本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)的分離純化領域，尤其涉及一種重組枯草桿菌纖溶酶的分離純化方法。

背景技術：

我國人口眾多，人口老齡化速度加快，心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率不斷上升，而且心腦血管疾病發(fā)病的年輕化趨勢越來越嚴重，每年因患心腦血管疾病死亡的人數(shù)高達700萬人，心腦血管疾病患病人數(shù)已經(jīng)超過3億，已經(jīng)成為人類健康的頭號殺手。僅在我國整個心腦血管疾病相關市場已經(jīng)超過1萬億元。而心腦血管疾病背后主要致病原因是血栓的形成。但是，目前血栓栓塞性疾病的治療主要有外科手術、保守療法和溶栓療法3種方法都存在一定的缺陷。外科手療法風險很大，而且手術部位血管變薄，容易導致血管破裂出血，此外人造血管部位更容易再次形成血栓；保守療法主要指長期服用西藥，西藥療法讓患者長期服用抗血栓藥物，包括抗凝劑、抗血小板聚集藥物和降血壓藥物，降低凝血傾向。長期服用西藥加速血管老化，使血管變脆變薄，導致血管破裂引起嚴重的出血性副作用，溶栓療法是目前認為治療血栓栓塞性疾病最為有效并且可靠的手段，但是，市場上溶栓藥物因為存在半衰期過短、特異性低引起出血性副作用等瓶頸問題而難以得到普及，并且只能用于注射搶救用藥。因此，市場上非常缺乏可以長期服用且安全有效的預防和治療血栓栓塞性疾病的溶栓藥物。

枯草桿菌纖溶酶是由枯草芽孢桿菌分泌的一種纖維蛋白溶解酶，首先是從日本古老的發(fā)酵食品納豆中分離得到。枯草桿菌纖溶酶對人體纖維蛋白/纖維蛋白原具有靶向的溶解功效，與目前市場上在售的心腦血管疾病治療藥物相比，枯草桿菌纖溶酶可以靶向溶解血栓中起到主體支撐作用的膠聯(lián)纖維蛋白，從而發(fā)揮瓦解血栓再通血管的功效，并且安全無毒副作用。因此，枯草桿菌纖溶酶在心腦血管疾病的預防和治療領域具有無限的發(fā)展前景。但是，目前應用于該蛋白的分離純化關鍵技術還沒有得到有效解決，而分離純化大量得到高度純化的枯草桿菌纖溶酶，是實現(xiàn)枯草桿菌纖溶酶藥物的開發(fā)并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的必要前提。而枯草桿菌纖溶酶自上世紀80年代發(fā)現(xiàn)以來，一直依靠傳統(tǒng)大豆固體發(fā)酵很難實現(xiàn)枯草桿菌纖溶酶的大量分離純化。由于固體發(fā)酵含量極低，并且發(fā)酵產(chǎn)物及其復雜，勢必造成純化成本極其高昂。因此枯草桿菌纖溶酶一直用于保健食品領域的開發(fā)，并沒有發(fā)揮其自身的重要藥用價值。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種重組枯草桿菌纖溶酶的分離純化方法，能夠獲得高純度的重組枯草桿菌纖溶酶，而且操作簡單，易于產(chǎn)業(yè)化放大。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：

一種重組枯草桿菌纖溶酶的分離純化方法，包括以下步驟：

1)疏水層析：選用苯基瓊脂糖系列疏水填料填充層析柱,使用A液沖洗平衡層析柱，紫外吸收波長為280納米進行檢測，重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液去除菌體后直接上樣到疏水層析柱中，繼續(xù)流加A液，直至流穿峰流穿完全，更換B液進行洗脫，直至與填料相結合的重組枯草桿菌纖溶酶被全部洗脫，得到高純度的重組枯草桿菌纖溶酶液；

2)脫鹽層析：流動相緩沖液為B液，調(diào)節(jié)純化設備的紫外吸收波長為280納米,選用G25脫鹽填料填充層析柱；流加一個柱體積等量的B液，將疏水層析中所得的純化液上樣到G25脫鹽填料填充的層析柱中進行脫鹽處理，收集流出的重組枯草桿菌纖溶酶蛋白峰，得到脫鹽純化液。

本發(fā)明還提供一種重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液的制備方法，包括以下步驟：

1)菌種活化：取菌種庫保存的重組枯草桿菌纖溶酶的重組酵母菌，在YPD固體培養(yǎng)基中劃線，28度培養(yǎng)48-72小時，挑取單菌落接種到200毫升的YPD液體培養(yǎng)基中，于搖床中28度培養(yǎng)18-24小時，待OD600達到6-10時，進行發(fā)酵罐接種發(fā)酵；

2)接種：將活化好的200毫升種子液以10％接種量接種到7升發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為2升；

3)批量生長階段：設定發(fā)酵溫度為28度，28％的氫氧化銨自動調(diào)整pH維持在5.0,保證發(fā)酵過程中溶氧DO大于20％，直至甘油完全消耗，DO接近100％，重組酵母細胞的產(chǎn)量為90-150克/升的濕重；

