本發(fā)明涉及一種澤瀉湯提取物。

(二)

背景技術(shù)：

澤瀉湯來自東漢張仲景的《金匱要略-痰飲咳嗽病》，原文：心下有支飲，其人苦冒眩，澤瀉湯主之。從此始有“澤瀉湯”方名，后世多命名為“金匱澤瀉湯”。張仲景同時提出，痰飲上泛是昏冒眩暈的主要病機(jī)。該方重用澤瀉利水下行，以治其標(biāo)；以白術(shù)健脾制水，以治其本；為臨床治療痰飲致眩之要方。后世醫(yī)家在臨床實踐中進(jìn)一步擴(kuò)大了澤瀉湯的主治范圍，除用治“支飲冒?！蓖?，亦可治療“水腫”《普濟(jì)方》；“胸中痞結(jié)，堅大如盤，下則小便不利”《醫(yī)燈續(xù)焰》；“咳逆難睡，其形如腫”《會約》等諸癥。

目前對于澤瀉和白術(shù)單味藥物的研究已相當(dāng)?shù)纳钊?。澤瀉以產(chǎn)于福建建甌、建陽等地者質(zhì)量最佳，俗稱“建澤瀉”，被收載入中國道地藥材“南藥”中?，F(xiàn)代藥學(xué)研究證實，澤瀉主要含三萜類化合物、揮發(fā)油、生物堿及利尿的有效成分澤瀉醇A、B、C等，具有顯著利尿等作用。白術(shù)的主要化學(xué)成分為揮發(fā)油(量為1.4％左右)，還含有多糖、谷氨酸等14種氨基酸等物質(zhì)；具有利尿、調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動、提高免疫力等藥理作用。但是澤瀉湯整方相關(guān)化學(xué)組分的研究尚未見報道，澤瀉、白術(shù)以水共煎后的成分有一定差別，因此發(fā)明人經(jīng)過努力，從整方中分離出具有藥效活性的新化合物。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種澤瀉湯提取物及其合成與制備預(yù)防和治療美尼爾綜合癥、高血壓、高血脂等藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種澤瀉湯提取物，所述提取物為下列之一：

本發(fā)明還提供一種所述澤瀉湯提取物的制備方法，所述方法為：(1)將澤瀉和白術(shù)混合，以8倍量水煎煮，提取液以3層紗布過濾，減壓濃縮至密度1.1-1.2g·mL^-1，減壓過濾，獲得提取物；所述澤瀉和白術(shù)質(zhì)量比為1：0.1～1，優(yōu)選1:0.4；

(2)將提取物依次用正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取，萃取物均經(jīng)減壓濃縮成浸膏，分別得正丁醇萃取物，乙酸乙酯萃取物，石油醚萃取物；

將乙酸乙酯萃取物進(jìn)行硅膠柱層析，分別以體積比50:1～0:1的二氯甲烷與甲醇混合液進(jìn)行洗脫，當(dāng)洗脫液為體積比25:1的二氯甲烷：甲醇時，分別收集洗脫液總體積1/2和3/4時的流出液，獲得流出液a和流出液b；將流出液a經(jīng)甲醇溶解后，Sephadex LH-20葡聚糖凝膠色譜分離，甲醇洗脫，收集目標(biāo)組分(首尾按各50mL流出液收集，第2至第5按約每20mL流出液，依次收集第70～90mL流出液)以LabAlliance P-24半制備液相分離，收集保留時間28-37min流出液，以Jasco制備液相分離，流動相為體積比50:50的甲醇：水，收集保留時間67-70min流出液c和保留時間75-83min的流出液d；取流出液c以Jasco制備液相分離，流動相為體積比45:55的甲醇:水，色譜柱YMC HPLC色譜柱(250x10mm)，流速1.5mL·min^-1，收集液相保留時間46～58min的樣品，經(jīng)減壓干燥得提取物(1)；

取流出液d以Jasco制備液相分離，流動相為體積比45:55的甲醇:水，色譜柱YMC HPLC色譜柱(250x10mm)，流速1.5mL·min^-1，收集液相保留時間58～66min的樣品，經(jīng)減壓干燥得提取物(2)；

取流出液b經(jīng)甲醇溶解后，Sephadex LH-20葡聚糖凝膠色譜分離，甲醇洗脫，收集目標(biāo)組分(首尾按各50mL流出液收集，第2至第5按約每20mL流出液，依次收集第50～70mL流出液)以Jasco制備液相分離，流動相為體積比50:50的甲醇:水，色譜柱YMC HPLC色譜柱(250x20mm)，流速3mL·min^-1，收集保留時間126-134min流出液，經(jīng)減壓干燥得提取物(3)。

