本發(fā)明涉及是生物質發(fā)酵生產乙醇的技術，特別是一種提高乙醇產率的釀酒酵母spt15定點飽和基因突變方法

背景技術：

傳統(tǒng)的生物乙醇生產主要以糧食發(fā)酵為主,世界糧食緊缺現象嚴重限制了原料來源。木質纖維素是世界上最為豐富的生物質資源，量最大、價最廉,每年的總產量約占所有生物質資源的50％^[1]，但目前大多數此類的物質沒有得到高效利用。以生物質為原料制取的工業(yè)乙醇,作為一種清潔的可再生能源,是替代石油等化石燃料的必然趨勢,已被納入許多國家的發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃。

釀酒酵母(S.cerevisiae)是真核微生物,細胞壁厚、固醇含量高,對乙醇及木質纖維素水解物中毒性因子的耐受性較高[3]；能在低pH、嚴格厭氧條件下快速發(fā)酵葡萄糖生產乙醇,副產物少；不易被細菌和病毒污染,且相關工業(yè)技術成熟。釀酒酵母全基因組測序已完成[4],是迄今為止研究最透徹的真核微生物,可利用生物信息學的方法和手段,以及日趨完善的分子生物學技術,對其進行基因操作和代謝網絡的重構。是乙醇發(fā)酵的研究重點和首要目標微生物。酵母菌的乙醇耐受性與多個基因有關，因而通過傳統(tǒng)的單基因敲除或過量表達很難達到提高酵母菌乙醇耐性和提高乙醇產率的目的。2006年Alper等報道了通過gTME的方法提高酵母菌乙醇產率和耐性的開創(chuàng)性研究，為酵母菌乙醇產率和耐性代謝工程操作提供了新的思路。

轉錄水平調控是基因表達調控中效率最高的一個環(huán)節(jié)。全局轉錄機制工程(Global transcription machinery engineering,gTME)是一種通過基因轉錄重排來優(yōu)化細胞表型的技術^[6]，它通過分子生物學方法，如易錯PCR、DNA改組等，建立起始轉錄因子突變庫，改造全局轉錄調控因子，針對目的產品或目標表型進行定向篩選，使整個轉錄調控過程發(fā)生變化從而改變或提高目標基因的轉錄及表達，獲得目的代謝流增強或特定表型增強的菌種。轉錄是由RNA聚合酶執(zhí)行的，在真核生物中RNA聚合酶Ⅱ負責轉錄產生大部分功能基因的mRNA，而RNA聚合酶Ⅱ轉錄效率是由起始轉錄因子和啟動子結合能力決定的。釀酒酵母中起始轉錄因子之一的spt15屬于轉錄起始復合物部分,，是一種TATA結合蛋白^[7]，參與轉錄起始復合物的形成，控制基因表達效率。它與相關基因啟動子區(qū)域TATA結合能力的改變，影響相關基因表達效率，從而引起菌種的表型變化。它的突變使相關基因過量表達,在表型上提高了酵母對乙醇耐受能力。

中國專利：一種突變的釀酒酵母起始轉錄因子及其編碼基因與應用(ZL200810024036.8)它利用隨機突變技術突變轉錄因子spt15基因，經過篩選獲得spt15的一個突變體spt15-6；另一個中國專利：突變的釀酒酵母起始轉錄因子基因及其表達載體和應用(ZL201310008539.7)也是利用隨機突變技術突變轉錄因子spt15基因，經過篩選獲得spt15的一個突變體spt15-10。它們與原釀酒酵母spt15基因序列的比對有明顯的變化。將它們利用基因工程技術構建重組釀酒酵母，發(fā)酵檢測乙醇產率都有變化，但對工程應用來說，都不理想，即乙醇產率還應進一步提高。

本發(fā)明從野生型酵母菌株中擴增得到起始轉錄調控因子基因spt15，用定點飽和突變法獲得突變基因，并構建到pYES2NTc載體，通過醋酸鋰法轉化到釀酒酵母INVSC1中表達，對獲得的重組酵母菌乙醇產量進行測定。經篩選得到2個點突變spt15基因。突變后重組的重組釀酒酵母的代謝特性大大提高，也就是大大提高了其乙醇產率。

參考文獻

[1]Liu HM,Xu L,Yan M,et al.gTME for construction of recombinant yeast co-fermenting xylose and glucose.Chin J Biotech,2008,24(6):1 6.

