本發(fā)明屬于海洋天然產(chǎn)物領(lǐng)域，具體涉及一種抗弧菌活性的異香豆素類化合物及其晶體。

背景技術(shù)：

在過去的半個多世紀里，由于抗生素的廣泛使用，特別是不合理的臨床誤用,造成耐藥性致病菌種類的不斷增加,對人類生命健康帶來極大威脅。為了減少細菌耐藥性的產(chǎn)生，急需開發(fā)新的高敏抗菌藥物，以提高臨床用藥的有效性。

海洋高鹽、高壓、低光照等條件使海洋微生物能夠產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的次級代謝產(chǎn)物，其中許多化合物具有抗菌活性，為尋找潛在的抗菌藥物先導化合物提供了重要來源。

近年來，隨著海洋天然藥物化學的發(fā)展，越來越多的抗菌活性化合物從海洋微生物中不斷分離獲得，為尋找新型抗菌劑提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。采用人工培養(yǎng)發(fā)酵的方法，從海洋微生物中獲得有重要抗菌活性的次級代謝產(chǎn)物，具有環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展等特點，能有效解決藥物開發(fā)過程中的藥源等關(guān)鍵性問題，因此具有獨特優(yōu)勢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種真菌Penicillium citrinum HL-5126分離自紅樹尖瓣海蓮，紅樹尖瓣海蓮是第一發(fā)明人于2012年采自中國海南東寨港紅樹林自然保護區(qū)(Natural Product Research，2016，30(7)，821-825)。

本發(fā)明提供一類由上述紅樹尖瓣海蓮內(nèi)生真菌Penicillium citrinum HL-5126產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物或其藥學上可接受的鹽，其特征在于所述次級代謝產(chǎn)物具有如下結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明提供一種制備化合物1-7或其藥學上可接受的鹽的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)先在菌種培養(yǎng)基中對真菌Penicillium citrinum HL-5126進行菌種培養(yǎng)；

(2)再在發(fā)酵培養(yǎng)基中對步驟(1)中的真菌Penicillium citrinum HL-5126進行發(fā)酵培養(yǎng)；

(3)將步驟(2)得到的發(fā)酵物中的發(fā)酵液和菌體分離，發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液后減壓濃縮得到發(fā)酵液浸膏；

(4)步驟(3)得到的發(fā)酵液浸膏經(jīng)過減壓硅膠柱層析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0至0∶100梯度洗脫，將其按照極性大小分成5個組分Fr.1～Fr.5；將Fr.3組分以石油醚-乙酸乙酯10∶2為洗脫劑經(jīng)正相硅膠柱層析后，再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，洗脫劑為CHCl₃∶MeOH＝1∶1，最后經(jīng)高效液相色譜HPLC制備，色譜柱為Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速為2mL/min，流動相為MeOH∶H₂O＝85∶15最終得到化合物1-7。

其中所述洗脫劑或流動相的比例均為體積比；所述菌種培養(yǎng)基中含有葡萄糖0.1％–5.0％、酵母膏0.01％–2％、蛋白胨0.01％–2％、瓊脂0.1％–3.0％、粗海鹽0.05％–5％、適量的水，培養(yǎng)溫度為20–25℃，培養(yǎng)時間為5-10天；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有葡萄糖0.1％–5.0％、酵母膏0.01％–2％、蛋白胨0.01％–2％、粗海鹽0.05％–5％，培養(yǎng)溫度為20–25℃，培養(yǎng)時間為25–30天；上述百分比均為重量百分比。

本發(fā)明提供化合物1的晶體結(jié)構(gòu)，其特征在于其X-射線單晶衍射數(shù)據(jù)為： 斜方晶系，空間群P2₁2₁2₁，晶胞參數(shù)為α＝90°,β＝90°,γ＝90°，Z＝4,D_x＝1.318mg/mm³,F(000)＝640,μ(Cu Kα)＝0.848mm^-1,2681個可觀測點[I>2σ(I)]，可觀測點精修最終偏離因子R＝0.083，wR＝0.0707，F(xiàn)lack常數(shù)為0.0(3)。

本發(fā)明提供化合物1晶體的制備方法，其特征在于將化合物1溶于極性溶劑中，自然結(jié)晶得到，所述極性溶劑為甲醇、乙醇或乙酸乙酯。

本發(fā)明提供一種抗菌劑，其特征在于以化合物1-7、其晶體或其藥學上可接受的鹽作為活性成分。

本發(fā)明提供的上述抗菌劑，還包含其他抗菌藥物；也可以包含藥學上可接受的載體。

本發(fā)明提供化合物1-7、其晶體或其藥學上可接受的鹽在制備抗菌藥物方面的用途。所述抗菌藥物用于抑制表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌或弧菌。

本發(fā)明所述晶體結(jié)構(gòu)以雙子超衍射儀(Xcalibur,Atlas,Gemini ultra diffractometer)采用Cu Kα射線在120.01(10)K下掃描收集衍射數(shù)據(jù)。

本發(fā)明中術(shù)語“藥學上可接受的鹽”是指非毒性的無機或有機酸和/或堿的加成鹽，可參見“Salt selection for basic drugs”,Int.J.Pharm.(1986),33,201–217。

附圖說明

說明書附圖1為化合物1的XRD圖。

具體實施方式

為了便于對本發(fā)明的進一步理解，下面提供的實施例對其做了更詳細的說明。但是這些實施例僅供更好的理解發(fā)明而并非用來限定本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┰瓌t，本發(fā)明的實施方式不限于以下內(nèi)容。

