本發(fā)明涉及羥基類固醇脫氫酶，具體涉及一種撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體R194A。

背景技術(shù)：

羰基的不對(duì)稱還原一直是化學(xué)反應(yīng)研究的熱點(diǎn)之一。雖然目前化學(xué)方法已經(jīng)取得了一定的成果，但是化學(xué)方法往往存在催化劑種類和數(shù)目有限、立體選擇性不高、輔助試劑昂貴且不易回收等缺點(diǎn)。而酶促反應(yīng)不僅具有高效性、化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性還具有高度的立體選擇性。羥基類固醇脫氫酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介導(dǎo)的酶促反應(yīng)具有相對(duì)嚴(yán)格的立體選擇性和“不嚴(yán)格”的底物特異性。例如，早在二十世紀(jì)八十年代初科學(xué)家就已經(jīng)開始嘗試?yán)梦⑸锂a(chǎn)生的7α-、7β-HSDH聯(lián)合差向異構(gòu)轉(zhuǎn)化鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)合成熊去氧膽酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)，轉(zhuǎn)化的過程如圖1所示。而游離酶還可以催化結(jié)合態(tài)膽汁酸——?；蛆Z去氧膽酸(Taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)轉(zhuǎn)化為牛磺熊去氧膽酸(Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)。

HSDH的底物不僅僅局限在甾體類化合物，文獻(xiàn)報(bào)道HSDH還可以催化烷基取代單環(huán)酮類、二環(huán)酮類等物質(zhì)的羰基不對(duì)稱還原。HSDH所具有的優(yōu)秀催化品質(zhì)決定了其在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域具有較大應(yīng)用潛力。然而，活性更高的HSDH改造體是其在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域進(jìn)一步應(yīng)用的基本保障。近年來，科研人員逐漸認(rèn)識(shí)到了7α-、7β-HSDH在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域所具有的巨大應(yīng)用潛力。目前，GenBank中登記的功能已經(jīng)確認(rèn)的7α-HSDH共有5個(gè)，它們分別來自于Bacteroides fragilis、Clostridium scindens、Clostridium sordellii、Clostridium absonum和Escherichia coli；來自Clostridium absonum和Collinsellaaerofaciens的7β-HSDH基因也已經(jīng)成功被克隆。上述雙酶偶聯(lián)構(gòu)建的生物轉(zhuǎn)化體系不但克服了輔酶循環(huán)難題，還實(shí)現(xiàn)了氧化、還原“一鍋式”進(jìn)行特定化學(xué)區(qū)域的羥基差向異構(gòu)。

酶的活性較低是限制其工業(yè)應(yīng)用的主要因素之一，幾乎所有的天然酶都需要經(jīng)過改造后才能達(dá)到工業(yè)應(yīng)用的要求。其中，撒丁島梭菌7α-HSDH(Clostridium absonum7α-HSDH，CA 7α-HSDH)具有悠久的研究歷史和廣闊的應(yīng)用前景。加之該酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，所以通過理性改造的方式獲得催化效率顯著提高的突變體具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為滿足上述領(lǐng)域存在的需求，本發(fā)明提供一種撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體，具有更高的催化效率，可用于多種底物的生物轉(zhuǎn)化，在工業(yè)生產(chǎn)中有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案如下：

一種撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，是氨基酸序列為SEQ ID NO：1的7α-羥基類固醇脫氫酶的第194位氨基酸由Arg變?yōu)锳la所得。

編碼上述撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體的基因。

所述基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

一種表達(dá)盒，其特征在于，包含上述基因。

一種載體，其特征在于，包含上述基因或表達(dá)盒。

一種重組細(xì)胞，其特征在于，包含上述基因或表達(dá)盒或載體。

一種制備上述撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體的方法，其特征在于，在能夠成功誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述重組細(xì)胞并分離得到撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體。

一種催化劑，其特征在于，其有效成分包含上述撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體。

所述催化劑，其特征在于，還包括與上述撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體同時(shí)使用時(shí)能夠提高酶催化效率或增加酶穩(wěn)定性的其它試劑。

