本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及SUMO和SUMO蛋白酶基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常被用來表達(dá)重組蛋白，但也存在一些缺陷，當(dāng)過表達(dá)一些外源蛋白時(shí)常會(huì)形成不溶性無功能的包涵體沉淀[Villaverde A,Carrio M,M.2003.Protein aggregation in recombinant bacteria:biological role of inclusion bodies.Biotechnol letters.25(17):1385-1395]，融合標(biāo)簽表達(dá)已被證明可以用來改善外源重組蛋白的產(chǎn)量和折疊[Esposito D,Chatterjee D,K.2006.Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags.Curr.Opin.in Biotechnol.17(4):353-358]。傳統(tǒng)的融合標(biāo)簽有麥芽糖結(jié)合蛋白MBP，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GST，硫氧還蛋白Trx等，這些標(biāo)簽融合體系要求在標(biāo)簽和目的蛋白間加上一段可被某些蛋白酶識(shí)別的酶切序列，以便后來研究中除去標(biāo)簽。常用的蛋白酶有煙草蝕斑病毒蛋白酶TEVp，凝血酶，Xa因子等，這些蛋白酶酶切后會(huì)在酶切位點(diǎn)下游也就是目的蛋白N端留下若干氨基酸，殘留的氨基酸可能會(huì)影響目的蛋白的生物學(xué)活性或者結(jié)晶，對(duì)于藥用蛋白可能會(huì)產(chǎn)生新的免疫原活性[Terpe K.2003.Overview of tag protein fusions:from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.Appl microbiol and biotechnol.60(5):523-533]。

小泛素相關(guān)修飾蛋白SUMO與傳統(tǒng)的標(biāo)簽蛋白不同，SUMO來源于真核生物，在大腸桿菌中并不存在，也沒有對(duì)應(yīng)的SUMO蛋白酶[Jeffrey G,M et al.2005.Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems:Enhanced expression and solubility with SUMO.Protein Science.15:182–189.]。在酵母中只含有一種SUMO基因(SMT3)，并存在嚴(yán)格空間構(gòu)象專一性的SUMO蛋白酶Ulp1，因?yàn)槭菢?gòu)象專一性蛋白酶，所以在SUMO標(biāo)簽C端可直接融合目的蛋白而無需添加酶切序列，酶切后目的蛋白N端不會(huì)有殘留氨基酸[Kawabe,Y.,2000.Covalent modification of the Werner’s syndrome gene product with the ubiquitin-related protein,SUMO-1.J.Biol.Chem.275:20963–20966.]。鑒于 SUMO標(biāo)簽優(yōu)良的改善折疊和促進(jìn)表達(dá)特性，加之Ulp1酶切特異性和活力均很高，所以近年來SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)越來越受到人們的重視。

酵母含有兩種SUMO蛋白酶：Ulp1和Ulp2，兩種酶共有一段約200氨基酸的催化結(jié)構(gòu)域稱為ULP即Ulp1(403～621)p，ULP顯示了完整的蛋白酶活性[Mossessova,E.and Lima,C.D.2000.Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.Mol.Cell.5:865–876.]。重組表達(dá)的SUMO蛋白酶就是Ulp1的C端結(jié)構(gòu)域。

但因?yàn)榇竽c桿菌的密碼子偏愛性，導(dǎo)致來源于酵母的SUMO和ULP在大腸桿菌中表達(dá)量比較低。已有研究表明提高宿主某些稀有tRNA豐度可以提高某些目的蛋白的表達(dá)量[Kane,J.F.1995.Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.Curr.Opin.in Biotechnol.6,494–500]，也有公司提供編碼某些稀有tRNA基因的商品化大腸桿菌菌株。然而提高宿主菌的稀有tRNA豐度并非提高目的蛋白表達(dá)量的有效途徑，首先，tRNA存在表達(dá)后修飾，有研究表明過表達(dá)某些稀有tRNA會(huì)出現(xiàn)僅部分tRNA發(fā)生修飾，導(dǎo)致翻譯保真性的降低[Wilson,R.K.and Roe,B.A.1989.Presence of the hyper modified nucleotide N6-(delta 2-isopentenyl)-2-methyl thioadenosine prevents codon misreading by Escherichia coli phenylalanyl-transfer RNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86,409–413]。其次，有研究表明稀有tRNA的過表達(dá)會(huì)加重宿主菌的代謝負(fù)擔(dān)，菌株生長(zhǎng)緩慢[Wahab,S.Z.et al.1993.Effects of tRNA(1Leu)overproduction in Escherichia coli.Mol.Microbiol.7,253–263]。

