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一種重組枯草桿菌纖溶酶的分離純化方法與流程

文檔序號:11808855閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種重組枯草桿菌纖溶酶的分離純化方法,其特征在于,包括以下步驟:

1)疏水層析:選用苯基瓊脂糖系列疏水填料填充層析柱,使用A液沖洗平衡層析柱,紫外吸收波長為280納米進行檢測,重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液去除菌體后直接上樣到疏水層析柱中,繼續(xù)流加A液,直至流穿峰流穿完全,更換B液進行洗脫,直至與填料相結合的重組枯草桿菌纖溶酶被全部洗脫,得到高純度的重組枯草桿菌纖溶酶液;

2)脫鹽層析:流動相緩沖液為B液,調(diào)節(jié)純化設備的紫外吸收波長為280納米,選用G25脫鹽填料填充層析柱;流加一個柱體積等量的B液,將疏水層析中所得的純化液上樣到G25脫鹽填料填充的層析柱中進行脫鹽處理,收集流出的重組枯草桿菌纖溶酶蛋白峰,得到脫鹽純化液。

2.一種重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:

1)菌種活化:取菌種庫保存的重組枯草桿菌纖溶酶的重組酵母菌,在YPD固體培養(yǎng)基中劃線,28度培養(yǎng)48-72小時,挑取單菌落接種到200毫升的YPD液體培養(yǎng)基中,于搖床中28度培養(yǎng)18-24小時,待OD600達到6-10時,進行發(fā)酵罐接種發(fā)酵;

2)接種:將活化好的200毫升種子液以10%接種量接種到7升發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中,初始發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為2升;

3)批量生長階段:設定發(fā)酵溫度為28度,28%的氫氧化銨自動調(diào)整pH維持在5.0,保證發(fā)酵過程中溶氧DO大于20%,直至甘油完全消耗,DO接近100%,重組酵母細胞的產(chǎn)量為90-150克/升的濕重;

4)甘油的流加階段:設定初始補加速率為每升初始發(fā)酵液中每小時流加甘油量為10-15毫升,保證發(fā)酵過程中過程中DO大于20%,甘油的補充要在4小時或者以上,末期重組酵母細胞的濕重達到180~220克/升;

5)甲醇誘導階段:停止流加甘油補充液后直至發(fā)酵液中的甘油消耗完全,DO升至100%保持40分鐘左右,誘導溫度降低到26度,設定甲醇補加速率為每升初始發(fā)酵液中每小時流加甘油量為3.6毫升,2-4小時后,DO讀數(shù)穩(wěn)定,補給速率加倍到7.3毫升/小時/升;2個小時后,甲醇的補給速率增加到10.9毫升/小時/升直至發(fā)酵結束;保證發(fā)酵過程中DO大于20%;整個甲醇的補給階段持續(xù)70小時,每升初始發(fā)酵體積需要500-750毫升的甲醇補給;

6)收罐:發(fā)酵液于4℃下,8000轉/分鐘離心10分鐘,收集上清液,即得重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液,所得的重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液的蛋白含量可達到6.0-8.5克/升。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種重組枯草桿菌纖溶酶的分離純化方法,其特征在于:所述A液為pH值為6.50的20毫摩爾磷酸緩沖液中加1摩爾氯化鈉;所述B液為pH值為6.50的20毫摩爾磷酸緩沖液。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種重組枯草桿菌纖溶酶的分離純化方法,其特征在于:所述疏水層析柱的大小為5厘米×20厘米。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種重組枯草桿菌纖溶酶的分離純化方法,其特征在于:所述苯基瓊脂糖系列疏水填料的體積為500毫升。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種重組枯草桿菌纖溶酶的分離純化方法,其特征在于:所述G25脫鹽填料的體積為3升。

7.根據(jù)權利要求2所述的一種重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液的制備方法,其特征在于:以質(zhì)量體積百分比計,所述YPD固體培養(yǎng)基的配方為:酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、瓊脂1.5%;所述YPD液體培養(yǎng)基的配方為:酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%。

8.根據(jù)權利要求2所述的一種重組枯草桿菌纖溶酶的發(fā)酵液的制備方法,其特征在于:以質(zhì)量體積百分比計,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為KH2PO45克/升、CaSO4·2H2O 1克/升、MgSO410克/升、K2SO4 10克/升、NH4H2PO4 40克/升、KOH 1.5克/升、甘油40克/升。

9.一種脫鹽純化液重組枯草桿菌纖溶酶純度的檢測方法,其特征在于,包括以下步驟:

上樣前5%E加95%D液平衡柱,將20微升的脫鹽后的重組枯草桿菌纖溶酶純化夜上樣,0-15分鐘,D液由95%線性下降到5%線性,E液由5%線性上升到95%線性進行線性洗脫,16-21分鐘,5%E加95%D液平衡柱,DAD檢測器,280納米檢測,流速1毫升/分鐘,色譜柱為C18柱。

10.根據(jù)權利要求9所述的一種脫鹽純化液重組枯草桿菌纖溶酶純度的檢測方法,其特征在于:所述D液為含0.1%TFA的純水;所述E液為含0.1%TFA的乙腈。

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