本發(fā)明屬于生物化工和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酯酶EstC10及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

酯酶廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中，是一類(lèi)催化水解或形成酯鍵的酶，作用的底物通常是脂肪鏈小于十個(gè)碳原子的酯類(lèi)。酯酶屬于α/β折疊水解酶超家族，催化中心一般由絲氨酸、天冬氨酸/谷氨酸和組氨酸組成，保守序列為絲氨酸附近的五肽(GXSXG)序列。酯酶能催化水解、酯化、轉(zhuǎn)酯化等多種化學(xué)反應(yīng)，是一種很重要的工業(yè)生物催化劑，被廣泛運(yùn)用于精細(xì)化工、洗滌、醫(yī)藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、廢水處理和飼料工業(yè)等領(lǐng)域。從催化特性來(lái)看，酯酶具有高度的化學(xué)選擇性和立體異構(gòu)選擇性，且反應(yīng)不需要輔酶、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少。在生產(chǎn)應(yīng)用中的酯酶的另一顯著特點(diǎn)是它能在異相系統(tǒng)(即油-水界面)或有機(jī)相中作用。在水相中，酯酶通常催化水解反應(yīng)，而在有機(jī)相中，它卻能催化酯化和轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。通過(guò)微生物酯酶的生物轉(zhuǎn)化制備新型藥物中間體或者去除藥物消旋體的非有效成分，是一種重要的手性技術(shù)，有著非常廣闊的應(yīng)用前景，它可以為合成手性藥物提供新的平臺(tái)，為大量制備光學(xué)純化合物提供新的方法。酶法選擇性拆分消旋體化合物，具有立體專(zhuān)一性高，副反應(yīng)少，產(chǎn)率高，產(chǎn)物光學(xué)純度好以及反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，所以是一種被廣泛認(rèn)可的拆分方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新的酯酶EstC10及其編碼基因和應(yīng)用。

本發(fā)明從一株嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01中開(kāi)發(fā)得到一種酯酶EstC10及其編碼基因EstC10，構(gòu)建了含有酯酶基因EstC10的重組表達(dá)載體和基因工程菌，培養(yǎng)基因工程菌后獲得酯酶EstC10，其可應(yīng)用于拆分(±)-2-氯丙酸甲酯、(±)-乳酸甲酯。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種酯酶EstC10，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種編碼所述的酯酶EstC10的酯酶基因EstC10。

所述的酯酶基因EstC10的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供一種含有所述的酯酶基因EstC10的重組表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體，優(yōu)選pET-28α(+)載體。

本發(fā)明還提供一種含有所述的酯酶基因EstC10的基因工程菌。所述的基因工程菌，優(yōu)選大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述的酯酶EstC10在催化酯類(lèi)水解、酯化和/或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)中的應(yīng)用。

優(yōu)選，所述的應(yīng)用為酯酶EstC10在拆分(±)-2-氯丙酸甲酯制備得到R-2-氯丙酸甲酯中的應(yīng)用。

優(yōu)選，所述的應(yīng)用為酯酶EstC10在拆分(±)-乳酸甲酯制備得到D-乳酸甲酯中的應(yīng)用。

本發(fā)明的酯酶基因EstC10來(lái)自嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01，保存在中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所。本發(fā)明利用生物信息學(xué)分析方法，分析得到一個(gè)酯酶基因EstC10。通過(guò)PCR的方法，從上述嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01基因組中克隆得到酯酶基因EstC10，全長(zhǎng)為747bp(從起始密碼子到終止密碼子)，編碼248個(gè)氨基酸。將酯酶基因EstC10與表達(dá)載體pET-28α(+)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)后，得到了重組酯酶EstC10。酯酶EstC10能催化酯類(lèi)水解、酯化和/或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，酯酶EstC10作為催化劑拆分(±)-2-氯丙酸甲酯，可制備得到R-2-氯丙酸甲酯；酯酶EstC10作為催化劑拆分(±)-乳酸甲酯，可制備得到D-乳酸甲酯。