4)甘油的流加階段：設定初始補加速率為每升初始發(fā)酵液中每小時流加甘油量為10-15毫升，保證發(fā)酵過程中過程中DO大于20％，甘油的補充要在4小時或者以上，末期重組酵母細胞的濕重達到180～220克/升；

5)甲醇誘導階段：停止流加甘油補充液后直至發(fā)酵液中的甘油消耗完全，DO升至100％保持40分鐘左右，誘導溫度降低到26度，設定甲醇補加速率為每升初始發(fā)酵液中每小時流加甘油量為3.6毫升,2-4小時后，DO讀數(shù)穩(wěn)定，補給速率加倍到7.3毫升/小時/升；2個小時后，甲醇的補給速率增加到10.9毫升/小時/升直至發(fā)酵結束；保證發(fā)酵過程中DO大于20％；整個甲醇的補給階段持續(xù)70小時，每升初始發(fā)酵體積需要500-750毫升的甲醇補給；

6)收罐：發(fā)酵液于4℃下，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清液，即得重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液，所得的重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液的蛋白含量可達到6.0-8.5克/升。

進一步，所述A液為pH值為6.50的20毫摩爾磷酸緩沖液中加1摩爾氯化鈉；所述B液為pH值為6.50的20毫摩爾磷酸緩沖液。

進一步，所述疏水層析柱的大小為5厘米×20厘米。

進一步，所述苯基瓊脂糖系列疏水填料的體積為500毫升。

進一步，所述G25脫鹽填料的體積為3升。

進一步，以質(zhì)量體積百分比計，所述YPD固體培養(yǎng)基的配方為：酵母提取物1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、瓊脂1.5％；所述YPD液體培養(yǎng)基的配方為：酵母提取物1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％。

進一步，以質(zhì)量體積百分比計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為KH2PO4 5克/升、CaSO4·2H2O 1克/升、MgSO4 10克/升、K2SO4 10克/升、NH4H2PO440克/升、KOH 1.5克/升、甘油40克/升。

本發(fā)明還提供一種脫鹽純化液重組枯草桿菌纖溶酶純度的檢測方法，包括以下步驟：

上樣前5％E加95％D液平衡柱，將20微升的脫鹽后的重組枯草桿菌纖溶酶純化夜上樣，0-15分鐘，D液由95％線性下降到5％線性，E液由5％線性上升到95％線性進行線性洗脫，16-21分鐘，5％E加95％D液平衡柱，DAD檢測器，280納米檢測，流速1毫升/分鐘，色譜柱為C18柱。

進一步，所述D液為含0.1％TFA的純水；所述E液為含0.1％TFA的乙腈。

本發(fā)明的有益效果為：本專利在枯草桿菌纖溶酶重組酵母發(fā)酵的基礎上，在發(fā)酵培養(yǎng)液中建立了中試水平的枯草桿菌纖溶酶分離純化方法，通過該方法可以大量獲得高度純化的纖溶酶，純度可以達到95％，并且操作簡單，易于產(chǎn)業(yè)化放大。大量獲得高純度的枯草桿菌纖溶酶為藥物開發(fā)提供了必要前提，具有巨大的發(fā)展?jié)摿褪袌鰬脙r值。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例1

如表1所示，根據(jù)重組枯草桿菌纖溶酶蛋白特點，依據(jù)純化效率和最終蛋白純化純度進行，苯基瓊脂糖系列疏水填料的種類可以選擇以下幾種：Phenyl Sepharose 6FF(HS)、Octyl Sepharose FF、CM-Sepharose FF、Benzamidine 4FF(HS)，Phenyl Sepharose 6FF(HS)和Benzamidine 4FF(HS)兩種填料的純度都超過95％，考慮到成本因素，最后綜合比較選擇確定純化填料為Phenyl Sepharose 6FF(HS)。本實施例以Phenyl Sepharose6FF(HS)為例來說明。

一種重組枯草桿菌纖溶酶的分離純化方法，包括以下步驟：

1)疏水層析：選用Phenyl Sepharose 6FF(HS)填充層析柱,流動相緩沖液為A液和B液，調(diào)節(jié)純化設備(純化設備為江蘇漢邦NP7000制備泵，NU3000檢測器)紫外吸收波長為280納米,注射泵流速為20毫升/分鐘，A液平衡柱總共流加三個柱的體積，共1500ml，將重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液上500毫升,繼續(xù)流加A液，直至流穿峰流穿完全，280納米紫外吸收達到基線。然后更換B液進行洗脫，直至重組枯草桿菌纖溶酶全部洗脫，得純化液共650毫升，此為高純度的重組枯草桿菌纖溶酶液；

其中，A液為pH值為6.50的20毫摩爾磷酸緩沖液中加1摩爾氯化鈉；B液為pH值為6.50的20毫摩爾磷酸緩沖液。

疏水層析柱的大小為5厘米×20厘米。

Phenyl Sepharose(苯基瓊脂糖)6FF(HS)的體積為500毫升。

2)脫鹽層析：

流動相緩沖液為B液，調(diào)節(jié)純化設備紫外吸收波長為280納米,選用G25脫鹽填料填充層析柱；注射泵流速為30毫升/分鐘，流加1個柱體積為3升的緩沖液平衡柱,將疏水層析中所得的純化液全部上樣進行脫鹽處理，收集流出的重組枯草桿菌纖溶酶蛋白峰，得到脫鹽純化液共1.2升。

