本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及修飾crRNA在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因編輯是在基因組水平上進行精確修飾的一種技術(shù)，可完成基因定點刪除(InDel)突變、基因定點插入突變、多位點同時突變和小片段的刪失等?；蚓庉嫾夹g(shù)可用于基因功能及疾病發(fā)病機理研究、構(gòu)建疾病動物模型、生物治療、遺傳和腫瘤相關(guān)疾病研究、整合病毒疾病研究和改良農(nóng)畜牧物種?；蚓庉嫾夹g(shù)是從根本上改變物種遺傳物質(zhì)DNA的工具，具有極其廣泛的應(yīng)用價值和發(fā)展前景。

鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)是三大基因編輯技術(shù)，本質(zhì)上均是利用非同源末端鏈接途徑(NHEJ)修復(fù)和同源重組(HR)修復(fù)，聯(lián)合特異性DNA的靶向識別及核酸內(nèi)切酶完成的DNA序列改變。NHEJ修復(fù)使基因產(chǎn)生插入或刪除突變，從而造成基因移碼突變，以實現(xiàn)編碼蛋白基因敲除，如果是基因組鄰近位置兩處雙鏈斷裂，NHEJ修復(fù)后則可造成基因組片段缺失。鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)三種編輯技術(shù)的共同點是含有靶點DNA序列的識別區(qū)域及DNA剪切功能區(qū)域。其中ZFN通過鋅指結(jié)構(gòu)域識別靶點DNA序列，TALEN識別靶點DNA序列的區(qū)域是重復(fù)可變雙殘基的重復(fù)，ZFN和TALEN的DNA剪切功能區(qū)域均為一種名為Fokl的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)okI結(jié)構(gòu)需要形成二聚體才能發(fā)揮DSB剪切功能，所以ZFNs和TALEN均需要表達(dá)兩個DNA靶向-FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)融合蛋白。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)是存在于大多數(shù)細(xì)菌(約40％)和古細(xì)菌(約90％)中的一種后天免疫系統(tǒng)，可用來消滅或?qū)雇鈦淼馁|(zhì)體或者噬菌體，并在自身基因組中留下外來基因片段作為“記憶”，在下一次外源DNA入侵時，表達(dá)的Cas9核酸酶在含有記憶片段的crRNA及tracrRNA的指導(dǎo)下切割與記憶片段一樣且含有PAM的外源基因，發(fā)揮抵抗外源DNA片段入侵的免疫作用。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯生物基因組，可在靶標(biāo)片段處造成不同形式的缺失或插入，現(xiàn)已成功應(yīng)用于人類細(xì)胞系、斑馬魚、大鼠、小鼠、果蠅等生物中。與ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中蛋白質(zhì)對DNA序列的識別要更加精確得多，降低了脫靶切割的幾率，減低了細(xì)胞毒性，而且CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建僅僅需要設(shè)計與靶序列互補的gRNA即可，更為簡單和廉價，大大提高了基因操作的效率及簡便性。但是，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也存在著一些不足，如Cas9蛋白不能對任意序列進行切割，其靶點3’端要求必須含有PAM序列(如SpCas9蛋白要求PAM序列為NGG)。

最新發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)(Zetsche B,Gootenberg JS et al.Cpf1is a single RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.Cell.2015Oct22；163(3):759-71.)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)同屬CRISPR-Cas Class2系統(tǒng)，但前者僅需要一條更短的crRNA即可實現(xiàn)基因編輯，更有潛力實現(xiàn)更簡單、更精確的基因組工程操作。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何進行基因編輯。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用；所述CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的crRNA為修飾crRNA。

上述應(yīng)用中，所述修飾的方式可為脫氧核糖核酸修飾。

上述應(yīng)用中，所述脫氧核糖核酸修飾的方法可為：在所述crRNA的5’末端增加1～3個脫氧核糖核酸和/或3’末端增加1～3個脫氧核糖核酸。

上述應(yīng)用中，所述脫氧核糖核酸修飾的方法具體可為a1)-a6)中的任一種：

a1)在所述crRNA的5’末端增加1個脫氧核糖核酸；

a2)在所述crRNA的5’末端增加2個脫氧核糖核酸；

a3)在所述crRNA的3’末端增加1個脫氧核糖核酸；

a4)在所述crRNA的3’末端增加2個脫氧核糖核酸；

a5)在所述crRNA的5’末端和3’末端各增加1個脫氧核糖核酸；

a6)在所述rRNA的5’末端和3’末端各增加2個脫氧核糖核酸。

上述應(yīng)用中，所述脫氧核糖核酸具體可為胸腺嘧啶脫氧核苷酸。

上述應(yīng)用中，所述CRISPR/Cpf1系統(tǒng)可為AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)或FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)。

