本發(fā)明涉及一種小RNA(microRNA)，負(fù)調(diào)控鹿茸的癌樣生長。

背景技術(shù)：

在哺乳動物中，只有鹿茸角是目前所知唯一具有表形態(tài)再生能力的器官，即在失去后還能完全再生出來(如圖1，2)。在再生周期里，鹿茸從頂部生長點(diǎn)平均每天延伸1-2cm。所以有人稱鹿茸的生長是“癌樣”(cancer-like)生長。隨著近年來大量促癌因子，如TNFα、KGF等的發(fā)現(xiàn)，這種認(rèn)為鹿茸癌樣生長的觀點(diǎn)已經(jīng)得到分子水平證據(jù)的支持。可值得注意的是腫瘤和癌癥組織很少自愈，而鹿茸會在近百天的的癌樣生長后最終自動停止，茸性皮膚會慢慢死亡脫落。這種鹿茸茸皮癌樣生長后停止的過程中一定存在負(fù)調(diào)控因子起作用。

MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)生的、重要的基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，通過調(diào)節(jié)目標(biāo)mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率來表現(xiàn)其功能。這些小RNA長度為20-24個核苷酸、來源于長的具有發(fā)卡樣二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄子，并被兩種核酸內(nèi)切酶Drosha和Dicer剪切。具體過程：miRNA首先由細(xì)胞核內(nèi)的核糖核酸酶Drosha產(chǎn)生，此酶將在基因中編碼的初級miRNA(primary miRNA，pri-miRNA)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)加工成前體miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)，60-70核苷酸長。然后通過輸出蛋白5(esportin-5)將pre-miRNA轉(zhuǎn)位輸出到細(xì)胞質(zhì)，并在另一種RNAIII，Dicer的作用下形成雙鏈的miRNA。

RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)包含AGO(argonaut)蛋白，組成miRNA雙鏈。其中一條鏈形成成熟的miRNA而另一條鏈降解。成熟miRNA蛋白復(fù)合體通過與mRNA的3’UTR區(qū)目標(biāo)位點(diǎn)結(jié)合，而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制或者降解mRNA決定于成熟miRNA和目標(biāo)mRNA互補(bǔ)程度。

一個miRNA的選擇性活性依賴于與這個同源mRNA互補(bǔ)的miRNA的種子序列(seed region)。因?yàn)閙icroRNA種子內(nèi)的不完美堿基配對代表這個核心5-7核苷酸序列可以潛在識別結(jié)合很多的mRNA序列，種子序列通常在基因組中重復(fù)并且同時調(diào)控幾百個目標(biāo)mRNA。然而，miRNA影響單個蛋白水平相對溫和，盡管如此，在一個通路中通過一個miRNA同時調(diào)節(jié)幾個基因的狀況對于源于這個通路的生物學(xué)過程是有一個積累效應(yīng)的。

越來越多的證據(jù)表明miRNA在許多細(xì)胞增殖、分化、形態(tài)發(fā)生和腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過程中起非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。眾所周知，miRNA參與調(diào)節(jié)腫瘤起始和進(jìn)展，并通過抑制目標(biāo)基因起到癌基因或腫瘤抑制的功能。到目前，越來越多的miRNA被證明在癌癥發(fā)生過程中起非常重要的作用，這說明miRNA可以作為治療癌癥的潛在新靶標(biāo)。

SOX9(transcription factor sex-determining region Y(SRY)-box 9protein)屬于SOX家族，是雄性決定、軟骨形成、神經(jīng)形成和神經(jīng)嵴發(fā)育、干細(xì)胞形成等發(fā)育進(jìn)程中的一個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。多項研究證實(shí)，SOX9在細(xì)胞增殖和細(xì)胞生存中起決定性作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明確定了東北馬鹿(Cervus elaphus)鹿茸茸皮這種快速增長細(xì)胞起抑制作用的因子，并確定這種負(fù)調(diào)控因子的名稱、序列。本發(fā)明從馬鹿鹿茸茸皮組織的microRNA數(shù)據(jù)庫中篩選得到的microRNA，PC-5p-1090(以下簡稱PC-1090)，是一種在茸皮中特異性表達(dá)的miRNA，為24nt，軟骨組織中無法檢測到該成熟miRNA。序列如SEQ ID NO：1所示(CACUGACUGGCUCAGCGUGUGCCU)。

本發(fā)明經(jīng)過Hela、U2OS、293T等細(xì)胞的細(xì)胞增殖檢測和Western Blotting等實(shí)驗(yàn)證明PC-1090下調(diào)細(xì)胞增殖關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SOX9的表達(dá)(圖4、5所示)，可抑制細(xì)胞增殖(圖6所示)。

本發(fā)明包含以下有益效果：

作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，microRNA在細(xì)胞生長、器官發(fā)育、個體生長及各種疾病的進(jìn)程中都起到非常重要的作用。因此，從快速生長的鹿茸頂端茸皮組織中分離出來的microRNA序列對鹿茸的癌樣生長及自動終止會起非常重要的調(diào)控作用。

