一種小鼠組織中結核桿菌dna的提取方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于DNA提取技術領域，尤其設及一種小鼠組織中結核桿菌DNA的提取方 法。
【背景技術】
[0002] 結核標準菌珠H37RV感染小鼠后，要得到小鼠體內(nèi)（如肺組織）中結核桿菌的載 量，通過提取其模板DNA，用絕對定量方法得出組織中結核桿菌的拷貝數(shù)（copynumber)與 組織DNA拷貝數(shù)比值。因此，要得到上述結果，必須提取組織總DNA(含小鼠組織DNA和結 核桿菌DNA)。目前所知的方法有肺泡灌洗液提取和制作組織石臘切片用二甲苯、丙酬提取 法和試劑盒提取法。組織石臘切片用二甲苯、丙酬提取法操作繁瑣，DNA的提取率較低；試 劑盒提取法：采用市場上購買得到的DNA提取試劑盒，能夠進行組織溶解和細胞裂解后提 取DNA，雖然該方法操作簡便，但是DNA的提取率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種小鼠組織中結核桿菌DNA的提取方法。所 述提取方法DNA的提取率高、操作簡便。
[0004] 本發(fā)明的技術方案如下：一種小鼠肺組織中結核桿菌DNA的提取方法，包括W下 步驟：
[0005] 步驟（1)將小鼠肺組織勻漿離屯、后棄上清，加入GA緩沖液和蛋白酶K溶液后， 50~56°C水浴3~12h，進行組織溶解得到細胞懸液；
[000引步驟似細胞懸液中加入抑為8的TES緩沖液和5%的SDS溶液后，先置于溫水 浴中40min，再置于沸水浴60min，最后在冰上放置5min，得到混懸液；
[0007] 步驟（3)在混懸液中加入pH4. 8的醋酸鋼溶液和0. 05mol/L的葡萄糖溶液，冰上 放置10~20min;然后加入苯酪/氯仿/異戊醇溶液提取，離屯、后取上層水相，上層水相 中加入氯仿/異戊醇溶液提取，離屯、后，取上層水相，加入乙醇，充分震蕩后，一20°C沉淀 30min，離屯、得到沉淀物，沉淀物即為總DNA，總DNA包括小鼠DNA和結核桿菌DNA，總DNA進 行QPCR擴增得到小鼠肺組織中結核桿菌DNA的載量。
[0008] 步驟（1)所述GA緩沖液、蛋白酶K溶液來源于細菌基因組DNA提取試劑盒，蛋白 酶K溶液的濃度為2mg/ml，GA緩沖液用于懸浮細胞，并為蛋白酶K提供適合的反應體系。
[0009] TES緩沖液用于裂解細菌的細胞壁，釋放DNA，其中含有Tris-HCl、邸TA、SDS和溶 菌酶，溶菌酶的濃度為20mg/mL;SDS是一種蛋白變性劑，破壞蛋白質的高級結構。
[0010] 步驟（2)所述溫水浴的溫度為36~37°C，溶菌酶在該溫度范圍下活性最高，從而 裂解小鼠肺組織中結核桿菌細胞壁。
[0011] 步驟（2)沸水浴的目的有兩個：第一，在裂解細胞的工作完成后，為了避免溶菌酶 繼續(xù)反應，產(chǎn)生高溫使得溶菌酶失活。第二，沸水浴條件下，也可使溶菌酶裂解不充分的結 核桿菌細胞壁得到進一步破碎，從而進一步提高DNA得率。
[0012] 步驟（3)所述苯酪/氯仿/異戊醇溶液中苯酪、氯仿和異戊醇體積比為25 :24 :1， 所述氯仿/異戊醇溶液中氯仿和異戊醇的體積比為24 :1。
[0013] 作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的方法中所述離屯、條件為120(K)r/min，離屯、lOmin。
[0014] 作為優(yōu)選，步驟（3)加入乙醇充分震蕩后，在低溫條件下可使得DNA更容易沉淀， 且可保護DNA不被降解。
[0015] 提取總DNA后進行QPCR擴增，然后進行瓊脂慷凝膠電泳。
[001引 QPCR擴增時本發(fā)明根據(jù)結核桿菌特有基因設計特有的引物序列；QPCR(實時巧光 定量PCR)擴增采用的引物序列如下：
[0017]前引物：5，_AGAAGGCGTACTCGACCTGA_ 3，
[0018]后引物：5，_CTGAACCGGATCGATGTGTA_ 3，。
[0019]QPCR擴增條件為：94°C預變性3s，94°C變性lmin，52°C退火30s，72°C末次延伸 30s，變性與退火循環(huán)35次。
[0020] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有W下有益效果：本發(fā)明提供的提取方法提取率高、操 作簡便，得到的DNA的純度和濃度均較高。
【附圖說明】
[0021] 圖1為提取不同感染時間的小鼠肺組織DNA后進行QPCR擴增后的電泳圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步詳細說明。
[0023]GA緩沖液和蛋白酶K溶液來源于細菌基因組DNA提取試劑盒，該細菌基因組DNA 提取試劑盒購買于天根生化科技有限公司，目錄號為DP302-02;PCR試劑盒購買于TaKaRa 公司；本發(fā)明根據(jù)結核桿菌特有基因X52471設計引物序列，由上海生工科技公司合成；所 述的小鼠為結核標準菌珠H37RV感染的km小鼠（雌）。
[0024] 實施例1
[002引小鼠肺組織（SOmg)
[0026] I勻漿，10000巧m，Imin
[0027] 棄上清，向沉淀中加入GA(組織溶解液）200y1和蛋白酶K溶液20y1
[002引 |56°(：水浴3.011，得到細胞懸液
[0029] 加TES(細胞裂解液PH為8,含溶菌酶濃度為20mg/ml) 200y1和
[0030] 5 % (W/V)SDS(沉淀劑）120y1
[0031]I36°C水浴 40min,沸水浴 60min，冰上放置 5min，
[00礎得到混懸液
[0033]加 500y1PH4. 8 的NaAc(醋酸鋼）和 100y1 0. 05mol/LG(葡萄糖）
[0034] I顛倒混勻，冰上放置15min分裝成兩管
[003引每管加入600y1苯酪/氯仿/異戊醇（25 :24:1)
[0036]I顛倒混勻，12000;rpm，IOmin
[0037] 取上層水相至新的離屯、管
[0038] i
[0039] 加入等體積的氯仿/異戊醇（24 :1)
[0040]I 12000巧m，IOmim
[0041] 取上層水相至另一離屯、管
[0042] i
[0043] 加入Iml無水乙醇充分震蕩，一20°C沉淀30min
[0044]I 12000;rpm，IOmin
[004引 倒去上清驚干3~5min,得到總DNA，加入50yITE溶解DNA，將總DNA進行QPCR 擴增，然后進行凝膠電泳。
[004引實施例2
[0047] 小鼠肺組織（SOmg)
[0048]I 勻漿，10000巧m，Imin
[0