上述應(yīng)用中，“所述CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的crRNA為修飾crRNA”具體可為所述CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的crRNA為化學(xué)合成且具有修飾的crRNA。

所述AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)來自Acidaminococcus_sp.BV3L6，其表達(dá)AsCpf1蛋白。所述FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)來自Francisella_novicida，其表達(dá)FnCpf1蛋白。

所述AsCpf1蛋白可為h1)或h2)或h3)：

h1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；

h2)在h1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

h3)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

所述FnCpf1蛋白可為i1)或i2)或i3)：

i1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)；

i2)在i1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

i3)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了定向編輯基因組的方法。

本發(fā)明所提供的定向編輯基因組的方法，可包括如下步驟：

(1)根據(jù)受體基因組中預(yù)期進行定向編輯的靶基因設(shè)計crRNA；

(2)將所述crRNA進行修飾，得到修飾的crRNA；

(3)利用所述修飾的crRNA和編碼Cpf1蛋白的基因?qū)κ荏w進行定向編輯。

所述(1)中，所述靶基因具體可為hAAVS1基因(Gene ID：54776)或THUMPD3-AS1基因(Gene ID：440944)。根據(jù)所述hAAVS1基因的核苷酸序列選擇靶序列Ⅰ，所述靶序列Ⅰ的核苷酸序列具體可為：5’-TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3’。根據(jù)所述THUMPD3-AS1基因的核苷酸序列選擇靶序列Ⅱ，所述靶序列Ⅱ的核苷酸序列具體可為：5’-GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3’。

所述(3)中，所述Cpf1蛋白可為所述AsCpf1蛋白或所述FnCpf1蛋白。

所述(2)中，所述修飾的方式可為脫氧核糖核酸修飾。

所述(2)中，所述脫氧核糖核酸修飾的方法可為：在所述crRNA的5’末端增加1～3個脫氧核糖核酸和/或3’末端增加1～3個脫氧核糖核酸。

所述(2)中，所述脫氧核糖核酸修飾的方法具體可為a1)-a6)中的任一種：

a1)在所述crRNA的5’末端增加1個脫氧核糖核酸；

a2)在所述crRNA的5’末端增加2個脫氧核糖核酸；

a3)在所述crRNA的3’末端增加1個脫氧核糖核酸；

a4)在所述crRNA的3’末端增加2個脫氧核糖核酸；

a5)在所述crRNA的5’末端和3’末端各增加1個脫氧核糖核酸；

a6)在所述crRNA的5’末端和3’末端各增加2個脫氧核糖核酸。

所述(2)中，所述脫氧核糖核酸具體可為胸腺嘧啶脫氧核苷酸。

所述(2)具體可為完成步驟(1)后，化學(xué)合成所述crRNA并進行修飾，得到修飾的crRNA。

所述(2)和(3)中，所述修飾的crRNA具體可為e1)-e16)中的任一種：

e1)5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdT-3’；

e2)5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdT-3’；

e3)5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdTdT-3’；

e4)5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdTdT-3’；

e5)5’-dTAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdT-3’；

e6)5’-dTAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdT-3’；

e7)5’-dTdTAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdTdT-3’；

e8)5’-dTdTAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCUGUCCCCUCCACCCCACAGdTdT-3’；

e9)5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdT-3’；

e10)5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdT-3’；

e11)5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdTdT-3’；

e12)5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdTdT-3’；

e13)5’-dTAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdT；

e14)5’-dTAAUUUCUACUGUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdT-3’；

e15)5’-dTdTAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdTdT；

e16)5’-dTdTAAUUUCUACUGUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCdTdT-3’。

所述e1)、所述e3)、所述e5)、所述e7)、所述e9)、所述e11)、所述e13)或所述e15)，具體可與編碼所述AsCpf1蛋白的基因?qū)胨鍪荏w。所述編碼所述AsCpf1蛋白的基因可通過質(zhì)粒的形式導(dǎo)入所述受體。所述質(zhì)粒具體可為Addgene公司的質(zhì)粒pcDNA3.1-hAsCpf1。所述受體可為293T細(xì)胞。

