本發(fā)明屬于微生物樣品前處理領(lǐng)域，具體涉及一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速提取樣品細(xì)菌基因組DNA的方法，主要是利用高壓放電產(chǎn)生等離子體直接與無(wú)菌水混合，生成等離子體活化水，通過(guò)與包括空氣、水體以及人體樣品等混合，快速提取樣品DNA，與當(dāng)前基因檢測(cè)方法結(jié)合后可以快速完成細(xì)菌檢測(cè)。

背景技術(shù)：

隨著生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，核酸在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，核酸檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速。例如，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LMAP)等快速檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)，樣本檢測(cè)時(shí)間大大縮短，檢測(cè)限降低。這對(duì)樣本的前處理提出了新的要求，低成本、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便的核酸提取方法逐漸成為研究熱點(diǎn)。

目前，細(xì)菌基因組DNA提取方法有專用DNA提取試劑盒法、堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法及其他破壁方法(超聲破碎、研磨破碎、反復(fù)凍融等)。堿裂解法具有簡(jiǎn)捷、純度高等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)菌基因組DNA的常規(guī)提取方法之一，但該方法提取時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要兩小時(shí)以上，且具有一定的腐蝕性；應(yīng)用專用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，效果好，但成本較高，臨床應(yīng)用受到限制；煮沸法時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，收率較低，其最大的缺陷是對(duì)提取革蘭氏陽(yáng)性菌基因組DNA的效果不佳；SDS裂解法及其他裂解方法需要復(fù)雜的裂解體系，不僅配制麻煩，而且部分藥品有毒，操作危險(xiǎn)性大，此外部分藥品及相關(guān)酶試劑價(jià)格昂貴，因此在應(yīng)用上受到一定的限制。

本發(fā)明采用大氣壓等離子體射流噴槍制備的低溫等離子體活化水(Plasma Activated Water，PAW)，該種經(jīng)過(guò)處理的水具有強(qiáng)氧化性，在與細(xì)菌菌液混合反應(yīng)后，可通過(guò)物理方法實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的裂解，提取細(xì)菌基因組DNA，具有簡(jiǎn)便、快速、材料易獲得等特點(diǎn)，可大大縮短核酸樣本提取的時(shí)間，顯著降低DNA提取的費(fèi)用以及對(duì)特定設(shè)備的依賴。目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有采取這種方法提取細(xì)菌基因組DNA。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速提取細(xì)菌基因組DNA的方法，該方法可用于裂解細(xì)胞壁，將核酸從細(xì)胞中釋放出來(lái)，所得核酸樣品可用于分子生物學(xué)檢測(cè)，例如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)等方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種快速提取細(xì)菌基因組DNA的方法，包括以下步驟：

1)制備低溫等離子體活化水(PAW)；

2)將步驟1)制備的活化水與菌液混合，震蕩反應(yīng)一定時(shí)間，即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞壁的裂解和DNA的提取。

上述步驟1)優(yōu)選采用大氣壓等離子體(atmospheric pressure cold plasma)射流噴槍制備低溫等離子體活化水。其中，以高頻高壓交流電作為大氣壓低溫等離子體射流噴槍的激發(fā)電源，優(yōu)選電源輸入電壓為50～100V，電流實(shí)時(shí)調(diào)整，一般在0.2～0.5A。載氣優(yōu)選使用5％V/V氧氣和95％V/V氬氣或氮?dú)獾幕旌蠚怏w，生成的低溫等離子體從噴槍噴嘴噴出。將噴嘴置于無(wú)菌水液面上方(距離液面2cm左右)，激發(fā)低溫等離子體與水反應(yīng)，當(dāng)水的pH至3～5之間，氧化還原電位(OPR)值在400～500mV之間，即為制備完成，通常控制反應(yīng)時(shí)間在10～30min，生成低溫等離子體活化水(PAW)，震蕩混勻后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

上述步驟2)中，優(yōu)選PAW與菌液按體積1∶1混合，震蕩反應(yīng)5～20min。

使用低溫等離子體處理過(guò)的水具有強(qiáng)氧化性，且具有pH值低、氧化還原電位(ORP)值高，以及能長(zhǎng)期貯存NO₂^-、NO₃^-與H₂O₂等特點(diǎn)。本發(fā)明利用低溫等離子體活化水與細(xì)菌菌液反應(yīng)，直接裂解細(xì)胞壁，釋放出細(xì)菌基因組DNA。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行，成本低，時(shí)間短，可現(xiàn)場(chǎng)快速提取樣品中細(xì)菌基因組DNA，用于分子生物學(xué)檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1：實(shí)施例1等離子體活化水提取銅綠假單胞菌DNA后LAMP檢測(cè)結(jié)果比較圖。