此外，本發(fā)明還提供一種所述澤瀉湯提取物在制備預(yù)防和治療美尼爾綜合癥藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種所述澤瀉湯提取物在制備預(yù)防和治療高血壓藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種所述澤瀉湯提取物在制備預(yù)防和治療高血脂藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

本發(fā)明化合物是一種澤瀉湯提取新化合物，具有預(yù)防和治療美尼爾綜合癥、高血壓、高血脂等疾病的活性，其分離自經(jīng)典名方澤瀉湯。

(四)附圖說明

圖1.新化合物1的高分辨質(zhì)譜。

圖2.新化合物1的DEPT譜。

圖3.新化合物1的¹H¹HCOSY譜。

圖4.新化合物1的HSQC譜。

圖5.新化合物1的HMBC譜。

圖6.新化合物1的ROESY譜。

圖7.新化合物3的高分辨質(zhì)譜。

圖8.新化合物3的DEPT譜。

圖9.新化合物3的¹H¹HCOSY譜。

圖10.新化合物3的HSQC譜。

圖11.新化合物3的HMBC譜。

圖12.新化合物3的ROESY譜。

圖13.新化合物2的高分辨質(zhì)譜。

圖14.新化合物2的DEPT譜。

圖15.新化合物2的¹H¹HCOSY譜。

圖16.新化合物2的HSQC譜。

圖17.新化合物2的HMBC譜。

圖18.新化合物2的ROESY譜。

圖19.新化合物結(jié)構(gòu)圖，A為新化合物1，B為新化合物3，C為新化合物2。

圖20.半制備的HPLC圖，A為UV檢測，B為RID檢測。

圖21.Jasco制備液相色譜圖，A為UV檢測，B為RID檢測。

圖22.新化合物1的HPLC圖。

圖23.新化合物3的HPLC圖。

圖24.新化合物2的HPLC圖。

(五)具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

核磁共振儀:Bruker AVANCE 400instrument.，¹H-NMR(400MHz)，¹³C-NMR(100MHz)，各溶劑峰做內(nèi)標(biāo)。

質(zhì)譜儀：JEOL JMS-SX 102A(EI,FAB MS)，IonSpec 4.7Tesla FTMS(HRFTMS)，Alliance2695Quattro Micro TM ESI(Waters,液質(zhì)聯(lián)用色譜儀)。

紫外分光光度計：Hitachi U-3310UV-VIS Spectrophotometer。

紅外光譜儀：NICOLET 380FT-IR Spectrophotometer(Thermo Electron Corporation),KBr壓片。

旋光儀：MC 241digital polarimeter(PERKIN-ELMER)。

半制備高效液相色譜儀：JASCO高效液相色譜系統(tǒng)(PU-2089plus,RI-2031plus,UV-2075plus)；SSI Lab Alliance^[TM]高效液相色譜系統(tǒng)(SeriesⅢpump,RI 2000,UV Model 500,Scientific Systems,Inc,USA)。

其他儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：SENCO R系列，上海申生科技有限公司。電子天平：BSA/24S萬分之一天平(德國Sartorius)、JP/YP series百分之一天平(良平儀器)。ZF-I型三用紫外分析儀：上海顧村電光儀器廠。

實施例1

(1)化合物提取純化

取澤瀉、白術(shù)以質(zhì)量比1:0.4的混合物4500g，以8倍量水分別煎煮3次，時間分別為2.5h、2.5h、2h，合并煎煮液以3層紗布過濾，減壓濃縮至密度1.1-1.2g·mL^-1，減壓過濾，得總提取物。

將總提取物依次以正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取，萃取物均經(jīng)減壓濃縮成浸膏，得正丁醇層萃取物52.18g，乙酸乙酯層萃取物13.77g，石油醚層萃取物2.72g。

將13.77g乙酸乙酯萃取物以20g100-200目硅膠拌樣后，300-400目硅膠約250克裝柱分離。分別以二氯甲烷：甲醇(50:1，v/v)1000mL、二氯甲烷：甲醇(25:1，v/v)2000mL、二氯甲烷：甲醇(10:1，v/v)2000mL、二氯甲烷：甲醇(4:1，v/v)2000mL、二氯甲烷：甲醇(1:1，v/v)1000mL、甲醇1000mL洗脫，按約每500mL 收集洗脫液經(jīng)減壓干燥得樣品0101-0119，見表1。

