本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(DPE)的突變體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(D-Psicose-3-Epimerase，簡(jiǎn)寫為DPE)屬于差向異構(gòu)酶類，可以催化多種酮糖C3位羥基的差向異構(gòu)，如催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖，是生產(chǎn)稀有糖的很好的生物催化劑。D-阿洛酮糖是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型功能性稀少糖，它的甜度相當(dāng)于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，具有低能量、改善腸道菌群、降低血糖、抗齲齒、預(yù)防肥胖等生理功能。2011年美國(guó)FDA批準(zhǔn)D-阿洛酮糖為GRAS物質(zhì)。自然界中，D-阿洛酮糖的含量極少且極難獲得，生物法制備D-阿洛酮糖是近年來的一個(gè)研究熱點(diǎn)。蛋白定向進(jìn)化技術(shù)自上世紀(jì)70年代被開發(fā)以后，在生物、制藥、蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究等領(lǐng)域得到了極大的應(yīng)用。定向進(jìn)化成為改造蛋白質(zhì)分子的一種有效的新策略，不僅對(duì)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系具有非常重要的意義，而且可快速產(chǎn)生工業(yè)上有巨大應(yīng)用價(jià)值的新酶，極大地推動(dòng)了酶工程在制藥、食品、環(huán)保等領(lǐng)域的快速發(fā)展。由于來源于野生菌株未經(jīng)改造的DPE酶在熱穩(wěn)定性、催化活性等方面存在一定的局限性，導(dǎo)致酶的應(yīng)用成本偏高，限制了其工業(yè)應(yīng)用范圍。目前所報(bào)道的專利和文獻(xiàn)主要是對(duì)DPE的熱穩(wěn)定性進(jìn)行改造，江南大學(xué)在梭狀芽孢桿菌ClostridiumbolteaeATCCBAA-613的DPE基礎(chǔ)上獲得了Y68I/G109P突變體(公開號(hào)CN103849612A)，熱穩(wěn)定性和催化活性均有所提高。然而，催化活性高的DPE酶的資源仍然很少，不利于D-阿洛酮糖的普及推廣。利用蛋白定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)野生型DPE酶進(jìn)行改造，以獲得高活性的、適合工業(yè)應(yīng)用的DPE酶突變體，將是生物法制備D-阿洛酮糖產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體。本發(fā)明的另一目的是提供表達(dá)上述D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體的載體或宿主菌。本發(fā)明還有一目的是提供上述D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體的應(yīng)用。技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體，至少為D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的以下突變中的一個(gè)：第86位氨基酸殘基從甘氨酸變成天冬氨酸，第164位的氨基酸殘基從天冬氨酸變成谷氨酸，第262位氨基酸殘基從色氨酸變成絲氨酸。所述的D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體，為D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的以下突變：第86位氨基酸殘基從甘氨酸變成天冬氨酸，第164位的氨基酸殘基從天冬氨酸變成谷氨酸，第262位氨基酸殘基從色氨酸變成絲氨酸。表達(dá)所述的D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體的重組載體或宿主菌。所述的D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體在制備D-阿洛酮糖中的應(yīng)用。所述的重組載體或宿主菌在表達(dá)D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體中的應(yīng)用。所述的重組載體或宿主菌在制備D-阿洛酮糖中的應(yīng)用。一種D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體的構(gòu)建方法，具體如下：1.以來源于Burkholderiasp.MR1的D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶BsDPE-pET29a質(zhì)粒為模板，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)PsDPE進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建突變體庫；2.挑取約400個(gè)單克隆，于96孔板中進(jìn)行活化、誘導(dǎo)、表達(dá)和活性測(cè)定；3.利用HPLC來檢測(cè)每個(gè)突變體的催化活性，從中篩選出催化活性有顯著提高的突變體；4.將上述催化活性顯著提高的突變體菌株送出去測(cè)序，并與野生型PsDPE序列進(jìn)行比對(duì)，從而得到影響催化活性的幾個(gè)主要突變位點(diǎn)，即G86D、D164E、W262S；5.