附圖說(shuō)明

圖1是酯酶EstC10的SDS-PAGE電泳；M為蛋白marker，泳道1為誘導(dǎo)前總蛋白對(duì)照，泳道2為IPTG誘導(dǎo)后含重組酯酶基因EstC10的E.coli BL21(DE3)蛋白上清，泳道3為IPTG誘導(dǎo)后含重組酯酶基因EstC10的E.coli BL21(DE3)總蛋白，泳道4為純化的酯酶EstC10。

圖2是酯酶EstC10對(duì)不同側(cè)鏈長(zhǎng)度?；膶?duì)硝基苯酚酯的特異性。

圖3是pH對(duì)酯酶EstC10活性的影響。

圖4是不同pH對(duì)酯酶EstC10的穩(wěn)定性影響。

圖5是溫度對(duì)酯酶EstC10活性的影響。

圖6是不同溫度對(duì)酯酶EstC10穩(wěn)定性的影響。

圖7是在酯酶EstC10作用下(±)-2-氯丙酸甲酯e.e._s和Y隨底物濃度的變化曲線(xiàn)。

圖8是在酯酶EstC10作用下(±)-2-氯丙酸甲酯e.e._s和Y隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線(xiàn)。

圖9是(±)-2-氯丙酸甲酯氣相色譜圖，S表示S-2-氯丙酸甲酯，R表示R-2-氯丙酸甲酯。

圖10是最適反應(yīng)條件下酯酶EstC10對(duì)(±)-2-氯丙酸甲酯的選擇性水解氣相色譜圖，R表示R-2-氯丙酸甲酯。

圖11是在酯酶EstC10作用下(±)-乳酸甲酯e.e._s和Y隨底物濃度的變化曲線(xiàn)。

圖12是在酯酶EstC10作用下(±)-乳酸甲酯e.e._s和Y隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線(xiàn)。

圖13是(±)-乳酸甲酯氣相色譜圖，D表示D-乳酸甲酯，L表示L-乳酸甲酯。

圖14是最適反應(yīng)條件下酯酶EstC10對(duì)(±)-乳酸甲酯的選擇性水解氣相色譜圖，D表示D-乳酸甲酯。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

本發(fā)明的酯酶基因EstC10來(lái)源于基因組測(cè)序的嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01，該菌保存在中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)施例1：酯酶基因EstC10開(kāi)放閱讀框邊界確定及引物設(shè)計(jì)

提取嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01的基因組DNA，經(jīng)全基因組測(cè)序后，利用生物信息學(xué)手段對(duì)基因組進(jìn)行基因注釋?zhuān)治銎渲械孽ッ富颍_定了其中酯酶基因EstC10的開(kāi)放閱讀框，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，全長(zhǎng)為747bp(從起始密碼子到終止密碼子)，其編碼的酯酶EstC10的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共248個(gè)氨基酸。根據(jù)分析得到的酯酶基因序列，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物如下：上游引物：5′-CATGGATCCATGAAAATCGTCAAACCA-3′(下劃線(xiàn)為BamH I酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-CATCTCGAGTTATGTCTGCCAATCCAG-3′(下劃線(xiàn)為Xho I酶切位點(diǎn))。

實(shí)施例2：酯酶基因EstC10的克隆及載體構(gòu)建

2.1PCR擴(kuò)增

將實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物(上游引物：5′-CATGGATCCATGAAAATCGTCAAACCA-3′；下游引物：5′-CATCTCGAGTTATGTCTGCCAATCCAG-3′)送至上海生物工程有限公司合成，合成的引物使用TE緩沖液溶解成終濃度為10μM，以提取的嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01總DNA作為DNA模板，建立如表1所示反應(yīng)體系：

表1PCR反應(yīng)體系

使用以下PCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增酯酶基因EstC10：94℃變性5min；94℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸2min，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，冷卻到18℃。

將PCR產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠中，120V電壓下電泳20min，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，回收747bp左右的條帶。PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒的方法進(jìn)行回收，使用30μL無(wú)菌水洗脫，得到純化回收的PCR產(chǎn)物。

