本發(fā)明涉及一種羅丹明-胍基苯并咪唑功能化的光敏探針及其在Sn(IV)檢測(cè)方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

錫是大名鼎鼎的“五金”——金、銀、銅、鐵、錫之一，與日常生活、工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境科學(xué)、藥物和生命科學(xué)均有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。在生產(chǎn)和生活中，錫常用來(lái)制造合金，應(yīng)用廣泛。同時(shí)，錫是人體必須的微量元素之一，Sn(IV)廣泛存在于腎上腺、肝臟、脾臟、大腦及甲狀腺中，與人體生長(zhǎng)和癌癥預(yù)防息息相關(guān)。今年來(lái)，錫的廣泛使用帶來(lái)了多種與之相關(guān)的環(huán)境和生理問(wèn)題。人體缺Sn(IV)將影響生長(zhǎng)發(fā)育、聽(tīng)力及疾病抵抗力，其含量過(guò)多則會(huì)引起眼睛及皮膚刺激、頭痛、眩暈、呼吸困難、肝損傷、胃腸疾病如惡心、腹痛、嘔吐等，嚴(yán)重的甚至?xí)p傷免疫系統(tǒng)和染色體。因此，對(duì)環(huán)境和生物樣品中Sn(IV)的實(shí)時(shí)檢測(cè)已成為一項(xiàng)備受矚目的工作，具有極其重要的科研和實(shí)際意義。

相比于傳統(tǒng)的原子發(fā)射光譜、原子吸收光譜等需要大型儀器設(shè)備且操作復(fù)雜生物親和性差的方法，熒光化學(xué)標(biāo)記和功能分子探針技術(shù)以其優(yōu)良的特異性識(shí)別檢測(cè)性能和良好的環(huán)境生物相容性迅速占領(lǐng)科學(xué)研究的制高點(diǎn)，并被廣泛用于生物體系靶向識(shí)別和環(huán)境物質(zhì)定向監(jiān)測(cè)，凸顯出強(qiáng)勁的應(yīng)用發(fā)展前景，已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域不可或缺的重要手段之一，開(kāi)創(chuàng)了眾多交叉科學(xué)研究的新突破。

熒光探針?lè)肿右话阌删哂行盘?hào)輸出功能的熒光團(tuán)和具有反應(yīng)識(shí)別作用功能團(tuán)構(gòu)成，當(dāng)探針?lè)肿佑龅教囟ǖ碾x子或小分子時(shí)，功能團(tuán)與識(shí)別離子發(fā)生特異性識(shí)別，進(jìn)而發(fā)生從識(shí)別基團(tuán)向信號(hào)輸出基團(tuán)的信號(hào)轉(zhuǎn)換而對(duì)識(shí)別離子進(jìn)行識(shí)別檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種羅丹明-胍基苯并咪唑功能化的光敏探針。

本發(fā)明的另一目的是提供上述探針對(duì)生物樣品中Sn(IV)檢測(cè)方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過(guò)程如下：

羅丹明基熒光探針的結(jié)構(gòu)如結(jié)構(gòu)式(I)所示：

上述羅丹明基熒光探針的合成路線如下：

首先，在1,2-二氯乙烷為溶劑的條件下，通過(guò)羅丹明B和POCl₃反應(yīng)得到羅丹明B酰氯。然后，以乙腈為溶劑、三乙胺為縛酸劑，通過(guò)羅丹明B酰氯與2-胍基苯并咪唑反應(yīng)即可得到目標(biāo)產(chǎn)物。

上述羅丹明基熒光探針檢測(cè)Sn(IV)的原理如下：

在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中，探針溶液本身是無(wú)色無(wú)熒光狀態(tài)，當(dāng)向溶液中加入Sn(IV)后，Sn(IV)將會(huì)和探針胍基和苯并咪唑基團(tuán)中的N原子發(fā)生配位作用進(jìn)而使探針內(nèi)酰胺基團(tuán)發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)使溶液變?yōu)樽霞t色并產(chǎn)生橙紅色熒光，其最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)分別為559 nm和581 nm。通過(guò)測(cè)定探針熒光紫外吸收和熒光發(fā)射強(qiáng)度變化，達(dá)到測(cè)定Sn⁴⁺濃度和分布狀況的目的。