對(duì)上述突變位點(diǎn)利用定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行組合，測(cè)定各個(gè)突變體的催化活性。DPE酶及其突變體表達(dá)的載體可以為pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k或pMA5等，表達(dá)宿主可以為大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，畢赤酵母，鏈霉菌等。有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體，含有G86D、D164E、W262S突變位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)，催化活性得到顯著提高，催化活性為野生型的1.4倍以上，大大降低了合成D-阿洛酮糖過程中的酶的用量，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。具體催化活性如下：名稱單位酶活(U/mg凍干粉)提高倍數(shù)野生型BsDPE25--G86D351.4D164E401.6W262S331.3G86D/D164E803.2G86D/W262S1214.8D164E/W262S632.5G86D/D164E/W262S2208.8附圖說明圖1是D-果糖標(biāo)準(zhǔn)品在HPLC上的保留時(shí)間結(jié)果圖；圖2是D-阿洛酮糖在HPLC上的保留時(shí)間結(jié)果圖；圖3是野生型DPE酶反應(yīng)1h的樣品HPLC圖；圖4是G86D/D164E/W262S突變體酶反應(yīng)1h的樣品HPLC圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)等譯，第三版，北京：科學(xué)出版社，2002)中所述的方法進(jìn)行。實(shí)施例1、D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體庫的建立以全基因合成的BsDPE-pET29a(+)質(zhì)粒(由常州基宇生物技術(shù)有限公司合成，質(zhì)粒上克隆有編碼SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的SEQIDNO.2所示的核苷酸序列)為模板，以引物F1和R1分別為正反向引物，進(jìn)行易錯(cuò)PCR，構(gòu)建突變體庫。引物序列如下：F1:5'-GGAATTCCATATGAACAAAGTGGGC-3'；R1：5'-CGCGGATCCTTATGCCAGTTTTTC-3'，兩端分別帶有NdeI和BamHI限制性酶切位點(diǎn)。易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系如下：10*PCRbuffer2.5μL，10mMdGTP0.5μL，10mMdTTP0.5μL，10mMdCTP2.5μL，10mMdATP2.5μL，1mMMnCl22.5μL，55mMMgCl22.5μL，10μMF11μL，10μMR11μL，Template(10ng/μL)1μL，TaqDNApolymerase(5U/μL，takara)0.2μL，ddH2O補(bǔ)齊至25μL。易錯(cuò)PCR在Bio-RadT100thermalcycler上進(jìn)行，PCR程序如下：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；15℃forever。將上述PCR反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收880bp大小的片段(具體操作見天根生化科技(北京)有限公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒操作規(guī)程)，并經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI酶切后，與經(jīng)過同樣雙酶切的pET29a(+)(Novagen)載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)，于37℃倒置過夜培養(yǎng)后，即得到DPE突變體庫，長(zhǎng)出的單克隆用于活性篩選。實(shí)施例2突變體庫的活化和誘導(dǎo)表達(dá)從上述培養(yǎng)過夜的平板上挑取單克隆至裝有1mL含終濃度為50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基的96深孔板中，于37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日，從上述過夜培養(yǎng)的96空板中吸取100μL培養(yǎng)液，加入到新鮮的1mL含終濃度為50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基的96深孔板中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)4h后，加入終濃度為1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，隨后在30℃繼續(xù)培養(yǎng)20h。一共挑取了400個(gè)單克隆，用于活性篩選。將上述誘導(dǎo)后的菌液在4℃、4000rpm離心15min，棄上清。菌體用100μL50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)懸浮，加入終濃度為0.5g/l的溶菌酶，于37℃處理1h，4℃、4000rpm離心30min，取50μL上清轉(zhuǎn)移至新的96孔板，用作活性篩選的模板。