一種實(shí)現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)的羰基不對(duì)稱還原的方法，其特征在于，使用上述撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體或任一上述催化劑與反應(yīng)底物在15-37℃、pH 6.0-11.0條件下進(jìn)行催化反應(yīng)。

本發(fā)明首先從一級(jí)結(jié)構(gòu)至高級(jí)結(jié)構(gòu)多角度多層系比較了野生型CA 7α-HSDH與同源酶蛋白的異同，確定了影響CA 7α-HSDH酶學(xué)性質(zhì)的位點(diǎn)為第194位氨基酸——精氨酸。然后通過密碼子替換將精氨酸變?yōu)楸彼幔⒗萌蚝铣杉夹g(shù)獲得了CA 7α-HSDH R194A突變體的基因。最后通過構(gòu)建突變體基因的GST融合表達(dá)載體并導(dǎo)入基因工程菌E.coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了CA 7α-HSDH R194A突變體酶蛋白。通過測(cè)定不同底物濃度下的酶促反應(yīng)初速度，利用米氏方程計(jì)算得到了CA 7α-HSDH野生型和R194A突變體的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，R194A突變體對(duì)底物NADP⁺和TCDCA的催化效率是野生型的3.34倍。本發(fā)明的R194A突變體在生物轉(zhuǎn)化CDCA/TCDCA獲取UDCA/TUDCA的工業(yè)生產(chǎn)過程中具有巨大的應(yīng)用潛力。

本發(fā)明提供的載體，可以是克隆載體，包含CA 7α-HSDH R194A突變體基因和質(zhì)粒復(fù)制所需的其它元件；也可以是表達(dá)載體，包含CA 7α-HSDH R194A突變體基因和能夠使蛋白成功表達(dá)的其它元件。在一些實(shí)施例中，所述表達(dá)載體為插入了CA 7α-HSDH R194A突變體基因的pGEX-6p-1載體。

本發(fā)明提供的重組細(xì)胞，可以是包含克隆載體的重組細(xì)胞，例如E.coli DH5α，通過培養(yǎng)細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)的CA 7α-HSDH R194A突變體基因復(fù)制；也可以是包含表達(dá)載體的細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)細(xì)胞，例如，加入適量的IPTG，16℃誘導(dǎo)CA 7α-HSDH R194A突變體蛋白的表達(dá)。

本發(fā)明提供一種催化劑，其有效成分包括CA 7α-HSDH R194A突變體。所述催化劑也可以與其它適合的催化劑同時(shí)使用，從而提高酶催化效率或者在同一反應(yīng)體系中先后進(jìn)行兩種催化反應(yīng)。

本發(fā)明的CA 7α-HSDH R194A突變體，在15-37℃、pH 6.0-11.0條件下能夠催化羰基不對(duì)稱還原反應(yīng)。

附圖說明

圖1.7α-、7β-HSDH聯(lián)合轉(zhuǎn)化CDCA制備UDCA。

圖2.Overlapping PCR(重疊PCR)構(gòu)建R194A突變體基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；

其中，M為DNA Marker；1和2為R194A的overlapping PCR產(chǎn)物。

圖3.質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果；

其中，M為DNA Marker；1和2為酶切后的重組質(zhì)粒。

圖4.撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體R194A的SDS-PAGE電泳圖；

其中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；1為R194A突變體蛋白。

圖5.NADPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

其中，橫坐標(biāo)為NADPH溶液的濃度，縱坐標(biāo)為每個(gè)濃度的NADPH溶液在340nm處的光吸收值。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，需要聲明的是，下述實(shí)施例僅作為解釋和說明，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