在眾多的功能團(tuán)中，苯并咪唑化合物集高活性、芳香性、易修飾性、富電子性及生物親和性等特性于一身，是理想的熒光探針功能團(tuán)。本發(fā)明應(yīng)用胍基苯并咪唑作為識(shí)別團(tuán)，結(jié)合性能優(yōu)良的羅丹明B發(fā)光團(tuán)，設(shè)計(jì)合成可應(yīng)用于環(huán)境和生物樣品中Sn(IV)檢測(cè)的功能型熒光探針，該探針對(duì)SnCl₄和其他有機(jī)錫(IV)化合物包括：一丁基三氯化錫、二丁基二氯化錫、三丁基氯化錫和四丁基錫均表現(xiàn)出良好的選擇性響應(yīng)性能，并且具有水溶性優(yōu)良、檢測(cè)靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間短、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、抗干擾性強(qiáng)、適用pH范圍寬和檢測(cè)濃度范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可用于和生物樣品中Sn(IV)的濃度和分布情況檢測(cè)，顯示出較強(qiáng)的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為該探針的單晶結(jié)構(gòu)圖；

圖2為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的離子選擇性紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)D；

圖3為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的離子選擇性熒光發(fā)射光譜圖；

圖4為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的對(duì)有機(jī)錫(IV)化合物選擇性的紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)D；

圖5為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的對(duì)有機(jī)錫(IV)化合物選擇性的熒光發(fā)射光譜圖；

圖6為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的抗干擾能力紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)D；

圖7為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的抗干擾能力熒光發(fā)射光譜圖；

圖8為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的紫外可見(jiàn)吸收滴定圖；

圖9為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的熒光發(fā)射光譜滴定圖；

圖10為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的紫外可見(jiàn)吸收強(qiáng)度隨Sn(IV)濃度的變化圖；

圖11為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨Sn(IV)濃度的變化圖；

圖12為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的紫外可見(jiàn)吸收強(qiáng)度與Sn(IV)濃度的線性關(guān)系圖；

圖13為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨Sn(IV)濃度的線性關(guān)系圖；

圖14為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的紫外可見(jiàn)吸收發(fā)射強(qiáng)度隨pH的變化圖；

圖15為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨pH的變化圖；

圖16為該探針在不同溶劑中紫外可見(jiàn)吸收強(qiáng)度的變化圖；

圖17為該探針在不同溶劑中熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化圖；

圖18為該探針在不同比例的EtOH-H₂O溶劑中的紫外可見(jiàn)吸收強(qiáng)度的變化圖；

圖19為該探針在不同比例的EtOH-H₂O溶劑中的熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化圖；

圖20為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中與Sn(IV)的配位比測(cè)定的紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)D；

圖21為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中與Sn(IV)的配位比測(cè)定的熒光發(fā)射光譜圖；

圖22為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中加入Sn(IV)后的時(shí)間響應(yīng)紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)D；

圖23為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中加入Sn(IV)后的時(shí)間響應(yīng)熒光發(fā)射光譜圖；

圖24為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中加入Sn(IV)后的可逆性檢測(cè)紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)D；

圖25為該探針在EtOH-H₂O (5:5, v/v)溶劑中加入Sn(IV)后的可逆性檢測(cè)熒光發(fā)射光譜圖；

圖26為該探針在活的L929細(xì)胞和MG-63細(xì)胞中對(duì)Sn(IV)檢測(cè)的細(xì)胞成像圖。

具體實(shí)施方式

為了更加清楚的理解本發(fā)明，下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1：探針的合成

在干燥的1000 ml圓底燒瓶中加入0.4780 g (0.001 mol)羅丹明B，加入5 mL干燥的1,2-二氯乙烷作為溶劑，然后向其中加入0.5 mL 三氯氧磷，連接回流冷凝、干燥管和尾氣吸收裝置，加熱回流反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除溶劑，得到深紅色干燥或粘稠狀物質(zhì)。

向反應(yīng)瓶中加入5 mL干燥的乙腈作為溶劑，然后稱量0.1750 g (0.001 mol) 2-胍基苯并咪唑，將其溶解5 mL干燥的乙腈中，并向其中加入3 mL三乙胺，在攪拌下30 min內(nèi)將其緩慢滴加到反應(yīng)瓶中，滴加過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量白色煙霧并劇烈放熱。連接回流冷凝、干燥管和尾氣吸收裝置，加熱回流反應(yīng)6-8 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除溶劑，向其中加入10 mL二氯甲烷和10 mL蒸餾水，攪拌15 min。然后將其倒入分液漏斗中，并用二氯甲烷萃取。合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鎂干燥30 min。然后將有機(jī)相濃縮并用二氯甲烷-甲醇(60:1, v:v)作為洗脫劑柱色譜進(jìn)行分離，得到淡黃色固體0.7361 g，產(chǎn)率80.7%。