為此，本發(fā)明從快速生長期的新生馬路鹿茸頂端茸皮組織microRNA測序結(jié)果中得到一個miRNA，PC-1090，其轉(zhuǎn)錄前體長約120nt，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，成熟miRNA全長24nt(GenBank登陸號:KJ179845)，在miRBase數(shù)據(jù)庫(Release 21)中無同源序列。BLAST結(jié)果顯示，無論是成熟miRNA全長還是其seed序列，在人、小鼠、大鼠、狗、雞、豬等模式物種基因組中均無同源序列。僅在牛(Bos taurus)第11號染色體上有成熟miRNA的同源序列，相似性100％。

通過TargetScan預(yù)測鹿茸茸皮發(fā)育的關(guān)鍵性因子SOX9是PC-1090的靶基因之一，通過PC-1090mimics實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PC-1090對SOX9具有靶向作用，在U2OS、293T等細(xì)胞中證明了PC-1090具有高效下調(diào)SOX9蛋白的作用(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、5所示)，并抑制細(xì)胞增殖(實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示)。

本發(fā)明篩選的基因序列如下：

名稱：PC-5p-1090

序列：CACUGACUGGCUCAGCGUGUGCCU。

附圖說明

圖1為馬鹿鹿茸表形態(tài)再生周期圖。其中，箭頭所指為鹿茸頂端增生區(qū)；

圖2為鹿茸快速生長期頂端增生區(qū)軸向縱切圖和茸皮組織結(jié)構(gòu)圖；其中，左側(cè)為軸向縱切圖，右側(cè)為茸皮組織結(jié)構(gòu)圖，E為上皮，D為真皮層，RM為間充質(zhì)層，CA為未礦化軟骨區(qū)，H為毛囊，S為皮脂腺；圖中箭頭所指處可見軟骨中紅色血管；

圖3為多種模式生物SOX9mRNA 3’UTR區(qū)具有潛在的PC-1090的seed序列(小寫加下劃線序列)互補(bǔ)結(jié)合保守位點(diǎn)(框內(nèi)序列)；

圖4為PC-1090mimics下調(diào)U2OS細(xì)胞內(nèi)源SOX9蛋白水平圖；內(nèi)參為GAPDH；

圖5為PC-1090mimics可下調(diào)293T細(xì)胞pMIR-SOX9-3UTR-Luc載體表達(dá)熒光素酶；內(nèi)參為GAPDH，實(shí)驗(yàn)設(shè)pMIR-Luc空白質(zhì)粒(ev)對照；

圖6為CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染PC-1090mimics后以24小時為間隔的Hela細(xì)胞增殖活性圖；其中，A為PC-1090-NC陰性對照活性曲線；B為PC-1090mimics活性曲線。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的一種調(diào)節(jié)鹿茸茸皮快速生長的microRNA，它命名為：PC-5p-1090，其序列為CACUGACUGGCUCAGCGUGUGCCU(如Seq ID No：1所示)。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式的一種調(diào)節(jié)鹿茸茸皮快速生長的microRNA的應(yīng)用，抑制促進(jìn)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SOX9表達(dá)。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式的一種調(diào)節(jié)鹿茸茸皮快速生長的microRNA的應(yīng)用，它具有抑制細(xì)胞增殖功能。

本發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個或幾個具體實(shí)施方式的組合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。

通過以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑公司購買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

實(shí)施例1、鹿茸茸皮PC-1090的獲取過程

1)材料獲?。簩?shí)驗(yàn)所用材料為處于快速增長期約70天的東北馬鹿鹿茸茸皮組織(圖2所示)。鋸茸后立即用消毒的剪刀將鹿茸頂端組織切成厚度小于0.5cm的片狀，立即放入裝有防止RNA降解的保護(hù)液(RNAlater)中，置于低溫保存箱中并帶回實(shí)驗(yàn)室保存。

2)mRNA的提?。簩?shí)驗(yàn)室保存鹿茸的茸皮組織分離后稱取30mg，在超凈工作臺中快速切碎置于無菌1.5mL試管中，利用QIAGEN公司(德國)試劑盒DNeasy Blood&Tissue Kit(Cat.No.69504)提取鹿茸茸皮中的總RNA，并將提取的總RNA最終溶解于RNAse-free的水中，提取的總RNA經(jīng)過分光光度檢測均具有較高的質(zhì)量(OD260nm/OD280nm：1.75-1.86)。

3)鹿茸茸皮small RNA高通量測序：將提取的總RNA遞交到美國聯(lián)川公司(杭州)通過Illumina miRNA Solexa測序平臺進(jìn)行鹿茸茸皮組織small RNAs文庫進(jìn)行高通量測序后，用ACGT101-miRv4.2(LC Sciences)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