主要試劑：

pGEX-6p-1為已知載體，本實(shí)驗(yàn)室保存；

E.coli BL21細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；

Lysis buffer，配制而得，10mM pH7.3的PBS含有PMSF 0.1mM、亮肽素Leupeptin 0.5mg/mL；

Glutathione Sepharose 4B，購買自GE Healthcare，貨號(hào)：10223836；

PreScission Protease，購買自GenScript公司，貨號(hào)：Z02799-100；

BCA試劑盒，購買自Beyotime公司，貨號(hào)：P0006；

TCDCA，購買自百靈威科技公司，貨號(hào)：330776；

質(zhì)粒提取試劑盒，購于OMEGA公司，貨號(hào)：D6943；

以下實(shí)施例中未特別說明的生物化學(xué)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可商購獲得或按照本領(lǐng)域常規(guī)方法配制而得。

實(shí)施例1.撒丁島梭菌7α-羥基類固醇脫氫酶突變體的制備

1.突變體基因合成

原始序列：密碼子優(yōu)化后的野生型CA 7α-HSDH基因序列(參見專利CN102827848A公布文本)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

通過從一級(jí)結(jié)構(gòu)至高級(jí)結(jié)構(gòu)的多角度多層系比較野生型CA 7α-HSDH與同源酶蛋白的異同，確定了影響酶學(xué)性質(zhì)的位點(diǎn)為野生型CA 7α-HSDH的第194位氨基酸，所述氨基酸為精氨酸，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為第580-582位密碼子。

將野生型CA 7α-HSDH基因序列的第580-582處密碼子由CGC更改為GCC，將原來的精氨酸替換成丙氨酸，得到CA 7α-HSDH突變體，命名為CA 7α-HSDH R194A突變體，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.載體的構(gòu)建

2.1 R194A突變體基因通過overlapping PCR法構(gòu)建，克隆酶切位點(diǎn)為：BamHI和NotI，所用引物如下：

上游引物為：5'-CGGGATCCATGAAACGCCTGGAAGGC-3'；

下游引物為：5'-CTTTTGCGGCCGCTTAGCGCGGGCAGTATTC-3'。

上游突變引物為：5'-CTGATTGGCACTGCCGCAGCACTGGAA-3'；

下游突變引物為：5'-TTCCAGTGCTGCGGCAGTGCCAATCAG-3'。

Arg194Ala突變體基因的PCR方法：利用重疊PCR(overlapping PCR)法獲取突變基因；PCR所用的DNA模板：密碼子優(yōu)化后的CA 7α-HSDH質(zhì)粒(pGEX-6p-1/CA 7α-HSDH)，是通過BamHI和NotI雙酶切反應(yīng)及連接反應(yīng)構(gòu)建而得。

第一次PCR體系及條件：

體系1：

體系2：

條件：

第二次PCR體系及條件：

體系：

條件：

第三次PCR體系及條件：向第二次反應(yīng)體系中加入上游引物、下游引物各1μL。采用以下條件完成PCR反應(yīng)。

條件：

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)overlapping PCR結(jié)果，如圖2所示，得到了R194A突變體基因。

2.2酶切和連接反應(yīng)

利用BamHI和NotI限制性內(nèi)切酶分別對(duì)重疊PCR獲得的R194A突變體基因以及pGEX-6p-1載體進(jìn)行雙酶切，然后按照以下體系和條件進(jìn)行連接。

連接體系：

R194A突變體基因 3μL

pGEX-6p-1 3μL

DNA連接酶混合物 6μL

反應(yīng)條件：16℃連接1.5h，得到連接產(chǎn)物pGEX-6p-1/CA 7α-HSDH R194A。

2.3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞

1)感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α放置冰上融化。

2)將步驟2.2所得的連接體系加入融化的E.coli DH5α感受態(tài)中，冰上30min。

3)42℃熱處理90s。

4)冰上2min。

5)加入LB培養(yǎng)基600μL，搖床溫度37℃，搖床搖速150rpm，時(shí)間45min。

6)吸取200μL涂布Amp⁺抗性LB平板培養(yǎng)基。

7)37℃過夜培養(yǎng)。

2.4挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)

挑取單菌落，接種Amp⁺LB培養(yǎng)基中，搖床溫度37℃，搖床搖速220rpm。OD600≈1.0時(shí)，8000rpm離心5min獲取菌體用于質(zhì)粒提取。