實(shí)施例3高效液相色譜HPLC高通量篩選方法的確立高效液相色譜HPLC按如下條件進(jìn)行：島津SHIMADZULC-20AHPLCwithRIDdetectororequivalent；分析柱：WatersSugar-PakI,6.5×300mmcolumn；流動(dòng)相：水；流速：0.6mL/min；柱溫：80℃；檢測(cè)器：RID，檢測(cè)器溫度60℃。以Sigma公司生產(chǎn)的D-果糖和D-阿洛酮糖純品為標(biāo)準(zhǔn)品，上樣量為20μL。色譜分析結(jié)果見圖1和2，D-果糖的保留時(shí)間為9.389min(圖1)，D-阿洛酮糖保留時(shí)間為12.233min(圖2)，兩者分離度大，可作為酶突變體篩選的方法。實(shí)施例4突變體的活性篩選在上述含50μL突變體酶上清的96孔板中，依次加入400μL25％果糖水溶液(終濃度為200g/l)、50μL5mMCoCl2溶液(終濃度為0.5mM)，于60℃反應(yīng)10min，然后在100℃處理10min滅活酶，4000rpm離心10min，取上清稀釋50倍后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以D-阿洛酮糖的生成量來篩選突變體，野生型DPE生成的D-阿洛酮糖作為對(duì)照。經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)突變體的D-阿洛酮糖的生成量要明顯高于野生型對(duì)照，該三個(gè)突變體編號(hào)分別為克隆36、125和280號(hào)。隨后將這三個(gè)克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以驗(yàn)證其活性是否顯著提高。實(shí)施例5酶突變體的擴(kuò)大培養(yǎng)和活性驗(yàn)證將野生型DPE、克隆36、125和280接種到5mL含終濃度為50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1％比例轉(zhuǎn)接到100mL含終濃度為50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)3～4h，加入終濃度為1mM的IPTG，隨后在30℃、200rpm誘導(dǎo)過夜。誘導(dǎo)后的菌液于4℃、8000rpm離心10min，菌體用20mLpH7.050mM磷酸鈉緩沖液洗滌兩次后，加入10mLpH7.050mM磷酸鈉緩沖液進(jìn)行懸浮。隨后在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎(超聲功率200W，超聲3S/間歇5S，超聲10min)。超聲后的樣品在4℃、12000rpm離心20min，上清進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干粉用作活性檢測(cè)。反應(yīng)條件和HPLC檢測(cè)條件同實(shí)施例4，凍干粉用緩沖液溶解成1mg/mL濃度，反應(yīng)體系為100mL。結(jié)果如下，野生型DPE的單位酶活為25U/mg，克隆36的單位酶活為40U/mg，克隆125的單位酶活為35U/mg，克隆280的單位酶活為33U/mg。1U相當(dāng)于在60℃、pH7.0條件下單位時(shí)間內(nèi)(1min)生成1μmol的D-阿洛酮糖所需要的酶量。三個(gè)克隆的催化活性顯著高于野生型DPE酶。隨后將這三個(gè)克隆送測(cè)序，并與野生型DPE氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)克隆36攜帶一個(gè)D164E突變，克隆125攜帶G86D突變，克隆280攜帶一個(gè)W262S突變。其中，D164E代表第164位的氨基酸殘基從天冬氨酸變成谷氨酸，G86D代表第86位氨基酸殘基從甘氨酸變成天冬氨酸，W262S代表第262位氨基酸殘基從色氨酸變成絲氨酸。實(shí)施例6多個(gè)突變位點(diǎn)聯(lián)合的突變體的構(gòu)建利用定點(diǎn)突變技術(shù)(如stratagene公司的QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKit)，將上述3個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行組合，構(gòu)建了4個(gè)突變體，分別含有以下突變位點(diǎn)：G86D/D164E、G86D/W262S、D164E/W262S、G86D/D164E/W262S(即為：第86位氨基酸殘基從甘氨酸變成天冬氨酸和第164位的氨基酸殘基從天冬氨酸變成谷氨酸、第86位氨基酸殘基從甘氨酸變成天冬氨酸喝第262位氨基酸殘基從色氨酸變成絲氨酸、第164位的氨基酸殘基從天冬氨酸變成谷氨酸和第262位氨基酸殘基從色氨酸變成絲氨酸、第86位氨基酸殘基從甘氨酸變成天冬氨酸和第164位的氨基酸殘基從天冬氨酸變成谷氨酸以及第262位氨基酸殘基從色氨酸變成絲氨酸)。將上述4個(gè)突變體進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和活性測(cè)定，反應(yīng)條件同實(shí)施例5，結(jié)果如下：名稱單位酶活(U/mg凍干粉)提高倍數(shù)野生型BsDPE25--G86D/D164E803.2G86D/W262S1214.8D164E/W262S632.5G86D/D164E/W262S2208.8實(shí)施例7利用突變體進(jìn)行D-阿洛酮糖的合成在兩個(gè)250mL三角燒瓶中分別加入100mL50％果糖溶液和11.9mg六水合氯化鈷固體粉末，在60℃水浴條件下攪拌10min后，分別加入0.25g的野生型DPE酶凍干粉和G86D/D164E/W262S突變體酶凍干粉，開始反應(yīng)，于1h取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)。