本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種長非編碼RNA及其在診斷/治療非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因組學(xué)研究表明，人類基因組約有20000個(gè)蛋白編碼基因，約總基因數(shù)比例的2％，其余大多數(shù)基因被轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA(non-codingRNA，ncRNA)。ncRNA依其長短，可分為轉(zhuǎn)錄起始RNA、Piwi蛋白相互作用RNA，微小RNA、小核仁RNA和長非編碼RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)等。LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個(gè)核苷酸且自身不編碼蛋白的RNA分子。LncRNA起初被認(rèn)為是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能。然而，最近的研究表明，它們可以通過多種不同的機(jī)制、在多種層面上影響基因的表達(dá)水平。LncRNAs調(diào)控基因表達(dá)的方式存在多樣性，表現(xiàn)在lncRNAs依賴的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的多樣性。在不同機(jī)制中，lncRNAs作用不同，既可作為主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，又可作為共調(diào)控因子之一，與其他組分共同發(fā)揮調(diào)控作用。lncRNAs對于基因表達(dá)調(diào)控的層次大體上可分為：(1)表觀修飾水平調(diào)控，通過與各種染色質(zhì)修飾酶相互作用，對染色質(zhì)進(jìn)行修飾，改變其構(gòu)象，激活或抑制相關(guān)基因的表達(dá)。尤其在胚胎發(fā)育階段，lncRNAs參與引起可遺傳的等位基因后期表達(dá)沉默、表觀性狀的維持，對于多細(xì)胞動物的正常發(fā)育與細(xì)胞分化至關(guān)重要。(2)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，LncRNAs通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合與裝配，與調(diào)控序列DNA形成三鏈復(fù)合物，調(diào)控RNA聚合酶II，轉(zhuǎn)錄干擾等方法實(shí)現(xiàn)。(3)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，通過和互補(bǔ)的mRNA形成dsRNA，影響mRNA的加工、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和降解等過程，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。

LncRNAs因其在致癌與腫瘤抑制途徑中顯露出的潛在作用而成為腫瘤研究的新熱點(diǎn)。近年來，許多研究顯示，某些LncRNAs與相應(yīng)的人類腫瘤密切相關(guān)。通過調(diào)控一系列生物功能或者干擾正常功能，包括轉(zhuǎn)錄沉默、可變剪接等方式，LncRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的資料顯示，肺癌的發(fā)病率和死亡率在世界各國均呈明顯上升的趨勢，尤其是工業(yè)發(fā)達(dá)的國家。在發(fā)達(dá)國家，肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，列男性常見惡性腫瘤的第一位，列女性常見惡性腫瘤的第2、3位。20世紀(jì)末肺癌已占惡性腫瘤死亡的首位。非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的80％，可分為腺癌、鱗癌、大細(xì)胞肺癌等。許多肺癌患者在診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，往往失去手術(shù)機(jī)會，而針對肺癌的化療方案效果亦欠佳，五年生存率低于5％，亟需尋找新的、有效的治療肺癌的方法。隨著基因工程研究的深入，科學(xué)家對運(yùn)用基因工程研制腫瘤藥表現(xiàn)出濃厚的興趣。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)LINC00111在治療非小細(xì)胞肺癌方面具有很好應(yīng)用前景。

LINC00111是一條長度為469bp的LncRNA，是由發(fā)明人提供正常肺組織與肺癌組織標(biāo)本，由博奧生物有限公司進(jìn)行芯片制備篩選出的在肺癌組織中顯著高表達(dá)的RNA。LINC00111由發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)并命名，具有新穎性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供用于診斷非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)預(yù)后情況或作為治療非小細(xì)胞肺癌藥物靶點(diǎn)的長非編碼RNA(LINC00111)，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1，