所述e2)、所述e4)、所述e6)、所述e8)、所述e10)、所述e12)、所述e14)或所述e16)，具體可與編碼所述FnCpf1蛋白的基因?qū)胨鍪荏w。所述編碼所述FnCpf1蛋白的基因可通過質(zhì)粒的形式導(dǎo)入所述受體。所述質(zhì)粒具體可為Addgene公司的質(zhì)粒pcDNA3.1-hFnCpf1。所述受體可為293T細(xì)胞。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了定向編輯基因組的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)。

本發(fā)明所提供的定向編輯基因組的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的crRNA為修飾crRNA。

上述系統(tǒng)中，所述CRISPR/Cpf1系統(tǒng)為AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)或FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)。所述AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)來自Acidaminococcus_sp.BV3L6，其表達(dá)上述任一所述AsCpf1蛋白。所述FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)來自Francisella_novicida，其表達(dá)上述任一所述FnCpf1蛋白。

上述系統(tǒng)中，所述修飾的方式可為脫氧核糖核酸修飾。

上述系統(tǒng)中，所述脫氧核糖核酸修飾的方法可為：在所述crRNA的5’末端增加1～3個脫氧核糖核酸和/或3’末端增加1～3個脫氧核糖核酸。

上述系統(tǒng)中，所述脫氧核糖核酸修飾的方法具體可為a1)-a6)中的任一種：

a1)在所述crRNA的5’末端增加1個脫氧核糖核酸；

a2)在所述crRNA的5’末端增加2個脫氧核糖核酸；

a3)在所述crRNA的3’末端增加1個脫氧核糖核酸；

a4)在所述crRNA的3’末端增加2個脫氧核糖核酸；

a5)在所述crRNA的5’末端和3’末端各增加1個脫氧核糖核酸；

a6)在所述crRNA的5’末端和3’末端各增加2個脫氧核糖核酸。

上述系統(tǒng)中，所述脫氧核糖核酸具體可為胸腺嘧啶脫氧核苷酸。

上述系統(tǒng)中，所述“修飾crRNA”具體可為化學(xué)合成且具有修飾的crRNA。

實驗證明，化學(xué)合成的crRNA和化學(xué)合成且具有修飾的crRNA用于AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)或FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)均造成hAAVS1基因和THUMPD3-AS1基因的突變，即均有一定的基因編輯能力。與僅化學(xué)合成的crRNA相比，化學(xué)合成且具有修飾的crRNA的基因編輯能力更強。因此，修飾crRNA在利用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)進行基因編輯中具有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為T7E1突變檢測結(jié)果。

圖2為測序結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

質(zhì)粒pcDNA3.1-hAsCpf1和質(zhì)粒pcDNA3.1-hFnCpf1均為Addgene公司的產(chǎn)品，在下文中，質(zhì)粒pcDNA3.1-hAsCpf1簡稱為Y1681，質(zhì)粒pcDNA3.1-hFnCpf1簡稱為Y1682。

質(zhì)粒pU6gRNA為蘇州吉瑪基因股份有限公司的產(chǎn)品，質(zhì)粒pU6gRNA(環(huán)形)的核苷酸序列如序列表序列1所示。在下文中，質(zhì)粒pU6gRNA簡稱為Y523。

293T細(xì)胞為中國科學(xué)院細(xì)胞庫產(chǎn)品，目錄號為GNHu17。DMEM培養(yǎng)基和FBS均為Gibco公司的產(chǎn)品。細(xì)胞孔板為Corning公司的產(chǎn)品。Max酶為Vazyme公司產(chǎn)品，貨號為P505。Genomic DNA Extraction kit為Takara公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為#9765。Trypsin-EDTA Solution為Hyclone公司，貨號為SH30042.02。PBS緩沖液是用超純水稀釋PBS(10×)至10倍體積得到的；PBS(10×)為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品，貨號為E607016。OPTI-MEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為#31985-070。lipofectamine 2000為thermo fisher-invitrogen公司產(chǎn)品，貨號為11668-027。T7E1為T7E1突變檢測試劑盒中的組件；T7E1突變檢測試劑盒為蘇州吉瑪基因股份有限公司的產(chǎn)品。DNA Marker為Thermo Fisher公司產(chǎn)品，產(chǎn)品名稱為GeneRuler DNA Ladder Mix，貨號為SM0331。10×退火buffer：含10mM EDTA·2Na、1000mM NaCl的pH 8.0、100mM Tris-HCl緩沖液。

實施例1、化學(xué)合成且具有修飾的crRNA用于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用