劉紅梅,許琳,嚴明,等.gTME構建共發(fā)酵木糖和葡萄糖的重組釀酒酵母.生物工程學報,2008,24(6):1 6.

[2]Hal A,Gregory S.Global transcription machinery engineering:A new approach for improving cellular phenotype.MetabEng,2007,9:258 267.

技術實現要素：

本發(fā)明提出一種利用基因工程手段對釀酒酵母的spt15定點飽和基因突變，提高乙醇產率的方法。

本發(fā)明是這樣實現的。一種提高乙醇產率的釀酒酵母spt15定點飽和基因突變的方法，其步驟為：

1、釀酒酵母S.cerevisiaeINVSC1spt15基因的擴增及重組質粒構建

a)運用基因組提取試劑盒，提取S.cerevisiaeINVSC1基因組。以S.cerevisiae總DNA為模板，使用Spt15_Forward和Spt15_Reverse引物PCR擴增釀酒酵母起始轉錄因子spt15基因。PCR循環(huán)參數為:94℃，5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 2min，30個循環(huán)。用膠回收試劑盒(TaKaRa公司)對擴增出的基因進行純化回收。

其中引物：Spt15_Forward5'-ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGGAGTTTA-3'

Spt15_Reverse5'-TCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCACAGGGTATATAG-3'

原始spt15基因序列見序列表SEQ ID No.1

b)回收后的spt15基因與pMD18-T(TaKaRa公司)載體連接，氯化鈣法將連接載體轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，提取單克隆重組質粒pMD18-spt15，經測序得到基因序列spt15正確。接著使用Spt15_yes2ntF和Spt15_yes2ntR引物PCR擴增pMD18-spt15質粒上的spt15基因。PCR循環(huán)參數為:94℃，5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 2min，30個循環(huán)。經NotⅠ，BamHⅠ雙酶切后用膠回收試劑盒(TaKaRa公司)對擴增出的基因進行純化回收。

其中引物：Spt15_yes2ntF5'-GGATCCGCCGATGAGGAACGTTTA-3'

Spt15_yes2ntR5'-GCGGCCGCTCACATTTTTCTAAATTCAC-3'

c)回收后的spt15基因與經NotⅠ，BamHⅠ雙酶切并回收后的pYES2NTc線性載體連接，氯化鈣法將連接載體轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，提取單克隆重組質粒pYES2NTc-spt15，經測序得到基因序列spt15正確。

2、定點飽和突變基因庫及重組釀酒酵母的獲得

a)通過spt15序列的同源比對和三維結構分析，發(fā)現Lys127位點位于對稱結構的中間結合部位，此位點的突變可能影響spt15與spt3的結合，因此選定該位點為突變位點。

b)根據反向重疊延伸PCR(overlap extension PCR)原理，設計一對突變引物Spt15_mutF和Spt15_mutR，其中小寫劃線字母部分即為突變位點，對應127位氨基酸密碼子。

首先，以重組質粒pYES2NTc-spt15為模板，使用引物Spt15_mutF和Spt15_mutR進行質粒擴增，PCR擴增循環(huán)參數為94℃ 50sec，62℃ 45sec，72℃ 7min，30個循環(huán)，最后，72℃延伸10min，反向擴增得到包含載體序列和基因序列的線性片段，經過DpnⅠ酶消化模板后，膠回收，自連接，轉化大腸桿菌DH5α，卡那霉素抗性平板篩選轉化子，測序鑒定是否為突變基因。突變基因序列與原釀酒酵母spt15基因序列^[10]的比對結果顯示，共獲得在第127位賴氨酸的12個不同的點突變，其他位點未發(fā)生突變。12個點突變結果見表1。

其中引物：Spt15_mutF5'-ATGGTTGTTACCGGTGCAnnkAGTGAGGATGACTCA-3'

Spt15_mutR5'-TGCACCGGTAACAACCATTTTCCCTGAGGCAAAAATTAAAGC-3'

c)將含有突變的和未突變的spt15基因重組質粒，利用醋酸鋰法^[9]轉化入釀酒酵母INVSC1。使用SX篩選培養(yǎng)基篩選轉化子，得到含有spt15突變基因的一系列重組釀酒酵母(共12個)，按突變基因序號分別命名為系列重組釀酒酵母INVSC1-spt15-X,其中X為F、V、R、M、L、G、T、S、Q、D、N、I(見表1)。

