本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水稻OsRhoGAP2基因在改變水稻粒形中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的糧食作物之一，為全球一半以上的人口提供食物和營養(yǎng)來源。隨著人口的增長和耕地面積的日益減少，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)耐逆水稻新品種成為當(dāng)代育種工作者的目標(biāo)，新水稻品種的培育關(guān)系著國家糧食安全、人民生活溫飽等一系列重大問題。

生產(chǎn)上，水稻單位面積上的每穗粒數(shù)、有效穗數(shù)、千粒重和結(jié)實(shí)率等因素決定了產(chǎn)量， 而水稻粒重又受谷粒粒形、大小及成熟度等因素影響，因此，粒形是決定水稻產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一。粒形及籽粒大小不僅直接影響水稻的產(chǎn)量，還與水稻的品質(zhì)有著密切的關(guān)系，因此作為水稻品種的標(biāo)志性特征之一，特定的粒形對(duì)培育篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻具有非常重要的意義。

水稻粒形主要由種子的長度、寬度、厚度及長/寬比等因素決定，是一個(gè)由多基因控制的復(fù)雜性狀。隨著水稻基因組計(jì)劃的完成，關(guān)于水稻粒形的研究取得了較大的進(jìn)展，目前已經(jīng)定位了400多個(gè)與粒形相關(guān)的QTLs，并已克隆了一批控制水稻粒形的基因，例如GS3、GW2、GW5、qSW5、GW8、GW2、GS5和HGW等等，這些基因分別影響水稻谷粒的粒長、粒寬與粒厚，并使谷粒粒形發(fā)生變化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供水稻OsRhoGAP2基因在改變水稻粒形中的應(yīng)用，即將含有OsRhoGAP2基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到水稻中，然后培育水稻獲得T2代過表達(dá)OsRhoGAP2基因的轉(zhuǎn)基因水稻。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的采用如下技術(shù)方案，水稻OsRhoGAP2基因在改變水稻粒形中的應(yīng)用，其特征在于該水稻OsRhoGAP2基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明所述的水稻OsRhoGAP2基因在改變水稻粒形中的應(yīng)用，其特征在于具體過程為：設(shè)計(jì)引物P1：5’-TATCTGCAGATGGAGGGCGAGGTGCC-3’，含有PstI酶切位點(diǎn)和引物P2：5’-GCGAAGCTTTACACAGGCTTGTCCCGC-3’，含有HindIII酶切位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增為OsRhoGAP2基因cDNA編碼區(qū)5’端和3’端分別添加PstI和HindIII酶切位點(diǎn)，連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1302的相應(yīng)位點(diǎn)，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得T2代過表達(dá)OsRhoGAP2基因的轉(zhuǎn)基因水稻。

本發(fā)明將水稻Rho蛋白調(diào)控因子編碼基因OsRhoGAP2構(gòu)建過表達(dá)植物載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得T2代過表達(dá)OsRhoGAP2基因的轉(zhuǎn)基因水稻，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因水稻的粒長增加5.26%-16.67%、粒寬減小2.7%-10.81%、粒厚減小1.36%-11.91%。

附圖說明

圖1為對(duì)照水稻和OsRhoGAP2基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻T2代不同株系水稻粒長的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，其中WT為對(duì)照水稻日本晴，OE-OsRhoGAP2為轉(zhuǎn)基因水稻；

圖2為對(duì)照水稻和OsRhoGAP2基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻T2代不同株系水稻粒寬的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，其中WT為對(duì)照水稻日本晴，OE-OsRhoGAP2為轉(zhuǎn)基因水稻；

圖3為對(duì)照水稻和OsRhoGAP2基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻T2代不同株系水稻粒厚的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，其中WT為對(duì)照水稻日本晴，OE-OsRhoGAP2為轉(zhuǎn)基因水稻；

圖4為OsRhoGAP2植物過表達(dá)載體的構(gòu)建，其中A為OsRhoGAP2的cDNA編碼區(qū)擴(kuò)增膠回收產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，B為pMD18-T-OsRhoGAP2載體HindIII和PstI雙酶切鑒定，圖C為pCAMBIA1302-OsRhoGAP2-eGFP表達(dá)載體HindIII和PstI雙酶切鑒定；

圖5為OsRhoGAP2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻T2代的PCR檢測，圖中M:DNA Maker（DL 2000），1、野生型檢測，2、陰性對(duì)照，3、陽性對(duì)照，4-13、過表達(dá)植株 T2代的PCR產(chǎn)物，通過PCR檢測可以篩選到陽性植株。條帶正確且亮的代表陽性植株。

圖6為OsRhoGAP2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻T2代的表達(dá)量檢測，通過表達(dá)量檢測可以檢測該基因在此植株中的表達(dá)水平，從圖中我們可以得出轉(zhuǎn)基因水稻中該基因的表達(dá)量都有了不同程度的提高，最少的有14倍，最多的有229倍。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

