在重組fviii的生產(chǎn)中提高真核細胞生產(chǎn)率的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種增加重組凝血因子VIII(rFVIII)的生產(chǎn)率的方法，所述生產(chǎn)率特別是細胞特異性生產(chǎn)率，所述重組凝血因子VIII是在真核細胞懸浮液在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)期間在所述真核細胞懸浮液中產(chǎn)生的，所述培養(yǎng)基含有不超過500μMCaCl2、至少一種非離子清潔劑以及細胞生長和rFVIII產(chǎn)生所需的其他營養(yǎng)成分，其特征在于，所述細胞懸浮液是在通過機械裝置誘導(dǎo)剪切應(yīng)力施加至真核細胞懸浮液的條件下培養(yǎng)的，該剪切應(yīng)力是通過添加至少3W/m3的功率密度而實現(xiàn)的。
【專利說明】在重組FVI I I的生產(chǎn)中提高真核細胞生產(chǎn)率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及在細胞培養(yǎng)期間提高重組人凝血因子VIII (rFVIII)的產(chǎn)率的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]本發(fā)明提供提高通過培養(yǎng)細胞(特別是哺乳動物細胞)進行的蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的產(chǎn)率的方法。具體而言，本發(fā)明涉及制備蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，例如糖蛋白產(chǎn)物，其中蛋白質(zhì)產(chǎn)物特性通過操作細胞培養(yǎng)環(huán)境以增加施加至細胞的應(yīng)力而被控制。
[0003]大部分生物技術(shù)產(chǎn)物，無論是可商購的或正在研發(fā)中的，都是蛋白治療劑。對于哺乳動物細胞培養(yǎng)物中的蛋白質(zhì)生產(chǎn)以及這種生產(chǎn)相關(guān)的改進的方法的需求很大并逐漸增加。特別是當以細胞表達水平生產(chǎn)大糖蛋白時，更需要這種改進的方法。一種這樣的蛋白質(zhì)，F(xiàn)VIII，其表達水平比在哺乳動物細胞中生產(chǎn)的其他重組蛋白質(zhì)低至少兩至三倍。大規(guī)模治療性蛋白質(zhì)生產(chǎn)的晚期研發(fā)中遇到的一個普遍的問題是由于較大的臨床試驗而導(dǎo)致需求量逐漸增加以及細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)設(shè)備中污染導(dǎo)致產(chǎn)能降低。為滿足增加的需求量，可通過幾種方式提高總生產(chǎn)水平。但是，大多數(shù)方式(例如找到更好的細胞克隆或改進培養(yǎng)介質(zhì))都非常耗時，因此通常并非是足夠快速的選擇。增加生產(chǎn)率的其他方式是增加生產(chǎn)規(guī)?；蛟谘a料分批模式或灌注模式培養(yǎng)中增加細胞密度。而且，這些過程變化伴隨大的投資成本，并且對于高密度培養(yǎng)的情況，培養(yǎng)槽中的氧限制通常給可用于生產(chǎn)的最大細胞密度設(shè)定了一個限值。因此，本領(lǐng)域中需要新的增加生產(chǎn)率的方法。
[0004]Keane J.T.等在 Effect of shear stress on expression of a recombinantproetine by Chinese hamster ovary cells; Biotechnology and Bioengineering,81:211-220, 2003中使附著CHO細胞經(jīng)受剪切力32 h并監(jiān)控重組人生長激素生產(chǎn)以及葡萄糖代謝。他們觀察到，當剪切力從0.005 N/m2 (0.02 W/m3)增加至0.80 N/m2 (6.4 x IO2W/m3)時，重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)速率降低51 %，葡萄糖吸收速率增加42 %，并且乳酸生產(chǎn)降低50%。