選擇hAAVS1基因(Gene ID：54776)和THUMPD3-AS1基因(Gene ID：440944)作為檢測CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的基因編輯能力的靶基因。CRISPR/Cpf1系統(tǒng)具體為AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)或FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)。AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)來自Acidaminococcus_sp.BV3L6，其表達(dá)序列表中序列2所示的AsCpf1蛋白。FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)來自Francisella_novicida，其表達(dá)序列表中序列3所示的FnCpf1蛋白。

根據(jù)hAAVS1基因的核苷酸序列選擇靶序列Ⅰ，根據(jù)THUMPD3-AS1基因的核苷酸序列選擇靶序列Ⅱ。靶序列Ⅰ和靶序列Ⅱ的序列如下：

靶序列Ⅰ：5’-TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3’；

靶序列Ⅱ：5’-GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3’。

一、質(zhì)粒的構(gòu)建

1、質(zhì)粒Y1640的構(gòu)建

(1)用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒pU6gRNA，回收約2955bp的載體骨架。

(2)由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1640-S：

5’-CACCgTAATTTCTACTCTTGTAGATg-3’(單下劃線為As crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列Ⅰ，波浪線為終止序列)和引物Y1640-A：

5’-aattcATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(單下劃線為As crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列Ⅰ，波浪線為終止序列)，用去離子水分別將引物Y1640-S和引物Y1640-A稀釋至100μM，得到引物Y1640-S稀釋液和引物Y1640-A稀釋液；然后進行退火反應(yīng)，形成DNA分子Ⅰ。

退火體系：引物Y1640-S稀釋液5μL、引物Y1640-S稀釋液5μL、去離子水35μL、10×退火buffer 5μL。

退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。

(3)將載體骨架和DNA分子Ⅰ連接，得到質(zhì)粒Y1640。

根據(jù)測序結(jié)果，對質(zhì)粒Y1640進行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和EcoRⅠ識別序列間的片段(質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子Ⅰ。質(zhì)粒Y1640的核苷酸序列如序列表序列4所示。

2、質(zhì)粒Y1641的構(gòu)建

按照步驟1的方法，僅將DNA分子Ⅰ替換為DNA分子Ⅱ，其它步驟均不變，得到質(zhì)粒Y1641。

DNA分子Ⅱ的制備方法如下：由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1641-S：

5’-CACCgTAATTTCTACTCTTGTAGATg-3’(單下劃線為As crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列Ⅱ，波浪線為終止序列)和引物Y1641-A：

5’-aattcATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(單下劃線為As crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列Ⅱ，波浪線為終止序列)，用去離子水分別將引物Y1641-S和引物Y1641-A稀釋至100μM，得到引物Y1641-S稀釋液和引物Y1641-A稀釋液；然后進行退火反應(yīng)，形成DNA分子Ⅱ。

退火體系：引物Y1641-S稀釋液5μL、引物Y1641-S稀釋液5μL、去離子水35μL、10×退火buffer 5μL。

退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。

根據(jù)測序結(jié)果，對質(zhì)粒Y1641進行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和EcoRⅠ識別序列間的片段(質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子Ⅱ。

3、質(zhì)粒Y1642的構(gòu)建

按照步驟1的方法，僅將DNA分子Ⅰ替換為DNA分子Ⅲ，其它步驟均不變，得到質(zhì)粒Y1642。

DNA分子Ⅲ的制備方法如下：由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1642-S：

5’-CACCgTAATTTCTACTGTTGTAGATg-3’(單下劃線為Fn crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列Ⅰ，波浪線為終止序列)和引物Y1642-A：

5’-aattcATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(單下劃線為Fn crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列Ⅰ，波浪線為終止序列)，用去離子水分別將引物Y1642-S和引物Y1642-A稀釋至100μM，得到引物Y1642-S稀釋液和引物Y1642-A稀釋液；然后進行退火反應(yīng)，形成DNA分子Ⅲ。

退火體系：引物Y1642-S稀釋液5μL、引物Y1642-S稀釋液5μL、去離子水35μL、10×退火buffer 5μL。

退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。

根據(jù)測序結(jié)果，對質(zhì)粒Y1642進行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和EcoRⅠ識別序列間的片段(質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子Ⅲ。

4、質(zhì)粒Y1643的構(gòu)建

按照步驟1的方法，僅將DNA分子Ⅰ替換為DNA分子Ⅳ，其它步驟均不變，得到質(zhì)粒Y1643。

DNA分子Ⅳ的制備方法如下：由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1643-S：

5’-CACCgTAATTTCTACTGTTGTAGATg-3’(單下劃線為Fn crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列Ⅱ，波浪線為終止序列)和引物Y1643-A：