表1定點飽和突變位點密碼子和氨基酸

3、重組釀酒酵母INVSC1-spt15-X發(fā)酵實驗、結果分析及篩選。

將上述得到的12個重組釀酒酵母和對照組分別接種于50mL種子培養(yǎng)基中，30℃、200r/min培養(yǎng)24h，以10％(V/V)接種于含100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，將菌液適當稀釋后在600nm下測定吸光度值,選擇在對數生長期的菌株分別接種到100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃、200r/min厭氧發(fā)酵培養(yǎng)。測定乙醇含量和殘?zhí)橇?。發(fā)酵液樣品經0.45μm醋酸纖維濾膜過濾，采用SBA-40C型生物傳感分析儀及試劑(山東省科學院生物研究所)進行乙醇濃度和葡萄糖濃度的檢測。經測定分析和篩選，重組菌重組釀酒酵母INVSC1-SPT15-M，INVSC1-SPT15-N，利用葡萄糖產乙醇產率有大幅度提高，在葡萄糖培養(yǎng)基中的乙醇產率分別為43.0±0.9g/L和43.7±0.2g/L。分別比對照菌株增加17.8％和19.7％。

優(yōu)選的spt15-M突變基因序列見SEQ ID No.2，該突變基因在127位由賴氨酸突變?yōu)榧琢虬彼帷?/p>

優(yōu)選的spt15-N突變基因序列見SEQ ID No.3，該突變基因在127位分別由賴氨酸突變?yōu)樘於０贰?/p>

本發(fā)明的原理是這樣的。細胞的表型是由眾多基因綜合決定的，構建一個理想表型的菌株需要同時進行多基因的修飾，然而引入這些修飾的能力通常是很有限的?；虮磉_調控發(fā)生在遺傳信息傳遞的各個水平上，而轉錄調控是基因表達調控中最重要的一個環(huán)節(jié)。全局轉錄機制工程方法允許改變許多末端基因的表達。即通過對于轉錄蛋白應答的變更,使得整個轉錄子產生大的擾動。通過改造起始轉錄調控因子spt15，利用特定篩選條件得到優(yōu)化的目標表型，就是通過起始轉錄因子的改變來實現多基因的同時改變從而調節(jié)整個的代謝網絡。

本發(fā)明選定Lys127位點作為突變點進行定點飽和突變，取得明顯的技術效果。

本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點。本發(fā)明方法簡單，操作容易，乙醇產率提高效果明顯。具有很好的經濟效益和社會效益。

附圖說明

圖1.spt15基因的克隆及pYES2NTc-spt15重組質粒的電泳檢測驗證

其中(A)1:spt15的PCR產物；M:DNA marker DL2000

(B)1:pMD18-spt15質粒的雙酶切驗證；M:DNA marker DL10000

(C)1:pYES2NTc-spt15質粒的PCR驗證；2:pYES2NTc-spt15質粒；

3:pYES2NTc-spt15單酶切產物；M:DNA marker DL5000

圖2突變基因重組酵母INVSC1-spt15-X的糖利用情況

圖3突變基因重組酵母INVSC1-spt15-X與對照菌株的乙醇產率

圖4突變基因重組酵母菌株INVSC1-SPT15-M，INVSC1-SPT15-N和對照菌株重組菌INVSC1-G418的乙醇產量和葡萄糖利用曲線；

圖5野生型酵母菌株中起始轉錄調控因子基因spt15的三維結構及突變位點；

具體實施方式

下面以實例對本發(fā)明進一步說明：

實施例1：spt15基因的克隆及其重組質粒的構建

以S.cerevisiaeINVSC1的基因組DNA為模板，利用設計的引物進行PCR反應，PCR產物電泳檢測在0.75kb左右有一明顯條帶(圖1)。將PCR產物經純化回收后和克隆載體pMD18-T連接,連接產物轉化大腸桿菌E.coli DH5α，利用藍白斑篩選出陽性轉化子pMD18-spt15，質粒測序結果表明得到的spt15序列正確,和基因庫中基因序列同源性100％(GenBank基因編號M29459.1，蛋白質編號AAA34458.1)。

在質粒pMD18-spt15上經PCR擴增，經NotⅠ，BamHⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收純化。回收后的spt15基因與經NotⅠ，BamHⅠ雙酶切并回收后的pYES2NTc線性載體連接，經過PCR和酶切驗證獲得重組質粒pYES2NTc-spt15，經測序得到基因序列spt15。