[0005]Godoy-Silva R 等在 Physiological responses of CHO cells to repetitivehydrodynamic stress; Biotechnology and Bioengineering, Vol.103, N0.6, August15，2009中檢驗了重復(fù)的水動力應(yīng)力對CHO細胞的影響，并得出結(jié)論:最高至6.4 x IO6 ff/m3的能量耗散率不會影響細胞生長、死亡和生產(chǎn)率。
[0006]J.A.Frangos 等在 Shear stress induced stimulation of mammalian cellmetabolism; Biotechnology and Bioengineering, Vol.32, Pp.1053-1060 (1988)中公開了一種流動儀，用于研究貼壁依賴性細胞在控制良好的情況下對各種穩(wěn)定的和脈沖式的剪切應(yīng)力的代謝響應(yīng)。數(shù)據(jù)證實，穩(wěn)定剪切應(yīng)力的生理水平以及剪切力的開始急劇刺激培養(yǎng)的人內(nèi)皮細胞中的前列腺環(huán)素的產(chǎn)生。
[0007]Giard和他的同事們觀察到，當維持在旋轉(zhuǎn)燒瓶中的微載體上時，與在滾瓶中的細胞相比，人成纖維細胞分泌的干擾素的量增加最多30倍(D.J.Giard, D.H.Loeb, ff.G.Thilly, D.1.C.Wang, and D.ff.Levine, Biotechnol.Bioeng., 21, 433(1979))。因為旋轉(zhuǎn)燒瓶中細胞被施加的剪切應(yīng)力比滾瓶中的細胞大得多，產(chǎn)量的增加可歸因于干擾素合成的剪切誘導(dǎo)刺激。
[0008]Timm Tanzeglock 等，Induction of mammalian cell death by simple shearand extensional flows; Biotechnology and Bioengineering, Vol.104， N0.2，October I, 2009公開了細胞所經(jīng)受的剪切流類型是否會影響細胞死亡的啟動。實際上，哺乳動物細胞區(qū)分離散類型的流并做出不同響應(yīng)。該文獻中使用了兩種流裝置，以施加精確的流體動力學流場:均一且穩(wěn)定的簡單剪切流和振動拉伸流(oscillating extensionalflow)。為區(qū)分壞死性細胞死亡和凋亡性細胞死亡，使用了熒光激活細胞分選和培養(yǎng)物上清液DNA釋放。結(jié)果顯示，在振動拉伸流中，當受到低水平流體動力學應(yīng)力(約2Pa)時，中國倉鼠卵巢細胞和人胚腎細胞將進入凋亡路徑。相反，當細胞在簡單剪切流中，受到流體動力學應(yīng)力為約IPa時，或在拉伸流中，應(yīng)力約500Pa時，主要是壞死性死亡。當培養(yǎng)細胞用于重組蛋白生產(chǎn)時，細胞進入各死亡路徑的這些閾值應(yīng)當避免，以增強培養(yǎng)時間和生產(chǎn)率。
[0009]WO 2006/103258A1公開了一種增加蛋白質(zhì)產(chǎn)率的方法，包括培養(yǎng)真核細胞和在收集蛋白質(zhì)之前將離子物質(zhì)添加至培養(yǎng)基。合適的離子物質(zhì)是霍夫邁斯特序的鹽以及氨基酸。
[0010]WO 2008/006494A1公開了一種在反應(yīng)器的細胞培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)細胞的方法，所述細胞優(yōu)選是El-永生HER細胞，更優(yōu)選是PER.C6細胞，其中細胞產(chǎn)生生物學物質(zhì)，優(yōu)選是抗體，其中至少一種細胞培養(yǎng)基成分被添加至細胞培養(yǎng)物，并且其中包含細胞、生物學物質(zhì)和細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物經(jīng)分離系統(tǒng)被循環(huán)，其中分離系統(tǒng)將生物學物質(zhì)與具有比生物學物質(zhì)分子量低的物質(zhì)分離，其中生物學物質(zhì)被保留在或輸送回至反應(yīng)器。優(yōu)選地，一部分所述較低分子量的物質(zhì)被連續(xù)地從細胞培養(yǎng)物中移除。