5’-aattcATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(單下劃線為Fn crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列Ⅱ，波浪線為終止序列)，用去離子水分別將引物Y1643-S和引物Y1643-A稀釋至100μM，得到引物Y1643-S稀釋液和引物Y1643-A稀釋液；然后進行退火反應(yīng)，形成DNA分子Ⅲ。

退火體系：引物Y1643-S稀釋液5μL、引物Y1643-S稀釋液5μL、去離子水35μL、10×退火buffer 5μL。

退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。

根據(jù)測序結(jié)果，對質(zhì)粒Y1643進行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和EcoRⅠ識別序列間的片段(質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子Ⅳ。

二、化學(xué)合成且具有修飾的crRNA的制備

合成表1中所示的crRNA，其中胸腺嘧啶脫氧核苷酸修飾指的是在crRNA的5’端和/或3’端增加1－2個胸腺嘧啶脫氧核苷酸，在表中用dT表示。表1中，單下劃線為As crRNA骨架序列自5’末端起第2至20位，虛線為Fn crRNA骨架序列自5’末端起第2至20位，雙下劃線為靶序列Ⅰ自5’末端起第1至21位，方框為靶序列Ⅱ自5’末端起第1至21位。

表1中所示的所有crRNA為均1OD(33μg)一管，每管中加入66μL DEPC水，得到濃度均為0.5μg/μL的RNA溶液。

表1.化學(xué)合成的crRNA或化學(xué)合成且具有修飾的crRNA的基本信息

三、檢測化學(xué)合成且具有修飾的crRNA用于AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的基因編輯能力

1、共轉(zhuǎn)染

(1)Y1681-Y1640-293T細(xì)胞組的獲得

質(zhì)粒Y1681和質(zhì)粒Y1640共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的步驟如下：

①將293T細(xì)胞置于裝有10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑為10cm)，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待293T細(xì)胞培養(yǎng)至80～90％融合時，棄培養(yǎng)基，用3mL PBS緩沖液洗滌兩次。

②完成步驟①后，向所述培養(yǎng)皿中加入1mL Trypsin-EDTA Solution，混勻，然后吸出液相，37℃靜置1～2min。

③完成步驟②后，向所述培養(yǎng)皿中加入2mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打形成單細(xì)胞懸液。

④完成步驟③后，將所述單細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔約接種2×10⁵個293T細(xì)胞，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

⑤完成步驟④后，將所述6孔板中的培養(yǎng)基更換為OPTI-MEM培養(yǎng)基，然后加入4μg質(zhì)粒Y1681和4μg質(zhì)粒Y1640，進行共轉(zhuǎn)染(共轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine2000，培養(yǎng)基為OPTI-MEM培養(yǎng)基，共轉(zhuǎn)染的步驟參考Lipofectamin2000說明書)，然后37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育6h，然后更換為新的OPTI-MEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18h。

⑥重復(fù)步驟⑤一次。

⑦完成步驟⑥后48h，收集細(xì)胞，然后用1mL PBS緩沖液洗滌一次。

⑧完成步驟⑦后，向所述培養(yǎng)皿中加入0.5mL Trypsin-EDTA Solution，混勻，然后吸出液相，37℃靜置1～2min。

⑨完成步驟⑧后，向所述培養(yǎng)皿中加入1mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打形成單細(xì)胞懸液；將該單細(xì)胞懸液1000rpm離心3min，得到沉淀1。

⑩完成步驟⑨后，向所述沉淀中加入1mL PBS緩沖液，1000rpm離心3min，得到沉淀2。

沉淀2即為質(zhì)粒Y1681和質(zhì)粒Y1640共轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞組，簡稱Y1681-Y1640-293T細(xì)胞組。

(2)Y1681-Y1641-293T細(xì)胞組的獲得

按照上述步驟(1)的方法，將質(zhì)粒Y1640替換為質(zhì)粒Y1641，其它步驟均不變，得到Y(jié)1681-Y1641-293T細(xì)胞組。

(3)Y1682-Y1642-293T細(xì)胞組的獲得

按照上述步驟(1)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，質(zhì)粒Y1640替換為質(zhì)粒Y1642，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-Y1642-293T細(xì)胞組。

(4)Y1682-Y1643-293T細(xì)胞組的獲得

按照上述步驟(1)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，質(zhì)粒Y1640替換為質(zhì)粒Y1643，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-Y1643-293T細(xì)胞組。