2.2酶切

PCR產(chǎn)物使用以下體系進(jìn)行酶切，酶切時(shí)間1.5h。酶切體系為：BamH I 2μL，Xho I 2μL，DNA<0.3μg，滅菌的雙蒸水加至40μL。酶切后按照膠回收試劑盒方法回收經(jīng)過(guò)雙酶切的PCR產(chǎn)物。

質(zhì)粒pET-28α(+)的雙酶切：挑取含有質(zhì)粒pET-28α(+)的大腸桿菌DH5α單菌落，過(guò)夜培養(yǎng)。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用BamH I和Xho I按以下體系雙酶切，酶切時(shí)間1.5h。酶切體系為：BamH I 2μL，Xho I 2μL，DNA<0.3μg，滅菌的雙蒸水加至40μL。酶切后在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，按照膠回收試劑盒方法回收經(jīng)過(guò)雙酶切的線(xiàn)性pET-28a(+)載體。

上述雙酶切使用的限制性?xún)?nèi)切酶為T(mén)hermo公司生產(chǎn)的快速內(nèi)切酶，酶切后的純化回收使用核酸純化回收試劑盒(Magen，Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)，質(zhì)粒提取試劑盒為上海捷瑞生物工程有限公司的質(zhì)粒小量制備試劑盒，操作方法按其使用說(shuō)明書(shū)。

2.3連接

將經(jīng)過(guò)雙酶切的PCR產(chǎn)物和雙酶切的pET-28α(+)載體按以下體系進(jìn)行連接：雙酶切PCR產(chǎn)物5μL，雙酶切的pET-28α(+)載體1μL，T4連接酶(5U/μL)0.5μL，連接緩沖液(5×)1μL用去離子水補(bǔ)足5μL，連接溫度為20℃，20min。

2.4轉(zhuǎn)化及篩選

取5μL連接產(chǎn)物加入50μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴20～30min，后于42℃水浴鍋熱激90s，冰浴2min后加入500μL LB液體培養(yǎng)基，37℃200rpm轉(zhuǎn)速下，孵育培養(yǎng)1h。取一定量的菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，培養(yǎng)20h后挑選單菌落。單菌落于5mL LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切片段與基因大小相同的即為陽(yáng)性克隆。

2.5基因核苷酸序列測(cè)定

將篩選的陽(yáng)性克隆送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與酯酶基因EstC10序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步確認(rèn)是將酯酶基因EstC10插入到pET-28α(+)質(zhì)粒中，結(jié)果完全正確后確認(rèn)得到帶有酯酶基因EstC10的pET-28α(+)質(zhì)粒(命名為pET-28α(+)-EstC10，可用于進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

實(shí)施例3：酯酶EstC10在E.coli BL21(DE3)中的高效表達(dá)

3.1大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞制備

1.將少量大腸桿菌BL21(DE3)菌種接入5mL LB試管液中，200rpm、37℃過(guò)夜培養(yǎng)；

2.按1％體積比的接種量將試管中的菌液接種到200mL LB搖瓶中，200rpm、20℃過(guò)夜培養(yǎng)，得到原培養(yǎng)物；

3.將培養(yǎng)好的搖瓶在冰水中迅速冷卻至0℃，分裝至冰預(yù)冷的離心管(50mL)，冰置數(shù)分鐘；

4.4℃、4000rpm離心10min回收細(xì)胞，棄上清；

5.用冰預(yù)冷的10mL 0.1M的CaCl₂重懸細(xì)胞，4℃、4000rpm離心10～15min回收細(xì)胞；

6.重復(fù)5，用10mL 0.1M的CaCl₂重懸細(xì)胞，冰浴30min以上；

7.4℃，4000rpm離心10min回收細(xì)胞；

8.每50mL原培養(yǎng)物用5mL含體積分?jǐn)?shù)7.5％DMSO的0.1M CaCl₂來(lái)重懸，分裝于1.5mL離心管，50～100μL每管。-80℃保藏。由此得到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

