：5'-ATGGGAAGAAAAAAACTAGA-3'；(SEQIDNO.9)Primer6：5'-CTAATTAAGTAGTGGGAGAGT-3'(SEQIDNO.10)。PCR體系(50μL)：5μL10×Ex-taqPCRBuffer，4μL2.5mMdNTPmix，2.5μLPrimer1(10μM)，2.5μLPrimer2(10μM)，1μL模板DNA，1.5μLDMSO，0.5μLEx-taqDNAPolymerase(2U/μL)。PCR程序：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘45秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘，10℃保存PCR產(chǎn)物?；厥占s591bp的PCR產(chǎn)物。(1)將25ngDNA模板稀釋于45μLTE緩沖液中。(2)DNA樣品在95-100℃沸水浴中變性5分鐘，迅速置于冰上冷卻5分鐘。(3)將變性后的DNA模板加入到AmershamRediprimeIIDNALabeling反應(yīng)管中，并加入5μL[α-32P]dCTP，充分混勻，37℃反應(yīng)30分鐘。(4)使用前在95-100℃加熱5分鐘后，置于冰上待用。雜交預(yù)雜交：將膜的反面貼緊雜交瓶，加入10mL雜交液(BSA1％(w/v)，EDTA1mM，Phosphatebuffer0.5M，SDS7％(w/v))，65℃預(yù)雜交至少1小時(shí)。(1)換新的雜交液，加入標(biāo)記好的變性探針，42℃雜交12-16小時(shí)。洗膜(1)倒掉雜交液，用2×SSC溶液輕輕清洗一次。(2)用1/4體積的預(yù)熱的2×SSC溶液(0.1％SDS)65℃洗膜兩次，每次5分鐘。(3)用1/4體積的預(yù)熱的1×SSC溶液(0.1％SDS)65℃洗膜兩次，每次10分鐘。(4)用1/4體積的預(yù)熱的0.1×SSC溶液(0.1％SDS)65℃洗膜四次，每次5分鐘。(5)用保鮮膜將尼龍膜包好，壓X光片或磷屏。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與野生型擬南芥材料Col-0相比，擬南芥cpk32突變體中FLC的表達(dá)量明顯升高，其恢復(fù)突變材料株系1、株系2和株系3中FLC的表達(dá)量與野生型材料較為接近，這與表型觀察結(jié)果相互對(duì)應(yīng)，較為一致。說(shuō)明本發(fā)明CPK32蛋白具有降低FLC表達(dá)量的功能。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3