[0011]Zhang, Hu 等在 Current Pharmaceutical Biotechnology, Volume 11, Number1，January 2010，pp.103-112(10)中報道稱，哺乳動物細胞培養(yǎng)在最近十幾年在生產(chǎn)蛋白質(zhì)治療劑方面起到重要作用。哺乳動物細胞培養(yǎng)的工藝開發(fā)中考慮了許多工程學參數(shù)以實現(xiàn)工藝優(yōu)化，但該文章中僅特別研究了剪切和混合。該文章認為，之前高估了由攪拌引起的剪切應(yīng)力對細胞損傷的作用，但剪切可導(dǎo)致非致死性的生理反應(yīng)。在氣泡形成、破裂并聚集的區(qū)域，沒有出現(xiàn)細胞損傷，但剪切應(yīng)力在氣泡升起之后變得顯著，并且在泡沫破裂區(qū)域?qū)毎斐珊艽髶p傷?；旌喜蛔阋栽诖笠?guī)模生物反應(yīng)器中提供均質(zhì)溶解的氧張力、pH、C02和營養(yǎng)物質(zhì)，這會為細胞生長、產(chǎn)物形成和工藝控制帶來嚴重的問題?？s減反應(yīng)器(scale-down reactors)已被開發(fā)出來以解決并行操作的混合問題和剪切問題。常規(guī)的和最近開發(fā)的縮減生物反應(yīng)器的工程特征已作簡要介紹。文中還展望了以高細胞密度進行工業(yè)細胞系培養(yǎng)的工藝困難以及用于再生醫(yī)療、組織工程和基因治療的干細胞培養(yǎng)和其他人細胞培養(yǎng)的工藝困難。重要的技術(shù)正在開發(fā)以解決這些困難，例如單細胞分析的微米級操作和納米級操作(光鑷子)，用于剪切和混合特征化的計算機流體動力學(CFD)以及微型生物反應(yīng)器。
[0012]Timothy A.Barrett 等在Biotechnology and Bioengineering, Vol.105, N0.2，pages 260-275報道了有關(guān)震蕩微板式的實驗，為細胞培養(yǎng)條件的快速評價和優(yōu)化提供了潛在的平臺技術(shù)。該文章描述了微孔系統(tǒng)中液體混合和氣液傳質(zhì)的詳細工程特性以及它們對懸浮細胞培養(yǎng)的影響。[0013]如果細胞生長和抗體生產(chǎn)動力學與目前使用的搖瓶系統(tǒng)中的相當，那么該微孔方 法為更加便宜地且以降低的材料要求獲得早期工藝設(shè)計數(shù)據(jù)提供了可能性。該工作描述了 微孔系統(tǒng)中液體混合和氣液傳質(zhì)的詳細工程特性以及它們對懸浮細胞培養(yǎng)的影響。對于生 產(chǎn)IgGl的小鼠雜交瘤細胞的生長，查明了 24孔平板在能量耗散（P/V)(通過計算機流體動 力學，CFD)、流體流動、混合以及氧傳輸速率方面與震蕩頻率和液體填充提及的關(guān)系。預(yù)測 的值為1. 3至291T1 ;液相混合時間（經(jīng)碘退色實驗定量）為1. 7 s至3. 5 h ;而預(yù)測的 P/V為5至35 ff m_3。CFD模擬剪切速率預(yù)測的流體動力學力不會對細胞有害。但對于雜 交瘤培養(yǎng)物，高震蕩速度（>250 rpm)對細胞生長有負面影響，而低震蕩速度與高孔填充體 積的結(jié)合（120 rpm; 2，000ML)導(dǎo)致出現(xiàn)氧有限情況。基于這些發(fā)現(xiàn)，在匹配的平均能量耗 散率下，進行微孔和搖瓶形式中細胞培養(yǎng)動力學的第一工程學比較。細胞生長動力學和抗 體滴度在24孔微量滴定板和250 mL搖瓶中類似。整體上，該工作證實了在震蕩微孔板中 進行的細胞培養(yǎng)能夠提供可在目前使用的搖瓶系統(tǒng)中重復(fù)并且與其相當?shù)臄?shù)據(jù)，同時操作 規(guī)模和材料要求降低了至少30倍。結(jié)合自動化，該方案為實現(xiàn)在實際的懸浮培養(yǎng)條件下穩(wěn) 健的細胞系的高通量評價提供了途徑。
