1.一種重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP，其特征在于：所述病毒的基因組上的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子和ICP4基因之間插入長(zhǎng)度為25bp的DNA片段，且ICP34.5位點(diǎn)插入了GFP表達(dá)盒，其中，DNA片段序列為TTGCCCCAAGCGGCATTTGGGTTCA。
2.一種權(quán)利要求1所述重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：
1)用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子hTERTp取代含有ICP4基因的單純皰疹病毒中的ICP4基因啟動(dòng)子，構(gòu)建該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4：
(1)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4和pICP4del-eGFP
a.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)含有ICP4基因的單純皰疹病毒，并純化其基因組DNA；
b.擴(kuò)增ICP4基因上游側(cè)翼序列：以步驟a)中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物：
ICP4USf正向引物：ccctccagacgcaccggagtcggggg，
ICP4USr反向引物：aagtcgactctagaggatcgatctctgacctgagattggcggcactgaggta擴(kuò)增出ICP4基因上游側(cè)翼序列；
c.擴(kuò)增ICP4基因下游側(cè)翼序列：以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物：
ICP4DSf正向引物：aaaagtcgacctgcaggcatgctaacgaggaacgggcagggggc
ICP4DSr反向引物：aaaaaagcttgcatgcccacgtgcgcggggccagacgggct
擴(kuò)增出ICP4基因下游側(cè)翼序列；
將上下游側(cè)翼序列克隆到pSP73質(zhì)粒上，構(gòu)建pICP4del及pICP4del-eGFP質(zhì)粒：將SalI酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的上游側(cè)翼序列及SalI/HindIII雙酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的下游側(cè)翼序列混合并連接到pSP73的EcoRV/HindIII位點(diǎn)，得到pICP4del；用EcoRI/XhoI從pcDNA3.1-eGFP切下CMV啟動(dòng)子控制的eGFP表達(dá)盒，經(jīng)T4DNA聚合酶補(bǔ)平末端后插入到pICP4del的EcoRV位點(diǎn)，得到pICP4del-eGFP；
d.分三次PCR擴(kuò)增出ICP4基因中三段序列：
首先，使用以下引物：
ICP4-1st正向引物：ttttttgaattcatggcgtcggagaacaagcagcgcc
ICP4-1st反向引物：tggagccaccccatggcctccgcgt
ICP4-2nd正向引物：cgacgccgcgcagcagtacgccctg
ICP4-2nd反向引物：cggcgggggcgggcccggcgcaccg
ICP4-3rd正向引物：cctcatgtttgacccgcgggccctg
ICP4-3rd反向引物：ttttttctcgagttacagcaccccgtccccctcgaac
以步驟a)中所得病毒基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增出三段基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd，而后分別將該三段基因片段插入pSP73質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)構(gòu)建出以下三種質(zhì)粒：pSP73-ICP4-1st、pSP73-ICP4-2nd、pSP73-ICP4-3rd，從該三種質(zhì)粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1st、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4-2nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3rd待用；
e.從含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子hTERTp的質(zhì)粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代從pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV啟動(dòng)子，得到質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3-NHN是在pcDNA3的NheI位點(diǎn)插入NheI-HapI-NheI酶切位點(diǎn)序列所得；
f.將步驟c)中得到的ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd混合并連接到步驟d)得到的pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；
g.用SalI酶切步驟b)得到的含ICP4基因上下游側(cè)翼序列的質(zhì)粒pICP4del，并補(bǔ)平末端待用，用PmeI和HpaI從步驟e)得到的質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表達(dá)盒片段，并將其與該酶切后待用的pICP4del質(zhì)粒連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4；
h.構(gòu)建BHK-ICP4輔助細(xì)胞：用EcoRI和XhoI從步驟e)質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV啟動(dòng)子的下游EcoRI和XhoI位點(diǎn)，得到pcDNA3-CMV-ICP4質(zhì)粒；將該pcDNA3-CMV-ICP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，該pcDNA3-CMV-ICP4質(zhì)粒DNA可重組到BHK細(xì)胞基因組中，使有些BHK重組細(xì)胞獲得對(duì)新霉素的抗性和表達(dá)ICP4，用抗菌素G418殺死未重組的BHK細(xì)胞，經(jīng)過(guò)幾輪的亞克隆篩選，用RT-PCR方法篩選出表達(dá)ICP4的BHK-ICP4輔助細(xì)胞；
(2)剔除基因組中ICP4基因啟動(dòng)子并插入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子hTERTp啟動(dòng)子：
a.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)該含有ICP4基因的單純皰疹病毒，并提取病毒基因組DNA；
b.將步驟A中該病毒基因組DNA與步驟1)的b)小步驟得到的質(zhì)粒pICP4del-eGFP共轉(zhuǎn)入步驟1)的g)小步驟得到的BHK-ICP4輔助細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組，該質(zhì)粒pICP4del-eGFP中綠色熒光蛋白GFP表達(dá)盒置換了該含有ICP4基因的單純皰疹病毒HSV的ICP4基因，使得重組病毒的毒斑發(fā)綠色熒光，經(jīng)過(guò)幾輪的噬斑純化，挑選綠色熒光毒斑，純化出重組病毒HSV-d4GFP；