3.2轉(zhuǎn)化

取實(shí)施例2中得到的pET-28α(+)-EstC10質(zhì)粒0.5～1μL與50μL大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min，于42℃水浴鍋熱激90s，冰浴2min后加入500μL LB液體培養(yǎng)基，37℃200rpm培養(yǎng)1h。培養(yǎng)物離心后涂布50μg/mL的卡那霉素LB平板，培養(yǎng)過(guò)夜20h后挑選單菌。由此得到含有pET-28α(+)-EstC10的大腸桿菌BL21(DE3)。

實(shí)施例4：酯酶EstC10的表達(dá)和純化

4.1蛋白誘導(dǎo)

含有pET-28α(+)-EstC10的大腸桿菌BL21(DE3)在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.85左右，加IPTG至終濃度0.2mM，22℃培養(yǎng)16h。300mL菌液4000rpm、4℃離心20min，收集菌體，用30mL(50mM，pH 7.4)Tris-HCl緩沖液重懸菌體，超聲400w，超4s，停6s，破碎15min分鐘，離心，收集上清。

4.2酯酶EstC10的純化與SDS-PAGE電泳

用鎳離子親和層析柱純化4.1中收集的上清，具體實(shí)施方案如下：使用25mM的咪唑洗脫5個(gè)柱體積，40mM咪唑洗脫20～30個(gè)柱體積，最后使用3.5mL 100mM咪唑洗脫，收集最后的3mL洗脫液。用脫鹽柱SephadexG25進(jìn)行脫鹽，具體操作方法參照GE公司的操作手冊(cè)進(jìn)行。將純化的酯酶進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，得到純化的酯酶EstC10(圖1)，純化的蛋白大小約35kD，符合理論預(yù)期。

4.3酯酶EstC10活性測(cè)定

酯酶EstC10活力測(cè)定采用對(duì)硝基苯酚酯，具體方法如下：①用乙腈配制5mM的對(duì)硝基苯酚酯；②在0.2mL反應(yīng)體系中加入187.5μL Tris-HCl buffer(50mM，pH 8.0)，8μL對(duì)硝基苯酚酯，2.5μL純酶液(稀釋20倍后的濃度0.0025μg/μL)；③20℃下，反應(yīng)4min后，加入50μL正丙醇終止反應(yīng)，于405nm測(cè)定吸光度。

酶活力單位定義：1min內(nèi)水解對(duì)硝基苯酚酯，釋放1μM對(duì)硝基苯酚所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

實(shí)施例5：酯酶EstC10的酶學(xué)性質(zhì)

5.1水解不同側(cè)鏈長(zhǎng)度的對(duì)硝基苯酚酯

按照4.3的測(cè)定條件，比較酯酶EstC10水解不同長(zhǎng)度酰基的對(duì)硝基苯酚酯C₂-C₁₂，結(jié)果如圖2。說(shuō)明酯酶EstC10對(duì)長(zhǎng)鏈對(duì)硝基苯酚酯特異性差，而對(duì)于短鏈長(zhǎng)度的對(duì)硝基苯酚酯的作用效果較好，最佳的底物是C₂，即對(duì)硝基苯酚乙酸酯。

5.2最適pH和pH穩(wěn)定性

配制不同的緩沖溶液，這些緩沖溶液具有不同的pH，如表2所示，其濃度均為50mM。

表2不同pH的緩沖體系

將4.3中測(cè)定條件所述的緩沖液(Tris-HCl buffer)按照表2中的緩沖溶液分別進(jìn)行替換，測(cè)定重組酯酶EstC10的酶活力，底物為對(duì)硝基苯酚乙酸酯。pH對(duì)重組酯酶EstC10活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。在50mM的PBS pH8.0時(shí)，酯酶EstC10的酶活性最高，pH值在7.0–8.0之間有較高的酶活性。當(dāng)pH低于8.0時(shí)，其活性迅速降低。pH8.0時(shí)，酯酶EstC10在Tris-HCl緩沖液中的酶活力為PBS緩沖液中的77.6％。酯酶EstC10在不同pH的緩沖液中的穩(wěn)定性見(jiàn)圖4。pH在6.0-8.0時(shí)酶活性較穩(wěn)定，處理7h后殘余活性在55％以上。而在過(guò)堿條件下，酶活性喪失則較為明顯。