m.p.：272—273 oC；E.A. (%): H, 6.18; C, 72.30; N, 16.29. 理論值：H, 6.22; C, 72.10; N, 16.35。IR (KBr, υ/cm^-1)：3433.2, 3377.3, 3064.8, 3016.6, 2966.4, 2927.9, 1689.6, 1633.7, 1614.4, 1517.9, 1452.4, 1319.3, 1269.1, 1220.9, 1151.5, 1118.7, 815.8, 785.0, 758.0。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, TMS): 9.46 (s, 1H), 8.94 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.99 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.56 (dt, J = 23.2, 7.0 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 18.8, 7.0 Hz, 2H), 7.11 – 6.98 (m, 2H), 6.40 (dd, J = 23.4, 5.5 Hz, 4H), 6.17 (dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 2H), 3.30 (dd, J = 13.9, 6.9 Hz, 8H), 1.12 (t, J = 7.0 Hz, 12H)。

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, TMS): δ: 164.69, 150.24, 148.57, 147.46, 145.11, 143.06, 137.05, 129.00, 125.75, 124.16, 122.97, 122.31, 119.25, 117.74, 115.39, 115.16, 111.57, 103.23, 102.66, 101.36, 91.33, 61.30, 38.69, 7.01。

MS: 600.3187 [M+H]⁺. 理論值：600.3089。

單晶結(jié)構(gòu)(圖1)：?jiǎn)涡本?，Pbca空間點(diǎn)群，晶胞參數(shù)：a = 11.8726(17) ?, b = 23.890(3) ?, c = 25.006(3) ? ; α = 90.00 o, β = 90.00 o, γ = 90.00 o。

實(shí)施例2：探針的離子選擇性測(cè)定

以EtOH-H₂O (5:5, v/v)為溶劑準(zhǔn)確配置探針濃度為10 μM，分別與5倍當(dāng)量的各種金屬離子混合后的溶液，測(cè)定其紫外吸收光譜及在540 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜，測(cè)定結(jié)果如圖2和圖3所示?？梢钥闯?，該探針只對(duì)Sn(IV)表現(xiàn)出明顯的選擇性響應(yīng)，對(duì)其他離子均無(wú)明顯響應(yīng)。

以EtOH-H₂O (5:5, v/v)為溶劑準(zhǔn)確配置探針濃度為10 μM，分別與5倍當(dāng)量的各種有機(jī)錫(IV)化合物混合后的溶液，測(cè)定其紫外吸收光譜及在540 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜，測(cè)定結(jié)果如圖4和圖5所示?？梢钥闯?，該探針對(duì)所有的有機(jī)錫(IV)化合物同樣表現(xiàn)出明顯的選擇性響應(yīng)。

實(shí)施例3：探針的抗干擾能力測(cè)定

以EtOH-H₂O (5:5, v/v)為溶劑準(zhǔn)確配置探針濃度為10 μM，先與5倍當(dāng)量的Sn(IV)混合，再分別與5倍當(dāng)量的各種干擾離子混合后的溶液，測(cè)定其紫外吸收光譜及在540 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜，測(cè)定結(jié)果如圖6和圖7所示?？梢钥闯觯鼵u(II)因其天然順磁性引起的熒光淬滅外，該探針對(duì)Sn(IV)的測(cè)定基本不受其他共存離子的干擾。

實(shí)施例4：探針的滴定和檢測(cè)范圍測(cè)定

以EtOH-H₂O (5:5, v/v)為溶劑準(zhǔn)確配置探針濃度為10 μM，分別與0-5.0倍當(dāng)量的Sn(IV)混合后的溶液，測(cè)定其紫外吸收光譜及在540 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜測(cè)定結(jié)果如圖8和圖9所示。可以看出，該探針熒光發(fā)射強(qiáng)度與Sn(IV)濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，在0.06 μmol·L^-1 - 50 μmol·L^-1的范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.03 μmol·L^-1 (圖10-圖13)。

實(shí)施例5：探針的適用pH范圍測(cè)定

以EtOH-H₂O (5:5, v/v)為溶劑分別準(zhǔn)確配置在不同pH值下，探針濃度為10 μM的純探針和探針與5倍當(dāng)量的Sn(IV)混合的兩組溶液，測(cè)定其紫外吸收光譜及在540 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜，測(cè)定結(jié)果如圖14和圖15所示?？梢钥闯?，該探針適用于pH值為5.0-8.0的體系中Sn(IV)的檢測(cè)。