一般來說，基因中含有宿主很少使用的密碼子越多，目的蛋白的表達(dá)量越低，而在基因5’端存在稀有密碼子，則情況尤甚[Gustafsson C,et al.2004.Codon bias and heterologous protein expression.TRENDS in Biotechnology.22,(7):346-353]。為了解決這種情況，早在八十年代就有科學(xué)家通過人工合成基因的方式更改外源基因的稀有密碼子，實(shí)現(xiàn)蛋白的高水平表達(dá)[Nambiar,K.P.et al.1984.Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein.Science.223,1299–1301]，但鑒于合成基因的費(fèi)用較高，此方法主要用于較短的基因，九十年代開始更多使用定點(diǎn)突變的方法進(jìn)行密碼子的優(yōu)化[Kink J.A.et al.1991.Efficient expression of the Paramecium calmodulin gene in Escherichia coli after four TAA-to-CAA changes through a series of polymerase chain reactions.J.Protozool.38,441–447]，在已報(bào)道的密碼子優(yōu)化案例中與野生型相 比，優(yōu)化的基因絕大多數(shù)都實(shí)現(xiàn)了蛋白表達(dá)量的顯著提升[Gustafsson C,et al.2004.Codon bias and heterologous protein expression.TRENDS in Biotechnology.22,(7):346–353]。

目前，缺乏一種在大腸桿菌中的表達(dá)量高的SUMO和SUMO蛋白酶基因及其編碼蛋白的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種在大腸桿菌中表達(dá)量高的SUMO與SUMO蛋白酶編碼基因及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明的一種釀酒酵母基因sumo(S)，其由序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列定義。

本發(fā)明的一種釀酒酵母基因sumo(S)的編碼蛋白，其由序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列定義。

本發(fā)明的一種SUMO蛋白酶基因ulp(S)，其由序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列定義。

本發(fā)明的一種SUMO蛋白酶基因ulp(S)的編碼蛋白，其由序列表SEQ ID No.4的氨基酸序列定義。

本發(fā)明的所述的釀酒酵母基因sumo(S)的表達(dá)載體，權(quán)利要求3所述的SUMO蛋白酶基因ulp(S)的重組載體。

本發(fā)明的一種pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)分別人工合成序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的基因；

(2)分別構(gòu)建pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體；

(3)用步驟(2)所述重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化宿主菌構(gòu)建對(duì)應(yīng)的基因工程菌；

(4)利用步驟(3)所述基因工程菌分別表達(dá)pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體；

(5)利用純化技術(shù)，分別獲取pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，所述釀酒酵母基因sumo(S)的表達(dá)載體為pET28b，所述SUMO蛋白酶基因ulp(S)的表達(dá)載體為pMF載體，宿主菌為大腸桿菌DH5α；

在步驟(2)中，采用DNA重組技術(shù)，將序列表SEQ ID NO：1所示的sumo(S)基因插入pET28b的Nde Ⅰ和BamH Ⅰ酶切，將序列表SEQ ID NO：3所示的ulp(S)基因和pMF載體用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切，切膠回收后將對(duì)應(yīng)的基因和載體用T₄DNA連接酶16℃連接5h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，孵育復(fù)性后涂布抗性平板37℃培養(yǎng)12h后挑取單菌落，在5mL Luria-Bertani培養(yǎng)基中37℃，220rpm搖菌培養(yǎng)12h后提質(zhì)粒，分別獲得pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體；

在步驟(4)中，ulp(S)和sumo(S)基因誘導(dǎo)表達(dá)的條件，28℃誘導(dǎo)12h，誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)終濃度為0.5mmol/L。

本發(fā)明的一種含六種融合標(biāo)簽的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重組載體的制備方法，包括如下步驟：