(5)Y1681-293T細(xì)胞組的獲得

質(zhì)粒Y1681轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的步驟如下：

①同步驟(1)中①。

②同步驟(1)中②。

③同步驟(1)中③。

④同步驟(1)中④。

⑤完成步驟④后，將所述6孔板中的培養(yǎng)基更換為OPTI-MEM培養(yǎng)基，然后加入4μg質(zhì)粒Y1681，進行轉(zhuǎn)染(共轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine 2000，培養(yǎng)基為OPTI-MEM培養(yǎng)基，共轉(zhuǎn)染的步驟參考Lipofectamin2000說明書)，然后37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育6h，然后更換為新的OPTI-MEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18h。

⑥重復(fù)步驟⑤一次。

⑦同步驟(1)中⑦。

⑧同步驟(1)中⑧。

⑨同步驟(1)中⑨。

⑩同步驟(1)中⑩。

步驟⑩獲得的沉淀即為質(zhì)粒Y1681轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞組，簡稱Y1681-293T細(xì)胞組。

(6)Y1682-293T細(xì)胞組的獲得

按照上述步驟(1)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-293T細(xì)胞組。

(7)Y1681-A1-293T細(xì)胞組的獲得

質(zhì)粒Y1683和A1共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的步驟如下：

①同步驟(1)中①。

②同步驟(1)中②。

③同步驟(1)中③。

④同步驟(1)中④。

⑤完成步驟④后，將所述6孔板中的培養(yǎng)基更換為OPTI-MEM培養(yǎng)基，然后加入4μg質(zhì)粒Y1681和2μg A1(即4μL)，進行共轉(zhuǎn)染(共轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine 2000，培養(yǎng)基為OPTI-MEM培養(yǎng)基，共轉(zhuǎn)染的步驟參考Lipofectamin2000說明書)，然后37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育6h，然后更換為新的OPTI-MEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18h。

⑥重復(fù)步驟⑤一次。

⑦同步驟(1)中⑦。

⑧同步驟(1)中⑧。

⑨同步驟(1)中⑨。

⑩同步驟(1)中⑩。

步驟⑩獲得的沉淀即為質(zhì)粒Y1683和A1共轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞，簡稱Y1683-A1-293T細(xì)胞組。

(8)Y1681-A3-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將A1替換為A3，其它步驟均不變，得到Y(jié)1681-A3-293T細(xì)胞組。

(9)Y1681-A5-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將A1替換為A5，其它步驟均不變，得到Y(jié)1681-A5-293T細(xì)胞組。

(10)Y1681-A7-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將A1替換為A7，其它步驟均不變，得到Y(jié)1681-A7-293T細(xì)胞組。

(11)Y1681-A9-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將A1替換為A9，其它步驟均不變，得到Y(jié)1681-A9-293T細(xì)胞組。

(12)Y1681-R1-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將A1替換為R1，其它步驟均不變，得到Y(jié)1681-R1-293T細(xì)胞組。

(13)Y1681-R3-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將A1替換為R3，其它步驟均不變，得到Y(jié)1681-R3-293T細(xì)胞組。

(14)Y1681-R5-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將A1替換為R5，其它步驟均不變，得到Y(jié)1681-R5-293T細(xì)胞組。

(15)Y1681-R7-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將A1替換為R7，其它步驟均不變，得到Y(jié)1681-R7-293T細(xì)胞組。

(16)Y1681-R9-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將A1替換為R9，其它步驟均不變，得到Y(jié)1681-R9-293T細(xì)胞組。

(17)Y1682-A2-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，將A1替換為A2，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-A2-293T細(xì)胞組。

(18)Y1682-A4-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，將A1替換為A4，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-A4-293T細(xì)胞組。

(19)Y1682-A6-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，將A1替換為A6，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-A6-293T細(xì)胞組。

(20)Y1682-A8-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，將A1替換為A8，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-A8-293T細(xì)胞組。

(21)Y1682-A10-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，將A1替換為A10，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-A10-293T細(xì)胞組。

(22)Y1682-R2-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，將A1替換為R2，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-R2-293T細(xì)胞組。

(23)Y1682-R4-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，將A1替換為R4，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-R4-293T細(xì)胞組。

(24)Y1682-R6-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，將A1替換為R6，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-R6-293T細(xì)胞組。

(25)Y1682-R8-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，將A1替換為R8，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-R8-293T細(xì)胞組。

(26)Y1682-R10-293T細(xì)胞的獲得

按照上述步驟(7)的方法，將質(zhì)粒Y1681替換為質(zhì)粒Y1682，將A1替換為R10，其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-R10-293T細(xì)胞組。