c.培養(yǎng)HSV-d4GFP病毒，并提取基因組DNA；
d.將重組病毒HSV-d4GFP的基因組DNA和步驟1)中f小步驟得到質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4的DNA共轉(zhuǎn)入BHK-ICP4輔助細(xì)胞中，經(jīng)同源重組，hTERTp_ICP4表達(dá)盒置換了該重組病毒HSV-d4GFP的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)盒，使新重組病毒的毒斑不發(fā)綠色熒光，經(jīng)過(guò)幾輪的噬斑純化，挑選無(wú)熒光毒斑，純化出該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4；
2)構(gòu)建重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep
(1)按以下序列合成互補(bǔ)的、長(zhǎng)度為145個(gè)堿基的DNA片段，分別為hp-ICP4正和hp-ICP4負(fù)；其中N序列(25個(gè)堿基)為隨機(jī)堿基，兩側(cè)翼已知序列一側(cè)與HSV-hTERTp_ICP4上端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子的3’端序列同源，另一側(cè)與ICP4基因5’端序列同源；
hp-ICP4正：
CCGCGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCCCCGGCTCCCCGGGCCCCACCGACGGGCCG
hp-ICP4負(fù)：
CGGCCCGTCGGTGGGGCCCGGGGAGCCGGGGCGCTGCTTGTTCTCCGACGCCATGAATTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTCGCGG
(2)構(gòu)建重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep：
提取HSV-hTERTp_ICP4病毒基因組DNA與上述合成的DNA片段hp-ICP4正和hp-ICP4負(fù)同源重組，用肝癌細(xì)胞HepG-2篩選，得到針對(duì)肝癌細(xì)胞高滴度的HSV-hTERTp_ICP4_Hep(簡(jiǎn)稱HSV_Hep)；
(3)培養(yǎng)純化HSV_Hep重組病毒并提取病毒基因組DNA，對(duì)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子與ICP4基因結(jié)合部測(cè)序，確定25個(gè)堿基的序列為TTGCCCCAAGCGGCATTTGGGTTCA；
3)構(gòu)建重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP
(1)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pdICP34.5-eGFP
a.用BHK-ICP4細(xì)胞培養(yǎng)HSV-hTERTp_ICP4，并純化其基因組DNA；
b.擴(kuò)增ICP34.5基因上游側(cè)翼序列：以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP34.5USf正向引物和ICP34.5USr反向引物：
ICP34.5USf：CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG
ICP34.5USr：
GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGCTCCTGACCGCGGG
擴(kuò)增出ICP34.5基因上游側(cè)翼序列；
c.擴(kuò)增ICP34.5基因下游側(cè)翼序列：以步驟a)中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP34.5DSf正向引物和ICP34.5DSr反向引物：
ICP34.5DSf：
GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA
ICP34.5DSr：TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA
擴(kuò)增出ICP34.5基因下游側(cè)翼序列；
d.連接ICP34.5基因上下游側(cè)翼序列：以步驟b)和c)得到的ICP34.5上下游側(cè)翼序列為模版，用ICP34.5USf和ICP34.5DSr擴(kuò)增連接ICP34.5基因上下游側(cè)翼序列；
e.將上下游側(cè)翼序列克隆到pSP72質(zhì)粒上，構(gòu)建pdICP34.5；
f.從pcDNA3.1-eGFP獲得eGFP表達(dá)序列并插入到pdICP34.5的AfeI位點(diǎn)，得到pdICP34.5-eGFP；
(2)構(gòu)建HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP
A.用HEPG-2細(xì)胞培養(yǎng)HSV-hTERTp_ICP4_Hep(簡(jiǎn)稱HSV_Hep)，并純化其基因組DNA；
B.將步驟A中該病毒基因組DNA與步驟(1)f中該質(zhì)粒pdICP34.5-eGFP共轉(zhuǎn)入肝癌HepG-2細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組，該質(zhì)粒pdICP34.5-eGFP中綠色熒光蛋白GFP表達(dá)盒置換了含有ICP34.5基因的單純皰疹病毒HSV_Hep的ICP34.5基因，使得重組病毒的毒斑發(fā)綠色熒光，經(jīng)過(guò)幾輪的噬斑純化，挑選綠色熒光毒斑，純化出重組病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP(簡(jiǎn)稱HSV_Hep-GFP)。
3.一種權(quán)利要求1所述的重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP在制備腫瘤的診斷試劑盒中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于；所述診斷試劑盒由重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP、APC標(biāo)記的人CD45抗體和紅細(xì)胞裂解液組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，所述單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP含量為5E6-5E7CCID50/ml，所述APC標(biāo)記的人CD45抗體的含量為0.1～0.5mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP含量為5E6-5E7CCID50/ml，所述APC標(biāo)記的人CD45抗體的含量為0.2mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于：所述紅細(xì)胞裂解液中含有含有氯化銨、乙二胺四乙酸二鈉、碳酸氫鉀和超純水，其中，所述紅細(xì)胞裂解液中，氯化銨的含量為0.10～0.20M、乙二胺四乙酸二鈉的含量為0.5～2mM、碳酸氫鉀的含量為5～15mM。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于：所述紅細(xì)胞裂解液中，氯化銨的含量為0.15M、乙二胺四乙酸二鈉的含量為1mM、碳酸氫鉀的含量為10mM。