4)鹿茸茸皮新miRNAPC-1090的獲取：對鹿茸茸皮組織的small RNA文庫分別進(jìn)行Solexa深度測序后獲得序列原始數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，得到一種新miRNA，PC-1090，其序列不能比對到miRBase牛的miRNAs前體(pre-miRNAs)，但是測得序列(已知的成熟體)可以比對到基因組上，而且延伸的基因組序列可以形成合格的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

5)靶基因預(yù)測：通過TargetScan預(yù)測PC-1090的靶基因之一為調(diào)節(jié)茸皮快速增長的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SOX9。

實(shí)施例2、PC-1090在細(xì)胞水平上能夠下調(diào)促細(xì)胞增殖關(guān)鍵性因子SOX9表達(dá)

1)PC-1090合成：將PC-1090序列遞交到上海吉瑪公司合成mimics和相應(yīng)的Negative Control(NC)。

2)構(gòu)建SOX9-3’UTR-pMIR-REPORT載體：序列比對分析得知多種模式生物Sox9mRNA 3’UTR區(qū)具有潛在的PC-1090seed序列(小寫加下劃線序列)互補(bǔ)結(jié)合保守位點(diǎn)(框內(nèi)序列)(圖3所示)。因此，本實(shí)施例根據(jù)小鼠SOX9的3’UTR區(qū)克隆了339bp的片段插入到pMIR-REPORT(Applied Biosystems公司，美國)載體中，其中插入片段包含PC-1090種子序列的互補(bǔ)序列，插入片段(如Seq ID No：2所示)如下：

caatgttttcagccatagacctttgggtctgcctggactgtatgtggatgtgtgcgtgtgttgtgacacgggacaacacatgcctctgcaagtgtgtgtgccgtggatagccccttggctgctctcctgcagagagacatcggacagaccttaattcttactcactgctgtggctggagagtataaggaatgctttttctttttttctttctttctttcttttttttttttaagacagcagtctttttttttaatttaaaaaaaaaaagatatattaacagttttagaagtcagtagaataaaaccttaaagcgttcttataatatggcatctttcgcg。

pMIR-REPORT載體是ABI公司(美國)設(shè)計的將一個miRNA的靶序列插入到多克隆位點(diǎn)中，pMIR-REPORT的熒光素酶蛋白Luciferase報告載體可以用來定性和定量衡量miRNA的功能。當(dāng)PC-1090mimics和SOX9-3’UTR-pMIR-REPORT載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，如果Luciferase蛋白表達(dá)下調(diào)，說明PC-1090對SOX9表達(dá)有下調(diào)作用。

3)細(xì)胞培養(yǎng)：293T細(xì)胞和U2OS細(xì)胞均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，培養(yǎng)基：293T細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM(Gibco，美國)，U2OS細(xì)胞培養(yǎng)基為McCoy's 5A(Modified)Medium(Gibco，美國)，均添加10％的胎牛血清(Gibco，美國)和100U/mL的雙抗(Invetrogen公司，美國)。置于37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)。

4)轉(zhuǎn)染與Western檢測：細(xì)胞以8×10⁵個/孔種于6孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)36小時，細(xì)胞匯合度達(dá)到70％-80％，以Lipofectmin3000(Invetrogen公司，美國)為介導(dǎo)，將合成的PC-1090的mimics和SOX9-3’UTR-pMIR-REPORT載體對U2OS細(xì)胞、293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒量為2ug/孔。40～48小時后收細(xì)胞，對蛋白進(jìn)行變性處理后，利用4％-12％的PAGE預(yù)制膠(Invitrogen公司，美國)電泳。轉(zhuǎn)硝酸纖維膜后，用5％脫脂奶粉的TBST混合液封閉2小時，然后硝酸纖維膜分別在SOX9一抗(Santa Cruz Biotechnology公司，美國)(圖4)或Luciferase一抗(Santa Cruz Biotechnology公司，美國)(圖5)中孵育2小時以上，熒光標(biāo)記的二抗(Licor Bioscience，美國)中孵育1小時，以GAPDH(Santa Cruz Biotechnology公司，美國)為內(nèi)參，Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃膜。檢測結(jié)果表明PC-1090有效下調(diào)SOX9的表達(dá)(圖4、5所示)。

實(shí)施例3、PC-1090在細(xì)胞水平上具有抑制細(xì)胞增殖功能

1)細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：Hela細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，培養(yǎng)基為DMEM(Gibco，美國)，培養(yǎng)方法同實(shí)施例2中3)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染同實(shí)施例2中的4)。

2)細(xì)胞活性檢測：利用CCK-8(上海碧云天)試劑盒檢測PC-1090mimic/NC轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后的增殖情況，每隔24小時對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。檢測結(jié)果表明相比對照組(NC)，PC-1090mimics的Hela細(xì)胞增殖受到抑制(圖6所示)。