2、各細(xì)胞的基因組DNA的提取和PCR擴增產(chǎn)物的回收

(1)用Genomic DNA Extraction kit分別提取步驟1獲得的各細(xì)胞組的基因組DNA。

(2)完成步驟(1)后，以步驟(1)提取的Y1681-Y1640-293T細(xì)胞組、Y1681-293T細(xì)胞組、Y1681-Y1641-293T細(xì)胞組、Y1681-A1-293T細(xì)胞組、Y1681-A3-293T細(xì)胞組、Y1681-A5-293T細(xì)胞組、Y1681-A7-293T細(xì)胞組、Y1681-A9-293T細(xì)胞組、Y1681-R1-293T細(xì)胞組、Y1681-R3-293T細(xì)胞組、Y1681-R5-293T細(xì)胞組、Y1681-R7-293T細(xì)胞組或Y1681-R9-293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以hAAV-F：

5’-GGGTCACCTCTCACTCCTTTCAT-3’和hAAV-R：5’-ATCCTCTCTGGCTCCATCGTAAG-3’組成的引物，用Max酶進行PCR擴增，得到475bp的PCR擴增產(chǎn)物甲。

(3)完成步驟(1)后，以步驟(1)提取的Y1682-Y1642-293T細(xì)胞組、Y1682-293T細(xì)胞組、Y1682-Y1643-293T細(xì)胞組、Y1682-A2-293T細(xì)胞組、Y1682-A4-293T細(xì)胞組、Y1682-A6-293T細(xì)胞組、Y1682-A8-293T細(xì)胞組、Y1682-A10-293T細(xì)胞組、Y1682-R2-293T細(xì)胞組、Y1682-R4-293T細(xì)胞組、Y1682-R6-293T細(xì)胞組、Y1682-R8-293T細(xì)胞組或Y1682-R10-293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以hRosa26-F：

5’-AACCTCGACACCAACTCTAGTCC-3’和hRosa26-R：5’-TCTCACATGAGCGAAACCACTGC-3’組成的引物，用Max酶進行PCR擴增，得到670bp的PCR擴增產(chǎn)物乙。

3、T7E1突變檢測

(1)樣品的制備

①將PCR擴增產(chǎn)物甲進行膠回收，得到回收產(chǎn)物甲；將PCR擴增產(chǎn)物乙進行膠回收，得到回收產(chǎn)物乙。

②完成步驟①后，配制退火反應(yīng)體系：退火反應(yīng)體系包括回收產(chǎn)物甲或回收產(chǎn)物乙500ng、突變檢測buffer 2μL，用ddH₂O補至20μL。

③完成步驟②后，進行退火反應(yīng)。反應(yīng)條件為：首先98℃10min，然后緩慢降溫(降溫速度<1℃/10s)至25℃，最后25℃5min。

完成步驟③后的退火反應(yīng)體系即為制備的樣品。

(2)T7E1處理

取步驟(1)制備的樣品20μL，加入0.5μL T7E1，得到處理體系；然后37℃條件下反應(yīng)30min。

(3)電泳分析和結(jié)果判斷

將完成步驟(2)的處理體系用濃度為2％的瓊脂糖凝膠電泳分析，然后進行如下結(jié)果判斷：

如果PCR擴增產(chǎn)物甲可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為198bp和277bp、說明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成hAAVS1基因的突變；如果PCR擴增產(chǎn)物甲被T7EⅠ酶切后的大小無明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成hAAVS1基因的突變；

如果PCR擴增產(chǎn)物乙可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為286bp和384bp、說明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成THUMPD3-AS1基因的突變；如果PCR擴增產(chǎn)物乙被T7EⅠ酶切后的大小無明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成THUMPD3-AS1基因的突變。