實施例2定點飽和突變基因庫及重組釀酒酵母的獲得

以實施例1獲得的重組質粒pYES2NTc-spt15為模板，進行反向重疊延伸PCR，經過DpnⅠ酶消化、回收后自連接，轉化大腸桿菌DH5α，卡那霉素抗性平板篩選轉化子，測序鑒定是否為突變基因。突變基因序列與原釀酒酵母spt15基因序列^[10]的比對結果顯示，共獲得在第127位賴氨酸的12個不同的點突變，其他位點未發(fā)生突變。12個點突變結果見表1。

實施例3突變基因重組釀酒酵母篩選

將含有突變的和未突變的spt15基因重組質粒，利用醋酸鋰法^[9]轉化入釀酒酵母INVSC1。使用缺少尿嘧啶的篩選培養(yǎng)基篩選轉化子，得到含有spt15突變基因的一系列重組釀酒酵母。按突變基因序號分別命名為系列重組釀酒酵母INVSC1-spt15-X,其中X為K、F、V、R、M、L、G、T、S、Q、D、N、I(見表1)。其中K為未突變。

實施例4 INVSC1-spt15-X突變基因重組酵母的糖利用情況

大部分基因都顯示葡萄糖消耗速率有不同程度的降低。尤其是SPT15-N,SPT15-K。但對照菌株與突變基因重組菌株均在12小時內葡萄糖即消耗完全，表明葡萄糖消耗速率并不影響其乙醇產量。(見圖3)

實施例5突變基因重組酵母菌INVSC1-spt15-X厭氧發(fā)酵乙醇產量的檢測

對照菌株INVSC1-G418和重組菌株INVSC1-spt15-X在100g/L的葡萄糖培養(yǎng)基中，30℃、200r/min的條件下發(fā)酵48h后得到的乙醇產量如表2所示。

與對照菌INVSC1-G418相比，INVSC1-SPT15-L，INVSC1-SPT15-G，INVSC1-SPT15-K，INVSC1-SPT15-I，INVSC1-SPT15-S乙醇產量基本沒有變化，最高峰都在24h。而INVSC1-SPT15-T，INVSC1-Spt3，INVSC1-SPT15-Q，INVSC1-SPT15-F，INVSC1-SPT15-V，INVSC1-SPT15-D乙醇產率明顯下降，乙醇產率在25-29g/L左右。是對照菌株的68.5％-79.5％。而SPT15-R的雖然最高乙醇產率與對照菌相比變化不大，但乙醇達到最高產量的時間從24h推遲到48h。

重組酵母菌INVSC1-SPT15-M，INVSC1-SPT15-N，利用葡萄糖產乙醇產率有大幅度提高，在葡萄糖培養(yǎng)基中的乙醇產率分別為43.0±0.9g/L和43.7±0.2g/L。分別比對照菌株增加17.8％和19.7％。該結果初步揭示出起始轉錄因子spt15基因的有效突變使釀酒酵母的代謝途徑和代謝流發(fā)生了重大變化。

表2重組菌與對照菌株相同條件下的產乙醇比較

本發(fā)明使用的材料說明。

大腸桿菌Escherichia coli DH5、釀酒酵母宿主菌株為Saccharomyces cerevisiaeINVSC1、酵母表達載體pYES2NTc均可以購買。

實驗所用基因組DNA提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，限制性內切酶NotⅠ,BamHⅠ購自NEB公司，pMD18-T vector、膠回收試劑盒為大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)生產，引物合成，質粒提取試劑盒，Taq聚合酶、dNTP Mixture氨芐抗生素為上海生工生物工程公司生產，TransTaq DNA Polymerase High Fidelity高保真PCR聚合酶為全式金公司生產，基因序列的測定由英駿(Invitrogen)生物有限公司完成。其他試劑為分析純。

培養(yǎng)基

大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加50μg/mL氨芐青霉素。釀酒酵母用YPAD培養(yǎng)基培養(yǎng)。

基本培養(yǎng)基(YPAD)(g/L):酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，腺嘌呤硫酸鹽0.075。

篩選培養(yǎng)基(SX)(g/L):不含氨基酸酵母氮源(YNB)6.7，必需氨基酸混合物(缺尿嘧啶)1.3，葡萄糖20，瓊脂粉20。

種子培養(yǎng)基(g/L):酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖100。