將dnaK、mbp、gst、tig、groEL、trx六種標(biāo)簽蛋白和pET28b-tevS用Nde Ⅰ，Bgl Ⅱ酶切后連接轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證正確后，再將這六種標(biāo)簽載體和ulp(S)用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切后連接，轉(zhuǎn)化、酶切驗(yàn)證成功后將六種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在平板中挑取單菌落，在5mL Luria-Bertani培養(yǎng)基中37℃，220rpm搖菌培養(yǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)到OD₆₀₀至0.6時(shí)加終濃度為0.5mmol/L的IPTG 28℃誘導(dǎo)12h，然后收集菌體超聲破碎，冷凍離心后將上清蛋白樣品，制得含六種融合標(biāo)簽的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重組載體。

本發(fā)明的所述的釀酒酵母基因sumo(S)、所述的SUMO蛋白酶基因ulp(S)、所述的pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體和所述的含六種融合標(biāo)簽的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重組載體在酶工程中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)釀酒酵母sumo基因和SUMO蛋白酶ulp基因在大腸桿菌中的高表達(dá)，具體的說是實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌常用的表達(dá)菌株BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，并保證功能不受影響。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)改善來源于釀酒酵母的sumo和ulp基因在大腸桿菌中表達(dá)量低的缺陷，實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的高表達(dá)，從而拓廣SUMO融合標(biāo)簽系統(tǒng)在蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用。本發(fā)明利用大腸桿菌密碼子偏愛性人工合成的釀酒酵母小泛素相關(guān)修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier)sumo基因(sumo(S))和SUMO蛋白酶ulp基因(ulp(S))的全序列，通過篩選表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了兩種基因在大腸桿菌中的高表達(dá)，利用構(gòu)建的融合蛋白底物進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)證明合成的ulp基因不影響其功能。

(2)本發(fā)明的合成基因sumo(S)和ulp(S)通過篩選發(fā)現(xiàn)，分別構(gòu)建在pET28b和pMF載體中(N端均含His6標(biāo)簽)，在BL21(DE3)菌株中可以實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá)，表達(dá)量較野生型相比有很大 提升。用密碼子偏愛性，在大腸桿菌同義突變庫(kù)篩選替換了sumo和ulp基因中的稀有密碼子，人工合成了兩段基因sumo(S)和ulp(S)。

(3)本發(fā)明同時(shí)構(gòu)建了含六種融合標(biāo)簽(DnaK、MBP、GST、Tig、GroEL、Trx)的ulp(S)重組載體，在BL21(DE3)中表達(dá)均良好。對(duì)含六種融合標(biāo)簽和只含His6標(biāo)簽的ULP(S)測(cè)定酶活顯示，融合標(biāo)簽不能再進(jìn)一步提高ULP(S)的酶活力。定量檢測(cè)ULP(S)酶活性的eDAL底物融合系統(tǒng)為本實(shí)驗(yàn)室早前發(fā)明[Zhou C.et al.2014.A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases.Microbial Cell Factories.13(1):44.]。

(4)本發(fā)明將酶與底物在大腸桿菌胞內(nèi)進(jìn)行共表達(dá)，通過設(shè)置野生型對(duì)照，證明野生型與合成的ULP均可以有效切除野生型SUMO標(biāo)簽，但均不能有效切除合成的SUMO標(biāo)簽。對(duì)H6-ULP(S)進(jìn)行大量蛋白純化，1L Luria-Bertani培養(yǎng)基經(jīng)Ni柱親和層析得到的目的蛋白超濾后得到約62mg H6-ULP(S)蛋白酶。

附圖說明

圖1中A圖為H6-SUMO(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表達(dá)及H6-SUMO(S)在BL21(DE3)表達(dá)的蛋白電泳圖譜，B圖為H6-SUMO(WT)和H6-SUMO(S)His抗體印跡圖譜，C圖為H6-SUMO(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表達(dá)及H6-SUMO(S)在BL21(DE3)表達(dá)時(shí)ELISA測(cè)定的細(xì)胞破碎液中含His6標(biāo)簽的蛋白濃度；

圖2中A圖為H6-ULP(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表達(dá)及H6-ULP(S)在BL21(DE3)表達(dá)的蛋白電泳圖譜，B圖為H6-ULP(WT)和H6-ULP(S)His抗體印跡圖譜，C圖為H6-ULP(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表達(dá)及H6-ULP(S)在BL21(DE3)表達(dá)時(shí)ELISA測(cè)定的細(xì)胞破碎液中含His6標(biāo)簽的蛋白濃度；