T7E1突變檢測實驗結(jié)果見圖1(左上圖為AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的hAAVS1基因的突變檢測結(jié)果，其中M為DNA Marker，“－”為Y1681-293T細(xì)胞組，“+”為Y1681-Y1640-293T細(xì)胞組，A1為Y1681-A1-293T細(xì)胞組，A3為Y1681-A3-293T細(xì)胞組，A5為Y1681-A5-293T細(xì)胞組，A7為Y1681-A7-293T細(xì)胞組，A9為Y1681-A9-293T細(xì)胞組；左下圖為AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的THUMPD3-AS1基因的突變檢測結(jié)果，其中M為DNA Marker，“－”為Y1681-293T細(xì)胞組，“+”為Y1681-Y1641-293T細(xì)胞組，R1為Y1681-R1-293T細(xì)胞組，R3為Y1681-R3-293T細(xì)胞組，R5為Y1681-R5-293T細(xì)胞組，R7為Y1681-R7-293T細(xì)胞組，R9為Y1681-R9-293T細(xì)胞組；右上圖為FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的hAAVS1基因的突變檢測結(jié)果，其中M為DNA Marker，“－”為Y1682-293T細(xì)胞組，“+”為Y1682-Y1642-293T細(xì)胞組，A2為Y1682-A2-293T細(xì)胞組，A4為Y1682-A4-293T細(xì)胞組，A6為Y1682-A6-293T細(xì)胞組，A8為Y1682-A8-293T細(xì)胞組，A10為Y1682-A10-293T細(xì)胞組；右下圖為FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的THUMPD3-AS1基因的突變檢測結(jié)果，其中M為DNA Marker，“－”為Y1682-293T細(xì)胞組，“+”為Y1682-Y1643-293T細(xì)胞組，R2為Y1682-R2-293T細(xì)胞組，R4為Y1682-R4-293T細(xì)胞組，R6為Y1682-R6-293T細(xì)胞組，R8為Y1682-R8-293T細(xì)胞組，R10為Y1682-R10-293T細(xì)胞組)。

結(jié)果表明，化學(xué)合成的crRNA和化學(xué)合成且具有修飾的crRNA用于AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)或FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)均造成hAAVS1基因和THUMPD3-AS1基因的突變，但與僅化學(xué)合成的crRNA相比，化學(xué)合成且具有修飾的crRNA的基因編輯能力更強。

4、PCR擴增產(chǎn)物甲和PCR擴增產(chǎn)物乙的測序

將步驟2中(2)得到的PCR擴增產(chǎn)物甲進行測序，引物為hAAV-ce：

5’-cagctcccctaccccccttac-3’。將步驟2中(3)得到的PCR擴增產(chǎn)物乙進行測序，引物為hRosa26-ce：5’-cgcccagggaccaagttagc-3’。測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

測序結(jié)果見圖2(A為AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)中hAAVS1基因的測序結(jié)果，其中AsCpf1為Y1681-293T細(xì)胞組，AsCpf1+Plasmid AAVS1crRNA為Y1681-Y1640-293T細(xì)胞組，AsCpf1+A1為Y1681-A1-293T細(xì)胞組，AsCpf1+A3為Y1681-A3-293T細(xì)胞組，AsCpf1+A5為Y1681-A5-293T細(xì)胞組，AsCpf1+A7為Y1681-A7-293T細(xì)胞組，AsCpf1+A9為Y1681-A9-293T細(xì)胞組；B為FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)的hAAVS1基因的測序結(jié)果，其中AsCpf1為Y1682-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+Plasmid AAVS1crRNA為Y1682-Y1642-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+A2為Y1682-A2-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+A4為Y1682-A4-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+A6為Y1682-A6-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+A8為Y1682-A8-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+A10為Y1682-A10-293T細(xì)胞組；C為AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)中THUMPD3-AS1基因的測序結(jié)果，其中AsCpf1為Y1681-293T細(xì)胞組，AsCpf1+Plasmid THUMPD3AS1crRNA為Y1681-Y1641-293T細(xì)胞組，AsCpf1+R1為Y1681-R1-293T細(xì)胞組，AsCpf1+R3為

Y1681-R3-293T細(xì)胞組，AsCpf1+R5為Y1681-R5-293T細(xì)胞組，AsCpf1+R7為

Y1681-R7-293T細(xì)胞組，AsCpf1+R9為Y1681-R9-293T細(xì)胞組；D為FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)中THUMPD3-AS1基因的測序結(jié)果，其中FnCpf1為Y1682-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+Plasmid THUMPD3Fn1crRNA為Y1682-Y1643-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+R2為Y1682-R2-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+R4為Y1682-R4-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+R6為Y1682-R6-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+R8為Y1682-R8-293T細(xì)胞組，F(xiàn)nCpf1+R10為Y1682-R10-293T細(xì)胞組)。

結(jié)果表明，化學(xué)合成的crRNA和化學(xué)合成且具有修飾的crRNA用于AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)或FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)均造成hAAVS1基因和THUMPD3-AS1基因的突變，但與僅化學(xué)合成的crRNA相比，化學(xué)合成且具有修飾的crRNA的基因編輯能力更強。