結(jié)果顯示加入G86D/D164E/W262S突變體酶的反應(yīng)中D-阿洛酮糖的面積比已達(dá)到28.2％(見圖4)，而加入野生型DPE的反應(yīng)中D-阿洛酮糖的面積比僅為14.8％(見圖3)。由此可見，突變體酶的反應(yīng)催化活性要顯著高于野生型DPE酶，在工業(yè)生產(chǎn)中可大大降低酶的用量和縮短反應(yīng)時(shí)間，從而降低生產(chǎn)成本。SEQUENCELISTING<110>上海立足生物科技有限公司<120>一種D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體及其應(yīng)用<130>100<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>290<212>PRT<213>Burkholderiasp<400>1MetAsnLysValGlyMetPheTyrThrTyrTrpSerThrGluTrpMet151015ValAspPheProAlaThrAlaLysArgIleAlaGlyLeuGlyPheAsp202530MetMetGluIleSerLeuGlyGluPheHisAsnLeuProAspAlaLys354045LysArgGluLeuLysSerValAlaAspAspLeuGlyLeuThrValMet505560CysCysIleGlyLeuLysSerGluTyrAspPheAlaSerProAspLys65707580SerValArgAspAlaGlyThrGluTyrValLysArgLeuLeuAspAsp859095CysHisLeuLeuGlyAlaProValPheAlaGlyLeuThrPheCysAla100105110TrpProGlnSerProProLeuAspMetLysAspLysArgProTyrVal115120125AspArgAlaIleAspSerValArgArgValIleLysValAlaGluAsp130135140TyrGlyIleIleTyrAlaLeuGluValValAsnArgPheGluGlnTrp145150155160LeuCysAsnAspAlaLysGluAlaLeuAlaPheAlaAspAlaValAsp165170175SerProAlaCysLysValGlnLeuAspThrPheHisMetAsnIleGlu180185190GluSerSerPheArgAspAlaIleLeuAlaCysLysGlyLysMetGly195200205HisPheHisLeuGlyGluAlaAsnArgLeuProProGlyGluGlyArg210215220LeuProTrpAspGluIlePheGlyAlaLeuLysGluIleGluTyrAsp225230235240GlyThrIleValMetGluProPheMetArgLysGlyGlySerValSer245250255ArgAlaValGlyValTrpArgAspMetSerAsnGlyAlaThrAspGlu260265270GlnMetAspGluArgAlaArgArgSerLeuGlnPheValArgGluLys275280285LeuAla290<210>2<211>873<212>DNA<213>Burkholderiasp<400>2atgaacaaagtgggcatgttctatacctattggagcaccgaatggatggttgattttccg60gcaaccgcaaaacgtattgcaggtctgggttttgatatgatggaaattagcctgggcgaa120tttcataatctgccggatgcaaaaaaacgcgaactgaaaagcgttgcagatgatctgggt180ctgaccgttatgtgttgtattggtctgaaatccgaatatgattttgccagtccggataaa240agcgttcgtgatgcaggcaccgaatatgttaaacgtctgctggatgattgtcatctgctg300ggtgcaccggtttttgccggtctgaccttttgtgcatggcctcagagccctccgctggat360atgaaagataaacgtccgtatgttgatcgtgccattgatagcgttcgtcgtgttattaaa420gttgccgaagattatggcattatctatgccctggaagtggtgaatcgttttgaacagtgg480ctgtgtaatgatgcaaaagaagcactggcatttgcagatgcagttgatagtccggcatgt540aaagttcagctggatacctttcacatgaacattgaagaaagcagcttccgtgatgcaatt600ctggcctgtaaaggtaaaatgggtcattttcatctgggtgaagcaaatcgtctgcctccg660ggtgaaggtcgtctgccgtgggatgaaatttttggtgcactgaaagaaatcgagtatgat720ggcaccattgttatggaaccgtttatgcgtaaaggtggtagcgttagccgtgcagttggt780gtttggcgtgatatgagcaatggtgcaaccgatgagcagatggatgaacgtgcccgtcgt840agcctgcaatttgttcgtgaaaaactggcataa873<210>3<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>F1序列<400>3ggaattccatatgaacaaagtgggc25<210>4<211>24<212>DNA<213>Artificial<220><223>R1序列<400>4cgcggatccttatgccagtttttc24當(dāng)前第1頁1 2 3