圖2：實(shí)施例2等離子體活化水提取肺炎鏈球菌DNA后LAMP檢測(cè)結(jié)果比較圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：等離子體活化水用于提取革蘭氏陰性菌-銅綠假單胞菌DNA

(1)制備等離子體活化水：大氣壓低溫等離子體射流噴槍的激發(fā)電源輸入電壓50V，電流0.20A，載氣使用氬氣(含5％V/V氧氣)，流速5L/min，將噴嘴置于50mL無(wú)菌水液面上2cm，激發(fā)低溫等離子體與水反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為30min，生成低溫等離子體活化水(PAW)，震蕩混勻10s。

(2)制備銅綠假單胞菌菌液：使用LB培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。菌落長(zhǎng)出后，用20mL無(wú)菌水將其從培養(yǎng)基表面刮下來(lái)，置于50mL離心管中，7000rpm下離心7min，棄上清液后加入20mL無(wú)菌水，震蕩混勻；重復(fù)上述步驟兩次，最后加入20mL無(wú)菌水后混勻得到待處理菌液。

(3)梯度處理：將原菌液稀釋，得到10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5濃度的菌液。

(4)將上述6個(gè)濃度梯度的菌液分別按體積1∶1與PAW混合，震蕩反應(yīng)20min。

(5)同時(shí)使用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生物科技有限公司，北京)提取步驟(3)所得梯度菌液，作為對(duì)照。

(6)將上述反應(yīng)液使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)的方法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL，包含2μL DNA模板，1.6μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.8μM的LF和LB，8U Bst酶，以及12.5μL的2×RM，使用ddH₂O補(bǔ)齊體積。將混合體系至于濁度儀(LA-500，Kyoto,Japan)中，64℃反應(yīng)60min，最后80℃加熱處理2min。

結(jié)果如圖1所示，高濃度時(shí)，使用PAW處理G^-細(xì)菌(銅綠假單胞菌)得到的DNA樣本，LAMP反應(yīng)的檢測(cè)時(shí)間小于傳統(tǒng)的吸附柱法，表明該方法提取的DNA濃度較高，菌液濃度稍低時(shí)，使用PAW方法處理細(xì)菌的效率略低于試劑盒方法。

實(shí)施例2：等離子體活化水用于提取革蘭氏陽(yáng)性菌-肺炎鏈球菌DNA

(1)制備等離子體活化水：大氣壓低溫等離子體射流噴槍的激發(fā)電源輸入電壓50V，電流0.20A，載氣使用氬氣(含5％V/V氧氣)，流速5L/min，將噴嘴置于50mL無(wú)菌水液面上2cm，激發(fā)低溫等離子體與水反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為30min，生成低溫等離子體活化水(PAW)，震蕩混勻10s。

(2)制備肺炎鏈球菌菌液：使用LB培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。菌落長(zhǎng)出后，用20mL無(wú)菌水將其從培養(yǎng)基表面刮下來(lái)，置于50mL離心管中，7000rpm下離心7min，棄上清液后加入20mL無(wú)菌水，震蕩混勻；重復(fù)上述步驟兩次，最后加入20mL無(wú)菌水后混勻得到待處理菌液。

(3)梯度稀釋處理：將原菌液梯度稀釋，分別得到1，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5濃度的菌液。

(4)將上述6個(gè)濃度梯度的菌液分別按體積1∶1與PAW混合，震蕩反應(yīng)20min。

(5)同時(shí)使用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生物科技有限公司，北京)提取步驟(3)所得梯度菌液，作為對(duì)照。

(6)將上述反應(yīng)液使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)的方法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL，包含2μL DNA模板，1.6μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.8μM的LF和LB，8U Bst酶，以及12.5μL的2×RM，使用ddH₂O補(bǔ)齊體積。將混合體系至于濁度儀(LA-500，Kyoto,Japan)中，64℃反應(yīng)60min，最后80℃加熱處理2min。

結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明提供的細(xì)菌基因組DNA的方法，與標(biāo)準(zhǔn)的吸附柱法提取方法相比，材料簡(jiǎn)單易得，成本低，反應(yīng)時(shí)間短，并且對(duì)LAMP檢測(cè)沒(méi)有影響，可以廣泛應(yīng)用于提取細(xì)菌基因組DNA。