SEQ ID NO：1：

TCCATACACTCCGTCTCCTGAAGGGGAAGCGGGCTCTTCTCAGATGCACAGGGACAATGTGAAAATCCTGTCCTCAGATTGAGAGGCTGTTTCGTGGGCACCGAATTCGGGGTCAGGAAAGCAGCCTGCATCCACGAGTATCCTCGGGTTACTAAGTGGGGCCAGTGGCTCCAGGTGTAACCCATTTAAGTTTGCCAGACAGCCGGGATGTTCTGGTGAAGGATCTGAAGTGTATGGCCACACCAGTCCCAGAAGAGCCTGGGAGAAGGGAAGATGGTGAACACAGTGGAGTTCTGCTGCAAAGCCGAAGATGGTTCTGGCACGTGGCATGACCCACATGACTCAACATCAGGAGATCTGACTTCATAAAAGTGAACTATCACAATGCTGCTTTGCAAGCTGTGTGTGAGTGTAAAAGCGTTGAAACTTCCTCAATAAATGAAAAGATATCTTTAAAAAAAAAAAAAAA

本發(fā)明還涉及長非編碼RNA的標(biāo)記物在制備判斷非小細(xì)胞肺癌治療預(yù)后情況的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述的標(biāo)記物包括但不限于：

(1)結(jié)合所述長非編碼RNA的引物/引物組或熒光標(biāo)記的結(jié)合所述長非編碼RNA的引物/引物組；

(2)結(jié)合所述長非編碼RNA的小分子化合物；

(3)結(jié)合所述長非編碼RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗體或抗體功能片段、熒光標(biāo)記的抗體或抗體功能片段、RNA結(jié)合蛋白或其功能片段、熒光標(biāo)記的RNA結(jié)合蛋白或其功能片段。

本發(fā)明還涉及針對長非編碼RNA的引物組的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示：

SEQ ID NO：2：F1：CCTGGGAGAAGGGAAGA；

SEQ ID NO：3：R1：AAGCAGCATTGTGATAGTT。

本發(fā)明還涉及包括所述標(biāo)記物的用于判斷非小細(xì)胞肺癌治療預(yù)后情況的試劑或試劑盒。

本發(fā)明還包括針對長非編碼RNA的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示：

SEQ ID NO：4 CAGTGGCTCCAGGTGTAACCCATTT

SEQ ID NO：5 GGGATGTTCTGGTGAAGGATCTGAA

SEQ ID NO：6 CAACATCAGGAGATCTGACTTCATA

本發(fā)明還包括所述的標(biāo)記物的用于判斷非小細(xì)胞肺癌治療預(yù)后情況的試劑或試劑盒。

本發(fā)明還包括所述的抑制劑的用于治療非小細(xì)胞肺癌的藥物或藥物組合物。

技術(shù)方案

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。

一般性說明：

實(shí)施例中末注明具體條件的的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照Sambrook，J等人編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黃培堂等譯，科學(xué)出版社.2002.8)中所述的條件及方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進(jìn)行，其它沒有詳細(xì)描述的技術(shù)相應(yīng)于本領(lǐng)域人員來說是熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。

本發(fā)明的材料：本申請中提及的細(xì)胞株、慢病毒干擾載體以及培養(yǎng)基均有商品供應(yīng)或以別的途徑能為公眾所得，它們僅作舉例，對本發(fā)明不是唯一的，可分別用其它適合的工具和生物材料來代替。

設(shè)計(jì)特異性的針對LINC00111的干擾序列，以干擾GAPDH基因的序列片作為對照。將合成的的siRNA轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞，起到下調(diào)LINC00111表達(dá)的作用。

附圖說明

圖1 qRT-PCR測正常肺上皮細(xì)胞株16HBE與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549的LINC00111表達(dá)水平，GAPDH設(shè)為內(nèi)參。

圖2、MTT法測改變LINC00111表達(dá)前后對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株進(jìn)行順鉑處理的IC50。

圖3、MTT法測改變LINC00111表達(dá)前后對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株進(jìn)行多西他賽處理的IC50。

圖4、流式細(xì)胞術(shù)測改變LINC00111表達(dá)前后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549對于順鉑的細(xì)胞凋亡變化，其中a為A549/si-NC，b為A549/si-LINC00111，c為凋亡率比較。

圖5、流式細(xì)胞術(shù)測改變LINC00111表達(dá)前后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549對于多西他賽的細(xì)胞凋亡變化，其中a為A549/si-NC，b為A549/si-LINC00111，c為凋亡率比較。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1LINC00111在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平的基礎(chǔ)驗(yàn)證試驗(yàn)