表1 01系列樣品重量

取樣品0104(1.3016g)(即乙酸乙酯萃取物從硅膠柱色譜收集的二氯甲烷：甲醇(25:1，v/v)第2個500mL洗脫液)經(jīng)10ml甲醇溶解后，Sephadex LH-20葡聚糖凝膠色譜分離，甲醇洗脫，首尾按各50mL流出液收集，第2至第5按約每20mL流出液依次收集，經(jīng)減壓干燥得樣品0201-0206，見表2。

表2 02系列樣品重量

取樣品0203(0.7399g，即樣品0104經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠色譜用甲醇洗脫第70～90mL收集來的)，以LabAlliance P-24半制備液相分離。半制備條件：色譜柱：YMC-Pack ODS-A(250x20mm)，流動相為甲醇、水(65:35，v/v)，流速3mL·min^-1，紫外檢測波長254nm。將0203粗分為4個部分0203-1～0203-4。半制備的HPLC見圖20。

取0203-2(0.1495g，即0203經(jīng)LabAlliance P-24半制備液相分離，收集液相保留時間28～37min的樣品)，以Jasco制備液相分離，調(diào)整流動相比例為甲醇：水(50:50，v/v)，得樣品0301-0305，見表3。制備液相色譜見下圖21。

表3 03系列樣品重量

取樣品0301(0203-2經(jīng)Jasco制備液相分離，收集液相保留時間67～70min的樣品)，以Jasco制備液相分離，流動相甲醇:水(45:55，v/v)，色譜柱YMC HPLC色譜柱(250x10mm)，流速1.5mL·min^-1，收集液相保留時間46～58min的樣品，經(jīng)減壓干燥得樣品0401，即為提取物(1)(5.5mg)。HPLC液相圖22。

取樣品0303(0203-2經(jīng)Jasco制備液相分離，收集液相保留時間75～83min的樣品)，以Jasco制備液相分離，流動相甲醇:水(45:55，v/v)，色譜柱YMC HPLC色譜柱(250x10mm)，流速1.5mL·min^-1，收集液相保留時間58～66min的樣品，經(jīng)減壓干燥得樣品0406，即為提取物(3)(4.0mg)。HPLC液相圖見圖23。

表4 04系列樣品重量

取樣品0105(2.0381g)(乙酸乙酯萃取物從硅膠柱色譜以二氯甲烷：甲醇(25:1，v/v)洗脫第3個500mL收集來的)甲醇溶解后，Sephadex LH-20葡聚糖凝膠分離，甲醇洗脫，首尾按各50mL流出液收集，第2至第5按約每20mL流出液依次收集，經(jīng)減壓干燥得樣品0601-0606，見表5。

表5 06系列樣品重量

取樣品0602(0.4500g)(0105經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠色譜用甲醇洗脫第50～70mL收集來的)，以Jasco制備液相分離，色譜柱：YMC-Pack ODS-A(250x20mm)，流動相為甲醇、水(50:50)，流速3mL·min^-1，紫外檢測波長254nm，得0801-0815。其中，收集液相保留時間126～134min的樣品，經(jīng)減壓干燥得樣品0812，即為提取物(2)(4.1mg)。HPLC液相圖見圖24。

表6 08系列樣品重量

(2)化合物鑒定

a)化合物1為淡黃色粉末，其高分辨電噴霧質(zhì)譜(HR-ESI-MS，圖1)顯示m/z269.1753[M+H]+，說明其分子量為268，分子式為C₁₅H₂₄O₄(C₁₅H₂₄O₄理論值為268.1675)，具有4個不飽和度。1H-NMR譜顯示有23個氫信號(1個活潑氫未出)，13C-NMR譜顯示有15個碳信號，結(jié)合DEPT譜(圖2)可確定該化合物結(jié)構(gòu)中有3個次甲基、4個亞甲基、4個甲基和2個羰基碳。一系列2D-NMR(HSQC、HMBC、COSY、ROESY，圖3-圖6)推測化合物結(jié)構(gòu)如圖19中A所示。

表7化合物1的NMR波譜數(shù)據(jù)(in CDCl₃)

提取物1：C₁₅H₂₄O₄

ROESY譜中H-1與H-5的相關(guān)，說明H-1與H-5處于同側(cè)。經(jīng)查SciFinder，提取1為新化合物，命名為1，3-dimethyl-3-(4-methyl-3-methylenepentyl)-2-oxabicyclo[2,2,1]heptane-7-carboxylic acid。

b)提取物3：

(1R,3S,4R,7R)-1，

3-dimethyl-3-(4-methyl-3-methylenepentyl)-2-oxabicyclo[2,2,1]heptane-7-carboxylic acid