5.3最適溫度和溫度穩(wěn)定性

使用50mM的PBS pH8.0作為緩沖液，對(duì)硝基苯酚乙酸酯作為底物，按照4.3中的反應(yīng)體系，在不同溫度下測(cè)定酶活。測(cè)得酯酶EstC10催化水解對(duì)硝基苯酚乙酸酯的最適溫度為35℃(圖5)。在30-45℃間的酶活力達(dá)80％以上，溫度大于50℃時(shí)酶活性急劇下降。將酯酶EstC10在不同溫度(30-50℃)下，間隔一定時(shí)間取出測(cè)酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖6。酯酶EstC10在低于45℃時(shí)，酶活性保持較高，處理90min后殘余酶活性仍保持65％以上。隨著處理溫度的升高，酯酶殘余酶活力逐漸下降，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)酶活性急劇降低，在50℃處理30min后，殘余酶活力基本喪失(圖6)，說(shuō)明酯酶在低于45℃時(shí)穩(wěn)定性較好。

5.4金屬離子對(duì)酯酶EstC10活性的影響

按照表3中的離子種類(lèi)和濃度處理酯酶，以未添加任何離子或表面活性劑的反應(yīng)體系中的酶活力為100％，作為對(duì)照，在室溫下孵育3h，按4.3測(cè)定方法(以對(duì)硝基苯酚乙酸酯作為底物)測(cè)定相對(duì)酶活。金屬離子對(duì)酶活性的影響見(jiàn)表3。與對(duì)照相比，低濃度的Ni²⁺、Co²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺和Cu²⁺對(duì)酯酶催化對(duì)硝基苯酚乙酸酯的活力有不同程度的抑制作用。隨金屬離子濃度的增大，抑制作用加強(qiáng)。而Na⁺、Ba²⁺、K⁺、Mg²⁺和Ca²⁺對(duì)酯酶EstC10酶活力的影響很小。

表3金屬離子對(duì)酯酶EstC10活力的影響

5.5表面活性劑對(duì)酯酶EstC10活性的影響

按照表4中的表面活性劑的種類(lèi)和濃度處理酯酶EstC10，以未添加任何離子或表面活性劑的反應(yīng)體系中的酶活力為100％，作為對(duì)照。在室溫下孵育3h，按4.3測(cè)定方法(以對(duì)硝基苯酚乙酸酯作為底物)測(cè)定相對(duì)酶活。表面活性劑對(duì)酶活性的影響見(jiàn)表4。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％和0.5％兩個(gè)濃度下，Tween-20和三聚磷酸鈉對(duì)酶活性具有激活作用，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％濃度的Tween-80對(duì)酶活性具有抑制作用，并且隨著濃度增加抑制作用增強(qiáng)。SDS、SDBS、CTAB在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％濃度下對(duì)酶具有強(qiáng)抑制性。

表4表面活性劑對(duì)酯酶EstC10活性的影響

5.6有機(jī)溶劑對(duì)酯酶EstC10活性的影響

按照表5中所示有機(jī)溶劑種類(lèi)和終濃度，在反應(yīng)體系中加入有機(jī)溶劑處理酯酶EstC10酶液，處理?xiàng)l件為室溫，PBS(pH8.0)緩沖溶液中孵育3h，以未加入有機(jī)溶劑的反應(yīng)體系中酯酶EstC10活力為100％作為對(duì)照，再按照4.3的測(cè)定方法(以對(duì)硝基苯酚乙酸酯作為底物)測(cè)定相對(duì)酶活，結(jié)果如表5所示。在體積分?jǐn)?shù)10％的濃度下，正己烷、庚烷、三氯甲烷和DMSO對(duì)酯酶EstC10作用很小，庚烷和DMSO無(wú)明顯影響，而其他有機(jī)溶劑對(duì)酯酶EstC10有不同程度的抑制作用。在高濃度(體積分?jǐn)?shù)50％)下，酯酶EstC10在正己烷中保持較高的酶活，殘余酶活力為50％以上。以上結(jié)果說(shuō)明該酯酶能夠耐有機(jī)溶劑。