實(shí)施例6：探針溶劑選擇性測(cè)定

分別以不同混合溶劑準(zhǔn)確配置濃度為10 μM的探針和5倍當(dāng)量的Sn(IV)的混合溶液，測(cè)定其紫外吸收光譜及在540 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜，測(cè)定結(jié)果如圖16和圖17所示?？梢钥闯?，使用不同有機(jī)溶劑和水混合溶劑體系時(shí)，探針在EtOH-H₂O和MeOH-H₂O混合溶劑體系中的檢測(cè)響應(yīng)情況較好，而其他溶劑體系的響應(yīng)都比較小。由于EtOH相比于MeOH不僅響應(yīng)強(qiáng)度較強(qiáng)，而且毒性和對(duì)環(huán)境及生物體的傷害也較小，因此，EtOH-H₂O混合溶劑被選作測(cè)試的溶劑體系。

分別以不同比例的EtOH-H₂O混合溶劑準(zhǔn)確配置濃度為10 μM的探針和5倍當(dāng)量的Sn(IV)的混合溶液，測(cè)定其紫外吸收光譜及在540 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜，測(cè)定結(jié)果如圖18和圖19所示?？梢钥闯?，隨著溶劑體系中EtOH含量的增加，探針的紫外吸收和熒光發(fā)射強(qiáng)度均有所增強(qiáng)。本實(shí)例中選擇EtOH-H₂O (5:5, v/v)體系作為光學(xué)測(cè)試溶劑。

實(shí)施例7：探針與離子的配位比測(cè)定

以EtOH-H₂O (5:5, v/v)為溶劑準(zhǔn)確配置探針與Sn(IV)濃度之和為20 μM，[Sn(IV)]/([Sn(IV)]+[探針])分別為0.1-0.9的溶液，測(cè)定其紫外吸收光譜及在540 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜測(cè)定結(jié)果如圖20和圖21所示?？梢钥闯?，該探針與Sn(IV)的配位比為1:1。

實(shí)施例8：探針響應(yīng)時(shí)間測(cè)定

以EtOH-H₂O (5:5, v/v)為溶劑分別準(zhǔn)確配置濃度為10 μM的探針和5倍當(dāng)量的Sn(IV)的混合溶液，測(cè)定其紫外吸收光譜及在540 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜隨時(shí)間的變化情況，測(cè)定結(jié)果如圖22和圖23所示?？梢钥闯?，探針對(duì)Sn(IV)的響應(yīng)時(shí)間在10 s內(nèi)，且隨著時(shí)間推移探針熒光強(qiáng)度并未減弱。

實(shí)施例9：探針的可逆性測(cè)定

以EtOH-H₂O (5:5, v/v)為溶劑分別準(zhǔn)確配置濃度為10 μM的探針和5倍當(dāng)量的Sn(IV)的混合溶液，然后向其中加入0-4.0倍當(dāng)量的EDTA溶液，測(cè)定其紫外吸收光譜及在540 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜，測(cè)定結(jié)果如圖24和圖25所示?？梢钥闯?，隨著EDTA的加入，探針熒光強(qiáng)度逐漸減弱，當(dāng)EDTA加入量為Sn(IV)2倍當(dāng)量時(shí)，溶液熒光完全消失，說(shuō)明探針對(duì)Sn(IV)的測(cè)定具有可逆性。

實(shí)施例10：探針在小鼠成纖維細(xì)胞(L929)和人成骨肉瘤細(xì)胞(MG-63)中的熒光共聚焦成像

圖26表示探針在L929和MG-63細(xì)胞中對(duì)Sn(IV)的熒光共聚焦成像。將L929和MG-63細(xì)胞37 oC的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，向培養(yǎng)皿中加入10 μmol/L的探針溶液培養(yǎng)30 min。共聚焦未呈現(xiàn)出明顯的熒光發(fā)射(圖26-a)。然后向體系中5倍濃度Sn(IV)和10%乙醇并在37 oC的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min。細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射(圖26-b)，明視場(chǎng)圖片(圖26-c)表明在成像過(guò)程中細(xì)胞始終保持活性，證明該探針對(duì)細(xì)胞的毒性較小。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該系列探針可用于L929和MG-63細(xì)胞中Sn(IV)的檢測(cè)和成像。