[0014]William G. Whitford和 John S. Cadwell 在 BioProcess International 2009, Vol. 7，No. 9，pages 54_64報道了人們對中空纖維灌注生物反應(yīng)器的興趣漸增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的目的在于提供一種增加重組凝血因子VIII (rFVIII)的生產(chǎn)率的方法， 特別是其細胞特異性生產(chǎn)率，所述重組凝血因子VIII特別是在真核細胞懸浮液在培養(yǎng)基 中的培養(yǎng)期間在所述真核細胞懸浮液中產(chǎn)生的人rFVIII，所述培養(yǎng)基含有不超過500 m CaCl2、至少一種非離子清潔劑以及細胞生長和rFVIII產(chǎn)生所需的其他營養(yǎng)成分，其特征在 于，所述細胞懸浮液是在通過機械裝置誘導(dǎo)剪切應(yīng)力施加至真核細胞懸浮液的條件下培養(yǎng) 的。該剪切應(yīng)力通過向細胞懸浮液中添加高于3 W/m3的功率密度輸入而實現(xiàn)的。誘導(dǎo)剪 切應(yīng)力的條件是包括誘導(dǎo)細胞懸浮液的機械運動或誘導(dǎo)懸浮液中細胞的機械運動在內(nèi)的 事件。通常，剪切應(yīng)力被直接施加至培養(yǎng)的細胞。機械裝置特別是那些能夠攪拌細胞培養(yǎng) 懸浮液的裝置。
[0016]雖然本發(fā)明的效果已通過HEK293研究，這些細胞是典型的人細胞，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以預(yù)期到，HEK293細胞所獲得的結(jié)果也可由其他人細胞系的細胞獲得。
[0017]機械裝置所引入的功率輸入（功率密度，能量耗散率的等效術(shù)語，e)是根據(jù)下 式計算出來的：e =Np ? n3 ? di5)/V,其中Np是葉輪的紊流功率數(shù)（turbulent power number), n是攪拌速率（葉輪轉(zhuǎn)數(shù)/秒），di是葉輪直徑（米），V是培養(yǎng)基體積（立方米)。 添加至細胞懸浮液以引入剪切應(yīng)力的功率不應(yīng)超過細胞被破壞時的值，通常不應(yīng)超過2000 W/m3的最大值。特別地，添加至細胞懸浮液以引入剪切應(yīng)力的功率密度為3W/m3至2000 W/m3，優(yōu)選為15 W/m3至1500 W/m3，更優(yōu)選為30 W/m3至1250 W/m3，更優(yōu)選為50 W/m3至 1000 W/m3。
[0018]在本發(fā)明的一個實施方式中，該功率是通過細胞懸浮液的機械運動被引入的。在 本發(fā)明的另一個實施方式中，細胞懸浮液的機械運動是通過將細胞懸浮液泵送通過切向過 濾膜（例如中空纖維膜）而進行的，或者細胞懸浮液的機械運動是通過轉(zhuǎn)動元件（例如攪拌器、螺旋槳或葉輪)來進行的。
[0019]特別地，rFVIII是B結(jié)構(gòu)域缺失的rFVIII，特別是人B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII。
[0020]在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述真核細胞是HEK293細胞。rFVIII分子特別是在HEK293細胞的表面產(chǎn)生并累積。為分離rFVIII，使用將rFVIII從細胞表面分離的條件將是有利的，例如通過增加細胞周圍介質(zhì)的離子強度或弱化rFVIII與HEK293細胞表面的吸引力的其他手段。
[0021]在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述非離子清潔劑選自Pluronic_F68、Tween 20和Tween 80。通常，非離子清潔劑的濃度為0.0000lwt%至lwt%,特別是0.0001wt%至
0.lwt%，最合適地為 0.001wt% 至 0.01wt%o
[0022]在本發(fā)明的方法的另一個實施方式中，培養(yǎng)基中的低CaCl2濃度被調(diào)節(jié)，以用于控制細胞聚集，例如使細胞聚集最小化。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，功率可通過細胞懸浮液的機械運動而被引入至細胞培養(yǎng)中。細胞懸浮液的機械運動可通過例如攪拌器或機械類似物(如震蕩裝置)來進行。