表8化合物3的NMR波譜數(shù)據(jù)(in CDCl₃)

化合物3為淡黃色粉末，其高分辨電噴霧質(zhì)譜(HR-ESI-MS，圖7)顯示m/z 269.1753[M+H]+，說明其分子量為268，分子式為C₁₅H₂₄O₄(C₁₅H₂₄O₄理論值為268.1675)，具有4個不飽和度。一系列NMR(圖8-圖12)數(shù)據(jù)顯示化合物5的平面結(jié)構(gòu)與化合物3相同，立體構(gòu)型不同，圖19中C。相比化合物3，-COOH的吸電子效應(yīng)使化合物5的8-C化學(xué)位移向低場移動了5.9ppm，15-C化學(xué)位移向高場移動了5.7ppm，C-5的手性與化合物3不同。經(jīng)查SciFinder，化合物3為新化合物，命名為(1R,3S,4R,7R)-1，3-dimethyl-3-(4-methyl-3-methylenepentyl)-2-oxabicyclo[2,2,1]heptane-7-carboxylic acid。

c)提取物2：

1-((1R,3S,3aA,4S,6aR)-4-hydroxy-3-methoxy-1,4-dimethylhexahydro-1H-cyclopenta[C]furan-1-yi)-4-methylpentan-3-one

表9化合物2的NMR波譜數(shù)據(jù)(in CDCl₃)

化合物2為淡黃色粉末，其高分辨電噴霧質(zhì)譜(HR-ESI-MS，圖13)顯示m/z285.2066[M+H]+，說明其分子量為284，分子式為C₁₆H₂₈O₄(C₁₆H₂₈O₄理論值為284.1988)，具有3個不飽和度。¹H-NMR譜顯示有27個氫信號(1個活潑氫未出)，¹³C-NMR譜顯示有16個碳信號，結(jié)合DEPT譜可確定該化合物結(jié)構(gòu)中有4個甲基、1個氧甲基、4個亞甲基、4個次甲基和1個羰基碳。一系列2D-NMR(HSQC、HMBC、COSY、ROESY，圖14-圖18)推測化合物結(jié)構(gòu)如圖19中C。經(jīng)查SciFinder，化合物2為新化合物，命名為1-(4-Hydroxy-3-methoxy-1,4-dimethyl-hexahydro-cyclopenta[c]furan-1-yl)-4-methyl-pentan-3-one。

實施例2澤瀉湯提取物應(yīng)用

動物模型：選用SPF級小鼠50只，雌雄兼用，體重20±5g，釆用高脂飼料喂養(yǎng)法建立實驗性小鼠高脂血癥模型。實驗前于實驗室預(yù)飼養(yǎng)一周。所有小鼠用高脂飼料喂養(yǎng)四周建立實驗性小鼠高脂血癥模型，喂養(yǎng)四周后，尾部取血，測定造模小鼠空腹TC水平，小鼠TC值大于7mmol/L視為造模成功。將動物隨機(jī)分成5組，每組10只，依次為新化合物(即澤瀉湯提取物)高、中、低劑量組，陽性對照組、高血脂癥模型組。

給藥劑量：

新化合物高劑量組：灌服高劑量新化合物(劑量為5.0mg/kg.d)。

新化合物中劑量組：灌服中劑量新化合物(劑量為2.5mg/kg.d)。

新化合物低劑量組：灌服低劑量新化合物(劑量為1.0mg/kg.d)。

陽性組：灌服辛伐他汀片劑(劑量為7.0mg/kg.d)。

高脂血癥模型組：灌服相同體積的蒸餾水。

灌胃給藥，每天一次，四周后，禁食不禁水12小時后摘眼球取血，分離血清，測定血清TC、TG、HDL-C濃度。結(jié)果見表10。

表10血清TC、TG、HDL-C濃度

給藥四周后，陽性組和新化合物高、中、低劑量組小鼠血清TC值均顯著低于高脂血癥模型組。與高脂血癥模型組相比較，陽性組、新化合物高、中、低劑量組小鼠血清TG值均存在顯著差異。陽性組小鼠血清HDL-C值、新化合物高劑量組及新化合物中劑量組與高脂血模型組比較有顯著性差異，而新化合物低劑量組則無顯著性差異。以上說明新化合物有降低血清中TC、TG的濃度，同時能升高血清中HDL-C濃度，高劑量的效果要比其他兩個劑量效果更好，低劑量效果最差。