1、水稻OsRhoGAP2基因過表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物P1：（5’-TATCTGCAGATGGAGGGCGAGGTGCC-3’，含有PstI酶切位點(diǎn)）和引物P2：（5’-GCGAAGCTTTACACAGGCTTGTCCCGC-3’，含有HindIII酶切位點(diǎn)），通過PCR擴(kuò)增為OsRhoGAP2基因cDNA編碼區(qū)5’端和3’端分別添加PstI和HindIII酶切位點(diǎn)，連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1302（購自CAMBIA公司）的相應(yīng)位點(diǎn)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有卡那霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)酶切和PCR鑒定后，已經(jīng)測序確認(rèn)。

2、水稻的遺傳轉(zhuǎn)化、篩選和T2代轉(zhuǎn)OsRhoGAP2基因水稻性狀的分析

采用常規(guī)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，利用農(nóng)桿菌浸染法將OsRhoGAP2基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至水稻愈傷組織（將去穎殼的水稻種子點(diǎn)播在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6D2上。大約一周后，水稻種子能夠長出愈傷。除去芽和根后，將愈傷置于新的的N6D2培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)，大約10天能夠形成比較堅(jiān)硬的愈傷組織，可用于農(nóng)桿菌侵染），利用潮霉素篩選陽性愈傷組織，進(jìn)一步誘導(dǎo)培育再生陽性轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行分子鑒定。轉(zhuǎn)基因水稻篩選至T2代時(shí)，對(duì)同一批次收獲的成熟對(duì)照水稻和T2代轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行觀察，分別測量其谷粒的粒長、粒寬和粒厚（如圖2-3所示），進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)樣本各12株，每個(gè)株系重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照水稻的平均粒長為0.7364±0.0118，平均粒寬為0.3639±0.0061，平均粒厚為0.2267±0.0028；而轉(zhuǎn)基因水稻的平均粒長為0.8142±0.0188，平均粒寬為0.3470±0.0085，平均粒厚為0.2123±0.0057，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因水稻的粒長增加5.26%-16.67%、粒寬減小2.7%-10.81%、粒厚減小1.36%-11.91%。

以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南師范大學(xué)

<120> 水稻OsRhoGAP2基因在改變水稻粒形中的應(yīng)用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggagggcg aggtgccggt gtcatcgccg ctgatgctgc cggcggcgag gggaggagga 60

ggaggagggg tgtccgtcgt ggagacggtg gcggcggcgc tgcggaggtc gctgctgctg 120

tgcagcagcg tgcgcgccgc ggaggacgaa ggggccgcgg cggcggcggc ggctgctgcg 180

gggatgcaga ttggccggcc caccgacgtg cggcacgtct cgcacgtcac cttcgaccgc 240

ttcgtggggt tcctcggcct ccccgccgac ctcgagcccg acgtgccccg ccccgcgcct 300

agcgccagtg tgagtgtatt tggagtttca ccaacgtcca tgcaatgctc atacgataac 360

agaggaaaca gtgtgccaac aatactattg accatgcaaa agaagttata tcaacttggg 420

gggcttcagg ctgaaggaat cttcagaata aatgcagaca atagtcagga actacatgtc 480

agggagcaac taaacatggg tgttgttccg gatggtgttg acatgcactg tctgacgggc 540

ctcataaagg catggtttcg tgaacttcca agtggagtat tggactcatt gactccagaa 600

caagtgatgc actgcaacac tgaagaagaa tgcgctctcc ttgcgagtac tctacctcca 660

gtggaagcag cactacttga ttgggccatc aatctgatgg cagatgttgt ggaacatgaa 720

aactacaata agatgaacgc tcgcaacatt gctatggttt ttgcaccaaa catgactcag 780

atggccgatc ccttgactgc tttgatacat gcagttcaag tgatgaattt tctcaagaca 840

cttatcttga agactgtgaa gggacgggaa gaaacagcta tgccatcaag tgcattccca 900

tcaagctctg gttccccaag tgacaaagat gaacctcagg cattagagca tttggacaag 960

cccaccattt gttcaactca gcaaaataat gattttccaa tgattagtgg ggctactctt 1020

gatcacttcc tctttagagc agaaccattg cgtcataatg acgcacaagg tagtgctgga 1080

cgacccaaga aacgcgacaa taaggaccat gacaacagca gcagggaatt ttctcccata 1140

gatagtgatt caagtagcca agccagcaat tctgcaagca aattcagtaa tgacaatgtg 1200

gaaggtttat ttgacagatt taaatttcgg aaaggagtag ggaggctgtg cagacaccct 1260

gtttttcagt tgagtaggtc catgaaaaaa tcaggtgaag cgggacaagc ctgtgtatga 1300

SEQUENCE LISTING

<110> 河南師范大學(xué)

<120> 水稻OsRhoGAP2基因在改變水稻粒形中的應(yīng)用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggagggcg aggtgccggt gtcatcgccg ctgatgctgc cggcggcgag gggaggagga 60

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