[0024]在本發(fā)明的一個特別的實施方式中，由于例如細胞懸浮液的機械起始運動導(dǎo)致的功率密度輸入是通過裝配有葉輪的培養(yǎng)容器啟動的，或者是通過例如無葉輪或類似裝置的一次性wave?培養(yǎng)袋的培養(yǎng)容器啟動的，取而代之的是以地球引力移動培養(yǎng)袋(具有例如搖擺機)，從而誘導(dǎo)所述細胞懸浮容器中的剪切應(yīng)力，或者細胞懸浮容器中的剪切應(yīng)力通過將細胞懸浮液泵送通過靜態(tài)混合物或過濾裝置來誘導(dǎo)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是活細胞密度曲線。
[0026]圖2是累積的FVIII = C曲線。
[0027]圖3是細胞特異性增長速率。
[0028]圖4是不同攪拌速率下連續(xù)培養(yǎng)操作中細胞特異性生產(chǎn)率。
[0029]圖5是連續(xù)培養(yǎng)中連續(xù)離心與ATF中空纖維裝置相比較的細胞特異性生產(chǎn)率。
【具體實施方式】[0030]在本發(fā)明的方法中，與常規(guī)方法相比，通過引入較高功率獲得的較高機械能被施加至含有真核細胞懸浮液的培養(yǎng)容器中，該真核細胞培養(yǎng)液產(chǎn)生rFVIII。功率的量可依據(jù)能力耗散來確定，但其他參數(shù)也可與功率輸入相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明是基于當細胞在搖瓶或攪拌罐生物反應(yīng)器中以高攪拌速率被攪拌時得到異常高的FVIII生產(chǎn)率而完成的。
[0031]根據(jù)本發(fā)明，可使用任何真核細胞或細胞系，特別地，該真核細胞是HE K29 3細胞。如例如W0-A-2001/070968和WO-A -2007/003582所公開的，該基因改造的細胞生產(chǎn)rFVIII，特別是B結(jié)構(gòu)域缺失的rFVIII。
[0032]在HEK293細胞中制造rRVIII分子是本發(fā)明的方法的一個特別的實施方式，并將下文的實施例中進一步解釋。
[0033]在本發(fā)明的方法中，已顯示出，HEK293細胞中產(chǎn)生的rFVIII分子與細胞相連并在產(chǎn)生在細胞內(nèi)部后附著至細胞表面，這在以下文獻中作了進一步描述:W0-A-2006/103258，Kohlind 2010 (Kohlind et.al., The B-domain of Factor VIII reduces cell membraneattachment to host cells under serum free conditions.Journal of Biotechnology,147 (2010)，198-204.)和 Kohlind 2011 (Kohlind et.al.，Optimisation of theFactor VIII yield in mammalian cell cultures by reducing the membrane boundfraction.Journal of Biotechnology, 151 (2011)， 357-362.)。
[0034]在本發(fā)明的方法中，用于細胞生長和rFVIII生產(chǎn)的培養(yǎng)基含有非離子清潔劑。通常，單月桂酸山梨醇酐酯的聚氧乙烯衍生物，例如Tween'它是一個包含許多產(chǎn)品的家族，通過聚氧乙烯鏈長和脂肪酸酯部分區(qū)分。另一種有用的非離子清潔劑是Poloxamer，它們是非離子三嵌段共聚物，由聚氧丙烯(聚(環(huán)氧丙烷))的中央疏水鏈以及兩側(cè)的聚氧乙烯(聚(環(huán)氧乙燒))的兩個親水鏈構(gòu)成。Poloxamer也被稱為商品名Pluronics?。非離子清潔劑可選自 Pluronic_F68、Tween 20 和 Tween 80,特別地，濃度為 0.0000lwt% 至 lwt%,或
0.0001wt% 至 0.lwt%,或 0.001wt% 至 0.01wt%。