實施例1

(1)紅樹尖瓣海蓮內(nèi)生真菌Penicillium citrinum HL-5126的菌種培養(yǎng)

菌種培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖5.0％(重量百分比，下同)、酵母膏2％、蛋白胨2％、瓊脂3％、粗海鹽5.0％，其余為水；使用時制成試管斜面，真菌菌株在25℃下培養(yǎng)5天。

(2)紅樹尖瓣海蓮內(nèi)生真菌Penicillium citrinum HL-5126的發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖5.0％(重量百分比，下同)、酵母膏2％、蛋白胨2％、氯化鈉5％，其余為水；真菌菌株于25℃培養(yǎng)30天。

(3)化合物1-7的提取分離

取20L步驟(2)得到的發(fā)酵液過濾，除去菌體，將濾液濃縮后，用等體積的乙酸乙酯萃取3次；萃取液濃縮后經(jīng)過減壓硅膠柱層析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0至0:100梯度洗脫，將其按照極性大小分成5個組分Fr.1～Fr.5；將Fr.3組分以石油醚-乙酸乙酯10∶2為洗脫劑經(jīng)正相硅膠柱層析后，再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，洗脫劑為CHCl₃∶MeOH＝1∶1，最后經(jīng)高效液相色譜HPLC制備，色譜柱為Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速為2mL/min，流動相為MeOH∶H₂O＝85∶15，最終得到化合物1(5.0mg)、化合物2(5.0mg)、化合物3(6.2mg)、化合物4(6.0mg)、化合物5(8.0mg)、化合物6(10.0mg)、化合物7(7.0mg)。

經(jīng)結(jié)構(gòu)確證，化合物1-3為新化合物，化合物4-7表征數(shù)據(jù)與已知報道的數(shù)據(jù)一致，在本發(fā)明中不在贅述。

化合物1-3的NMR數(shù)據(jù)(400MHz ¹H NMR，100MHz ¹³C NMR)

化合物1：無色晶體，[α]²⁴_D＝–29.0(c＝0.25,MeOH).mp 118.8–120.4℃；λ_max(logε)220(3.02),246(2.50),312(1.62)nm；CD(c 2×10^-4mol/L,MeOH)λ_max(Δε),259(-23.0),280(-2.5),330(-13.6)；IR(KBr)ν_max 3518,1712,1602,1272,1250,1230,1112,1082,1064,798cm^–1；HRESIMS m/z 281.1384[M+H]⁺(calcd for C₁₅H₂₁O₅,281.1383).

化合物2：無色晶體，[α]²⁴_D＝–24.6(c＝0.25,MeOH).mp 136.9–137.6℃.λ_max(logε)220(3.02),246(2.50),312(1.62)nm；CD(0.52Mm,MeOH)λ_max(Δε)239(+2.00),257(-8.60),290(-1.52),329(-3.10)；IR(KBr)ν_max 3518,1712,1602,1272,1250,1230,1112,1082,1064,798cm^–1；HRESIMS m/z 579.2200[2M+Na]⁺(calcd for C₃₀H₃₆O₁₀Na,579.2200).

化合物3：無色晶體，[α]²⁴_D＝–12.0(c＝0.25,MeOH).λ_max(logε)220(3.02),246(2.50),312(1.62)nm；CD(0.52Mm,MeOH)λ_max(Δε)240(+9.60),260(-2.65),328(-0.16)；IR(KBr)ν_max 3518,1712,1602,1272,1250,1230,1112,1082,1064,798cm^–1；HRESIMS m/z 273.0733[M+Na]⁺(calcd for C₃₀H₃₆O₁₀Na,273.0740).

實施例2

將實施例1中菌種培養(yǎng)基中成分調(diào)整為葡萄糖0.1％、酵母膏0.01％、蛋白胨0.01％、瓊脂0.1％、粗海鹽0.05％、適量的水，培養(yǎng)溫度為20℃，培養(yǎng)時間為10天；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中成分調(diào)整為含有葡萄糖0.1％、酵母膏0.01％、蛋白 胨0.01％、粗海鹽0.05％，培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)時間為25天；上述百分比均為重量百分比。仍能以類似的收率得到化合物1-7。

實施例3

取2.0mg化合物1溶于2mL甲醇中，靜止自然結(jié)晶，4天后得到無色晶體，其晶體結(jié)構(gòu)以雙子超衍射儀(Xcalibur,Atlas,Gemini ultra diffractometer)采用Cu Kα射線在120.01(10)K下掃描收集衍射數(shù)據(jù)。

化合物1晶體：斜方晶系，空間群P2₁2₁2₁，晶胞參數(shù)為α＝90°,β＝90°,γ＝90°，Z＝4,D_x＝1.318mg/mm³,F(000)＝640,μ(Cu Kα)＝0.848mm^-1,2681個可觀測點[I>2σ(I)]，可觀測點精修最終偏離因子R＝0.083，wR＝0.0707，F(xiàn)lack常數(shù)為0.0(3)。

此外，將化合物1溶于乙醇或乙酸乙酯中，靜止3-7天均能得到上述晶體。

實施例4本發(fā)明的化合物的抗菌活性的測定

本發(fā)明的化合物按照文獻方法(Pierce C.G.；Uppuluri P.；Teistan A.R.；Wormley Jr.F.L.；Mowat E.；Ramage G.；Lopez-ribot J.L.Nat.Protoc.2008，3，1494-1500)，測試對4株革蘭氏陽性菌：蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、弧菌(V.alginolyticus)的抗菌活性。如表1所示。

表1本發(fā)明的化合物對細菌的抑制活性