其中，G25(葡聚糖G-25)脫鹽填料的體積為3升。

一種重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液的制備方法，包括以下步驟：

1)菌種活化：取菌種庫保存的重組枯草桿菌纖溶酶的重組酵母菌，在YPD固體培養(yǎng)基中劃線，28度培養(yǎng)48-72小時，挑取單菌落接種到200毫升的YPD液體培養(yǎng)基中，于搖床中28度培養(yǎng)18-24小時，待OD600達到6-10時，進行發(fā)酵罐接種發(fā)酵；

2)接種：將活化好的200毫升種子液以10％接種量接種到7升發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為2升；

3)批量生長階段：設定發(fā)酵溫度為28度，28％的氫氧化銨自動調(diào)整pH維持在5.0,保證發(fā)酵過程中溶氧DO大于20％，直至甘油完全消耗，DO接近100％，重組酵母細胞的產(chǎn)量為90-150克/升的濕重；

4)甘油的流加階段：設定初始補加速率為每升初始發(fā)酵液中每小時流加甘油量為10-15毫升，保證發(fā)酵過程中過程中DO大于20％，甘油的補充要在4小時或者以上，末期重組酵母細胞的濕重達到180～220克/升；

5)甲醇誘導階段：停止流加甘油補充液后直至發(fā)酵液中的甘油消耗完全，DO升至100％保持40分鐘左右，誘導溫度降低到26度，設定甲醇補加速率為每升初始發(fā)酵液中每小時流加甘油量為3.6毫升,2-4小時后，DO讀數(shù)穩(wěn)定，補給速率加倍到7.3毫升/小時/升；2個小時后，甲醇的補給速率增加到10.9毫升/小時/升直至發(fā)酵結束；保證發(fā)酵過程中DO大于20％；整個甲醇的補給階段持續(xù)70小時，每升初始發(fā)酵體積需要500-750毫升的甲醇補給；

6)收罐：發(fā)酵液于4℃下，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清液，即得重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液，所得的重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液的蛋白含量可達到6.0-8.5克/升。

以質(zhì)量體積百分比計，YPD(酵母粉蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基)固體培養(yǎng)基的配方為：酵母提取物1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、瓊脂1.5％；YPD液體培養(yǎng)基的配方為：酵母提取物1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％。

以質(zhì)量體積百分比計，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為KH2PO4 5克/升、CaSO4·2H2O 1克/升、MgSO4 10克/升、K2SO4 10克/升、NH4H2PO4 40克/升、KOH 1.5克/升、甘油40克/升。

一種脫鹽純化液重組枯草桿菌纖溶酶純度的檢測方法，包括以下步驟：

上樣前5％E加95％D液平衡柱，將20微升的脫鹽后的重組枯草桿菌纖溶酶純化夜上樣，0-15分鐘，D液由95％線性下降到5％線性，E液由5％線性上升到95％線性進行線性洗脫，16-21分鐘，5％E加95％D液平衡柱，DAD檢測器，280納米檢測，流速1毫升/分鐘，色譜柱為C18柱。

D液為含0.1％TFA(三氟乙酸)的純水；E液為含0.1％TFA的乙腈。

脫鹽純化液蛋白含量檢測：檢測得蛋白含量達到3.6mg/ml。所述蛋白含量檢測方法參考中國藥典2015版。

脫鹽純化液體外纖溶酶活性檢測：檢測得重組枯草桿菌體外纖溶酶活性達到46838IU/ml。所述體外纖溶酶活性檢測方法以尿激酶為標準品，具體方法參考中國藥典2015版鏈激酶活性測定方法。

脫鹽純化液酵母宿主菌體蛋白含量檢測：檢測得純化液中宿主蛋白含量為21μg/ml,小于總蛋白含量的0.5％。所述酵母宿主菌體蛋白含量檢測方法參考中國藥典2015版。

綜上，經(jīng)過重組酵母發(fā)酵得到的發(fā)酵液，經(jīng)過一步疏水層析即可得到95％純度的重組枯草桿菌纖溶酶，活性達到46838IU/ml，為該領域活性領先水平。并且經(jīng)過脫鹽處理后，其純度、宿主菌體蛋白含量完全達到了藥典所規(guī)定的生物制品注射藥劑的要求。因此，應用本專利所闡述的重組枯草桿菌纖溶酶純化方法所得到的純化蛋白完全可以應用于枯草桿菌纖溶酶口服藥物和注射藥物的開發(fā)，應用于目前形勢嚴峻的心腦血管疾病的預防和治療領域。具有巨大的市場發(fā)展前景和應用價值，可創(chuàng)造巨額市場利潤。

表1：不同填料選擇下，重組酵母發(fā)酵液中枯草桿菌纖溶酶純化效率和純度

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。