2.5提取質(zhì)粒

按OMEGA Plasmid Mini Kit I(貨號(hào)：D6943)說明書操作。

2.6雙酶切鑒定

體系：

條件：37℃酶切3h。

雙酶切結(jié)果如圖3所示。

2.7測(cè)序確認(rèn)

選取雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送TAKARA(中國，大連)公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒作為R194A突變體的表達(dá)載體。

3.酶蛋白的GST融合異源表達(dá)

(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21細(xì)胞

a.-80℃中取出BL21感受態(tài)細(xì)胞E.coli冰上放置。

b.加入純化后的pGEX-6p-1/CA 7α-HSDH R194A表達(dá)載體2μL，冰上放置30min。

c.42℃熱處理90s。

d.冰上放置2min。

e.復(fù)蘇，加入600μL LB培養(yǎng)基，37℃，150rpm，45min。

f.吸取200μL培養(yǎng)基涂布于Amp⁺LB平板培養(yǎng)基中。

g.37℃培養(yǎng)過夜。

(2)蛋白表達(dá)與純化

a.將菌種接種入無菌LB培養(yǎng)基中，氨芐青霉素終濃度為50μg/mL，37℃，180rpm培養(yǎng)。

b.待OD600≈0.8時(shí)，加入終濃度為0.2mM的IPTG，16℃誘導(dǎo)過夜(12h)。8000rpm，5min收集菌體。

c.按1L培養(yǎng)體系加30mL Lysis buffer的比例重懸菌體，超聲破菌至澄清。12000rpm，20min。取上清。

d.上清與Glutathione Sepharose 4B結(jié)合，填料使用的比例為每升培養(yǎng)體系使用5mL填料，4℃結(jié)合2h。輕輕垂直顛倒混懸。

e.結(jié)合完畢后，500rpm，5min沉淀填料。填料用4℃預(yù)冷PBS沖洗3-5個(gè)柱體積。去除雜蛋白。

f.加入PreScission Protease酶切緩沖液，加入PreScission Protease酶。

g.4℃酶切過夜。酶切完畢后，將上清從層析柱中放出。

h.將所得樣品進(jìn)行SDS-PAGE，鑒定其分子量大小及純度、BCA試劑盒測(cè)試純化蛋白的濃度。

結(jié)果如圖4所示，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示R194A突變體可溶性表達(dá)成功，并且經(jīng)一步親和層析后蛋白的條帶單一。

實(shí)施例2.R194A突變體酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

1.NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

利用反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH 8.5)分別配制0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mM的NADPH溶液。用上述空白溶劑調(diào)零后將各個(gè)濃度的NADPH溶液分別加入2mL比色皿中，在340nm測(cè)定光吸收值OD₃₄₀。以NADPH溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果如圖5所示，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為y＝2.5771x+0.0045，R²＝0.9995。2.酶活測(cè)定

在2mL比色皿中依次加入958μL反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH 8.5)、20μL 50mM的NADP⁺溶液、2μL實(shí)施例1制備得到的CA 7α-HSDH R194A突變體溶液(1.77mg/mL)，調(diào)零后加入20μL 50mM的底物TCDCA。酶促動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)定時(shí)，輔酶的終濃度的變化范圍為0.1-10mM。

酶促反應(yīng)的條件是：于20℃，在340nm處記錄光吸收在1min內(nèi)的變化，并根據(jù)NADPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)物的生成量。通過米氏方程(公式1)等號(hào)兩側(cè)取雙倒數(shù)(公式2)通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法得到K_m、k_cat；并通過比較k_cat/K_m值來衡量突變體的催化效率變化。

結(jié)果如表1所示，CA 7α-HSDH R194A突變體在以TCDCA為底物，催化NADP⁺轉(zhuǎn)化為NADPH效率是野生型CA 7α-HSDH的3.34倍。

表1.野生型CA 7α-HSDH與R194A突變體催化NADP⁺的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)