[0035]以下更詳細地描述本發(fā)明的方法。在125 mL的帶擋板的E-瓶(E-bottle)中，以不同震蕩頻率培養(yǎng)細胞。雖然細胞生長曲線與在低速攪拌和高速攪拌培養(yǎng)中類似(圖1)，但在3天的分批培養(yǎng)后，高速攪拌培養(yǎng)物中的累積生產(chǎn)率驚人地高出83%(圖2)。
[0036]本發(fā)明的另一個實施方式以分批模式培養(yǎng)在平行的受控攪拌槽生物反應(yīng)器中進行。經(jīng)受較高機械應(yīng)力的培養(yǎng)物相比于低速攪拌培養(yǎng)物而言顯示出較高的生產(chǎn)率。這顯示出，雖然其他培養(yǎng)參數(shù)(例如PH、D0T (溶解氧張力)和溫度)保持恒定，但較高速的攪拌導(dǎo)致生產(chǎn)率增加。
[0037]在另一個實施方式中，在一個2L的攪拌槽生物反應(yīng)器中，以灌注模式培養(yǎng)實驗性地檢驗本發(fā)明。該培養(yǎng)以穩(wěn)定狀態(tài)灌注模式運行，指數(shù)生長的細胞被保持在期望的細胞密度，這通過將細胞從反應(yīng)器 中排出而實現(xiàn)，排出的速率使得保持反應(yīng)器中的細胞密度恒定。雖然其他培養(yǎng)參數(shù)保持恒定，但較高攪拌速率增加了細胞特異性生產(chǎn)率。
[0038]在另一個實施方式中，在一個100L的生產(chǎn)規(guī)模生物反應(yīng)器中實驗性地檢驗本發(fā)明，該反應(yīng)器以灌注模式運行以實現(xiàn)較高的細胞密度。該實驗證實，通過增加剪切力以及有增加的攪拌引起的能量輸入，在大規(guī)模培養(yǎng)中也可實現(xiàn)生產(chǎn)率增加。
[0039]在另一個實施方式中，在一個2L的攪拌槽生物反應(yīng)器中實驗性地檢驗本發(fā)明，該生物反應(yīng)器以灌注模式運行，并且具有連續(xù)離心單元或以交替式切向流(ATF)運行的中空纖維單元。令人驚訝的是，通過ATF單元添加至培養(yǎng)物的增加的剪切也使得FVIII產(chǎn)率增加。
實施例
[0040]實施例1
將生產(chǎn)BDDrFVIII的指數(shù)生長的HEK293F細胞離心，其后將細胞團塊重懸于無血清細胞培養(yǎng)基中至活細胞密度為0.5xl06個細胞/mL。其后，將細胞在125 mL的帶擋板的錐形瓶中培養(yǎng)，錐形瓶置于震蕩培養(yǎng)箱中，100 rpm或200 rpm, 5%/95% CO2/空氣覆蓋，37°C。通過臺盼藍排除法和Cedex (Innovatis)自動細胞計數(shù)器每天測定所有培養(yǎng)物中的細胞密度。通過將細胞懸液中的離子濃度增至I M NaCl + 30 mM CaCl2而將累積的FVIII從細胞釋放。離心去除細胞，發(fā)色底物法(Coatest? SP FVIII)測定FVIII。生長曲線類似(圖1)，但高速攪拌培養(yǎng)物在3天的分配培養(yǎng)后顯示出高出83%的累積FVII1:C濃度(圖2)。[0041]實施例2
在具有6個0.4L的生物反應(yīng)器的設(shè)備(Multifors, Infors)中，在不同攪拌速率下，以分批模式并行培養(yǎng)產(chǎn)生BDDrFVIII的HEK293細胞。目的在于檢驗攪拌速率如何在其他細胞培養(yǎng)參數(shù)保持恒定的受控環(huán)境下影響生產(chǎn)率。為了能夠檢驗高攪拌速率(>300 rpm),生物反應(yīng)器的攪拌電機(通常用于細胞培養(yǎng)應(yīng)用)被換成更強力的攪拌電機(通常用于細菌培養(yǎng)應(yīng)用，可運行至1200 rpm)。溶解氧張力(DOT)設(shè)定點被設(shè)置成90%，并且通過細胞懸浮液中的鼓泡石(sparger stone)添加空氣來調(diào)節(jié)。使用Cedex (Innovatis)細胞計數(shù)器測定活細胞密度、存活率和聚集速率。通過將細胞懸浮液中的離子強度增至I M NaCl +30 mM CaCl2來從細胞釋放累積的FVIII。離心去除細胞，發(fā)色底物法(Coatest? SP FVIII)測定FVIII。表1中顯示了所檢驗的攪拌速率、能量耗散率(本文所述功率密度的等效術(shù)語)(ε )和細胞特異性生產(chǎn)率(gp)。200至950 rpm的增加的攪拌速率增加了細胞特異性生產(chǎn)率。1200 rpm處Cip相比于950rpm處降低,顯示高于950rpm導(dǎo)致生產(chǎn)率下降。