(一)：LINC00111在正常肺組織與肺癌組織中的表達(dá)情況

1.芯片制備及分析:按照博奧生物有限公司的要求準(zhǔn)備正常肺組織與肺癌組織標(biāo)本，交由博奧生物有限公司進(jìn)行芯片制備，人類長鏈非編碼RNA芯片V1.0版本完成芯片分析。

2.芯片結(jié)果分析:LINC00111在肺癌中的表達(dá)量較正常肺組織中上調(diào)了29.08倍；提示LINC00111在肺癌中可能作為一個(gè)癌基因發(fā)揮作用。

(二)：qRT-PCR分析LINC00111在正常肺上皮細(xì)胞株16HBE與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549中的表達(dá)量

1.方法：Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，qRT-PCR運(yùn)用SYBRGreenPCRMasterMix(TAKARA，大連，中國)，人GAPDH作為內(nèi)參。

2.qRT-PCR結(jié)果：如圖1所示。

3.結(jié)果分析：LINC00111在16HBE中低表達(dá)，在A549中高表達(dá)。

實(shí)施例2抑制LINC00111表達(dá)對于非小細(xì)胞肺癌的治療作用

1.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：

LINC00111的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示：

SEQ ID NO：4 CAGTGGCTCCAGGTGTAACCCATTT

SEQ ID NO：5 GGGATGTTCTGGTGAAGGATCTGAA

SEQ ID NO：6 CAACATCAGGAGATCTGACTTCATA

以干擾GAPDH基因的序列片作為對照，并將其插入慢病毒載體中(以上載體及片段由invitrogen公司合成)。將包裝好的慢病毒載體感染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞，起到下調(diào)LINC00111表達(dá)的作用，48h后用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，命名為A549/si-LINC00111(對照為A549/si-NC)。構(gòu)建si-LINC00111慢病毒干擾載體感染A549細(xì)胞株(A549/si-LINC00111)。空載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株(A549/si-NC)設(shè)為對照組。將這些細(xì)胞株種在6孔板上，3×105個(gè)細(xì)胞/孔。每組給予順鉑或多西他賽處理，48h后流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡水平。

與對照組相比，感染LINC00111慢病毒干擾載體后，給予順鉑或多西他賽處理均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡增多，提示降低LINC00111表達(dá)可增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，結(jié)果參見說明書附圖4、5。

2細(xì)胞周期檢測

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：構(gòu)建LINC00111慢病毒干擾載體感染A549細(xì)胞株(A549/si-LINC00111)，空載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株(A549/si-NC)設(shè)為對照組。將這些細(xì)胞株種在6孔板上，3×105個(gè)細(xì)胞/孔。每組給予順鉑或多西他賽處理，24h后流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞周期。

A549感染LINC00111慢病毒干擾載體后與對照組相比，給予順鉑或多西他賽處理均出現(xiàn)細(xì)胞周期G1期阻滯增加，提示降低LINC00111表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示降低LINC00111表達(dá)能夠增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，可作為腫瘤治療的干預(yù)靶點(diǎn)，結(jié)果參見說明書附圖4、5。

實(shí)施例3細(xì)胞耐藥相關(guān)實(shí)驗(yàn)

1.MTT測細(xì)胞IC50：構(gòu)建LINC00111慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株(A549/si-LINC00111)，空載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株(A549/si-NC)設(shè)為對照組。將這些細(xì)胞株種在96孔板上，2500個(gè)細(xì)胞/孔。每組給予順鉑或多西他賽處理，給藥3天后MTT染色法檢測細(xì)胞活力，進(jìn)而計(jì)算各自的藥物IC50。

2.結(jié)果測定:如圖2、3所示。

3.結(jié)果分析:在A549細(xì)胞株中，給予DDP處理的si-LINC00111實(shí)驗(yàn)組IC50：11.01ug/ml，對照組IC50(NC)：23.26ug/ml；給予DTX處理的A549/si-LINC00111實(shí)驗(yàn)組IC50:13.42ug/ml，對照組IC50(NC):25.69ug/ml。觀察到此現(xiàn)象，提示降低LINC00111表達(dá)可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞化療敏感。