表5有機(jī)溶劑對(duì)酯酶EstC10活性的影響

實(shí)施例6：酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯

6.1有機(jī)溶劑對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

在反應(yīng)體系加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，10％(v/v)有機(jī)溶劑，以未加有機(jī)溶劑為對(duì)照，在37℃下反應(yīng)15min，用氣相色譜手性柱檢測(cè)，根據(jù)峰面積計(jì)算底物對(duì)映體過(guò)量值(Enantionmeric excess，e.e._s)和得率(Yield，Y)，結(jié)果見(jiàn)表6。公式1：公式2：

A_S和A_R分別表示R-2-氯丙酸甲酯和S-2-氯丙酸甲酯的峰面積。A₀和A分別表示反應(yīng)前后R-2-氯丙酸甲酯的峰面積。從表6可以看出絕大多數(shù)有機(jī)溶劑的存在降低了酯酶EstC10的立體選擇性。

表6有機(jī)溶劑對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

6.2反應(yīng)溫度對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

在PBS(pH8.0)反應(yīng)體系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，在不同溫度下反應(yīng)15min，手性氣相色譜測(cè)定酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的立體選擇性，結(jié)果見(jiàn)表7。從表中可以看出，在25-37℃，e.e._s隨溫度的升高，高于37℃，e.e._s降低，因此酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的最適溫度為37℃。

表7溫度對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

6.3表面活性劑對(duì)酯酶EstC10拆分2-氯甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)在反應(yīng)體系中加入終濃度為80mM的底物(±)-2-氯丙酸甲酯，0.1％(w/v)的表面活性劑(Tween-20、Tween-80、TritonX-100、三聚磷酸鈉)，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反應(yīng)15min后，樣品用于氣相色譜檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表8。從表8中可以看出，與對(duì)照相比，在表面活性劑存在的情況下，e.e._s有不同程度的降低，三聚磷酸鈉和Tween-20對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響相對(duì)較小。

表8表面活性劑對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

6.4金屬離子對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)在反應(yīng)體系中加入終濃度為80mM的底物(±)-2-氯丙酸甲酯，2mM的金屬離子，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反應(yīng)15min后，樣品用于氣相色譜檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表9。與對(duì)照相比，大多數(shù)金屬離子的存在使得e.e._s降低，Na⁺和Mg²⁺對(duì)(±)-2-氯丙酸甲酯的拆分基沒(méi)有影響。

表9金屬離子對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

6.5底物濃度對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)，在反應(yīng)體系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，60-120mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，反應(yīng)15min后，樣品用于GC檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖7。從圖7中可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0-70mM時(shí)，基本完全水解。隨著底物濃度的增加，e.e._s會(huì)迅速下降。底物濃度為80mM時(shí)，e.e._s達(dá)到93％，得率為33％，因此80mM為酯酶EstC10選擇性水解(±)-2-氯丙酸甲酯的最適底物濃度。

6.6反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)，在反應(yīng)體系中加入10mg的酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，每隔15min或10min取出500μL，用乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鈉除水，氣相色譜手性柱檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖8。從圖8中可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，e.e._s逐漸升高。反應(yīng)30min后，e.e._s變化不明顯，因此酯酶EstC10催化(±)-2-氯丙酸甲酯的最適時(shí)間是30min，最適反應(yīng)條件下酯酶EstC10催化拆分(±)-2-氯丙酸甲酯為R-2-氯丙酸甲酯的e.e._s為99％，得率為28％。最適條件下反應(yīng)前、后的氣相色譜圖見(jiàn)圖9和圖10。