【權(quán)利要求】
1.一種增加重組凝血因子VIII(rFVIII)的生產(chǎn)率的方法，所述生產(chǎn)率特別是細胞特異性生產(chǎn)率，所述重組凝血因子VIII是在真核細胞懸浮液在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)期間在所述真核細胞懸浮液中產(chǎn)生的，所述培養(yǎng)基含有不超過500 μΜ CaCl2、至少一種非離子清潔劑以及細胞生長和rFVIII產(chǎn)生所需的其他營養(yǎng)成分，其特征在于，所述細胞懸浮液是在通過機械裝置誘導(dǎo)剪切應(yīng)力施加至真核細胞懸浮液的條件下培養(yǎng)的，該剪切應(yīng)力是通過添加至少3 W/m3的功率密度而實現(xiàn)的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述功率密度通過所述細胞懸浮液的機械運動被引入至細胞培養(yǎng)基內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中細胞懸浮液的機械運動是通過將細胞懸浮液泵送通過切向過濾膜，特別是中空纖維膜，而進行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中細胞懸浮液的機械運動是通過轉(zhuǎn)動元件而進行的，所述轉(zhuǎn)動元件例如是攪拌器、螺旋槳或葉輪。
5.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中rFVIII是B結(jié)構(gòu)域缺失的rFVIII。
6.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述真核細胞是HEK293細胞。
7.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中rFVIII分子是在HEK293細胞中產(chǎn)生的并且與HEK293細胞相連。
8.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述非離子清潔劑選自PluroniC-F68、Tween 20 和 Tween 80。
9.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述非離子清潔劑的濃度為0.0000 lwt% 至 lwt%,特別是 0.0001wt% 至 0.lwt%,最合適地是 0.001wt% 至 0.01wt%。`
10.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中通過將培養(yǎng)基中的低CaCl2濃度并通過增加剪切而增加CaCl2從培養(yǎng)物環(huán)境中的運出，從而將細胞聚集降至最低。
11.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中細胞懸浮液的機械運動是通過配備葉輪的培養(yǎng)容器來啟動的，或者是通過由于地球重力而移動而誘導(dǎo)在所述細胞懸浮液中的剪切應(yīng)力的培養(yǎng)容器來啟動，或細胞懸浮液容器中的剪切應(yīng)力是通過將細胞懸浮液泵送通過靜態(tài)混合物或過濾裝置而誘導(dǎo)的。
12.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中添加至細胞懸浮液以引入剪切應(yīng)力的功率密度最大為2000 W/m3。
13.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中添加至細胞懸浮液以引入剪切應(yīng)力的功率密度為3W/m3至2000 W/m3。
【文檔編號】C07K14/755GK103517919SQ201280021390
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月13日
【發(fā)明者】皮特·埃扎娃, 伊瑞麗·埃基科維斯特 申請人:歐克塔醫(yī)藥公司