實(shí)施例7：酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯

7.1有機(jī)溶劑對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在反應(yīng)體系加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-乳酸甲酯，10％(v/v)有機(jī)溶劑，以未加有機(jī)溶劑為對(duì)照，在37℃下反應(yīng)15min，用氣相色譜手性柱檢測(cè)，根據(jù)峰面積計(jì)算底物對(duì)映體過(guò)量值(Enantionmeric excess，e.e._s)和得率(Yield，Y)，結(jié)果見(jiàn)表10。

公式1：公式2：

A_D和A_L分別表示D-乳酸甲酯和L-乳酸甲酯的峰面積。A₀和A分別表示反應(yīng)前、后D-乳酸甲酯的峰面積。

在有機(jī)溶劑存在的情況下，e.e._s有不同程度的降低，異辛烷、正己烷和正庚烷的影響相對(duì)較小。

表10有機(jī)溶劑對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

7.2溫度對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在PBS(pH8.0)反應(yīng)體系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-乳酸甲酯，在不同溫度下反應(yīng)15min，手性氣相色譜測(cè)定酯酶拆分(±)-乳酸甲酯的立體選擇性，結(jié)果見(jiàn)表11。從表11中可以看出，e.e._s隨溫度的升高而增加，當(dāng)溫度高于37℃時(shí)，e.e._s隨溫度的升高而降低，在37℃時(shí)具有最大的e.e._s和轉(zhuǎn)化率，因此酯酶拆分(±)-乳酸甲酯的最適溫度為37℃。

表11溫度對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

7.3表面活性劑對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)在反應(yīng)體系中加入終濃度為80mM的底物(±)-乳酸甲酯，0.1％(w/v)的表面活性劑(Tween-20、Tween-80、TritonX-100、三聚磷酸鈉)，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反應(yīng)15min后，樣品用于氣相色譜檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表12。從表中可以看出，與對(duì)照相比，在三聚磷酸鈉存在的情況下，e.e._s有明顯提高，Tween-20對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯基本沒(méi)有影響。

表12表面活性劑對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

7.4金屬離子對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)在反應(yīng)體系中加入終濃度為80mM的底物(±)-乳酸甲酯，2mM的金屬離子，0.1％(w/v)的三聚磷酸鈉，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反應(yīng)15min后，樣品用于氣相色譜檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表13。從表中可以看出，與對(duì)照相比，大多數(shù)金屬離子的存在使e.e._s降低，Li⁺、Ca²⁺、Na⁺和Mn²⁺對(duì)(±)-乳酸甲酯的拆分基本沒(méi)有影響。

表13金屬離子對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

7.5底物濃度對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)，在反應(yīng)體系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，60-120mM底物(±)-乳酸甲酯，0.1％(w/v)的三聚磷酸鈉，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反應(yīng)15min后，樣品用于GC檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖11。從圖11中可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0mM時(shí)，基本完全水解。隨著底物濃度的增加，e.e._s會(huì)迅速下降。底物濃度為70mM時(shí)，e.e._s達(dá)到96％，得率為21％，因此70mM為酯酶EstC10選擇性水解(±)-乳酸甲酯的最適底物濃度。7.6反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)，在反應(yīng)體系中加入10mg的酯酶EstC10粗酶粉，70mM底物(±)-乳酸甲酯，0.1％(w/v)的三聚磷酸鈉，每隔10min取出500μL，用乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鈉除水，氣相色譜手性柱檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖12。從圖12中可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，e.e._s逐漸升高。反應(yīng)30min后，e.e._s達(dá)到99％，Y得率從20％降至11％，綜合考慮，酯酶EstC10催化(±)-乳酸甲酯的最適時(shí)間是20min，最適反應(yīng)條件下酯酶EstC10催化拆分(±)-乳酸甲酯為D-乳酸甲酯的e.e._s為97％，得率為20％。最適條件下反應(yīng)前、后的氣相色譜圖見(jiàn)圖13和圖14。