圖3為含六種融合標(biāo)簽的ULP(S)表達(dá)的蛋白電泳圖譜；

圖4為含六種融合標(biāo)簽的ULP(S)和只含His6標(biāo)簽的ULP(S)的酶切電泳圖譜和酶活測(cè)定的柱狀圖；其中左圖是以SUMO(WT)-eDAL為底物，按1:100等蛋白量比例添加融合蛋白酶的酶切電泳圖譜，右圖為對(duì)應(yīng)的DAL酶活測(cè)定柱狀圖；

圖5為H6-ULP(WT)和H6-ULP(S)與底物SUMO(WT)-eDAL和SUMO(S)-eDAL在大腸桿菌BL21(DE3)胞內(nèi)共表達(dá)的電泳圖譜；

圖6為H6-ULP(S)蛋白純化圖譜；泳道1為H6-ULP(S)在BL21(DE3)的表達(dá)電泳條帶，泳 道2為Ni柱純化后Elution Buffer洗脫下流出樣的電泳條帶。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。

本發(fā)明基因合成由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物合成及測(cè)序由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司完成，限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axegen公司，F(xiàn)astPfu高保真DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker、蛋白印跡預(yù)染Marker、免疫印跡His6抗體和二抗等試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，蛋白電泳未預(yù)染Marker購(gòu)自Fermentas公司，Ni-NTA層析樹脂和Ni-NTA Spin Column購(gòu)自QIAGEN公司，15mL蛋白超濾管購(gòu)自Millipore公司，His Tag ELISA Detection Kit購(gòu)自GenScript公司，其他生化試劑購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。

本發(fā)明的一種釀酒酵母基因sumo(S)，其由序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列定義。

本發(fā)明的一種釀酒酵母基因sumo(S)的編碼蛋白，其由序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列定義。

本發(fā)明的一種SUMO蛋白酶基因ulp(S)，其由序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列定義。

本發(fā)明的一種SUMO蛋白酶基因ulp(S)的編碼蛋白，其由序列表SEQ ID No.4的氨基酸序列定義。

本發(fā)明的所述的釀酒酵母基因sumo(S)的表達(dá)載體，權(quán)利要求3所述的SUMO蛋白酶基因ulp(S)的重組載體。

本發(fā)明的一種pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)分別人工合成序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的基因；

(2)分別構(gòu)建pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體；所述的pMF-ulp(S)重組載體對(duì)載體是有選擇的，本發(fā)明證明ulp(S)構(gòu)建在pET28b載體中表達(dá)絕大多數(shù)是包涵體沉淀，而在pMF載體中可以實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá)。

所述釀酒酵母基因sumo(S)的表達(dá)載體為pET28b，所述SUMO蛋白酶基因ulp(S)的表達(dá)載體為pMF載體，宿主菌為大腸桿菌DH5α；

采用DNA重組技術(shù)，將序列表SEQ ID NO：1所示的sumo(S)基因插入pET28b的Nde Ⅰ和BamH Ⅰ酶切，將序列表SEQ ID NO：3所示的ulp(S)基因和pMF載體用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切，切膠回收后將對(duì)應(yīng)的基因和載體用T4DNA連接酶16℃連接5h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，孵育復(fù)性后涂布抗性平板37℃培養(yǎng)12h后挑取單菌落，在5mL Luria-Bertani培養(yǎng)基中37℃，220rpm搖菌培養(yǎng)12h后提質(zhì)粒，分別獲得pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體；

(3)用步驟(2)所述重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化宿主菌構(gòu)建對(duì)應(yīng)的基因工程菌；

(4)利用步驟(3)所述基因工程菌分別表達(dá)pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體；ulp(S)和sumo(S)基因誘導(dǎo)表達(dá)的條件，28℃誘導(dǎo)12h，誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)終濃度為0.5mmol/L。

(5)利用純化技術(shù)，分別獲取pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體。

本發(fā)明的一種含六種融合標(biāo)簽的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重組載體的制備方法，包括如下步驟：

對(duì)于ULP(S)可溶表達(dá)和酶活力的促進(jìn)作用的純化標(biāo)簽蛋白，所述標(biāo)簽蛋白包括如下六種：DnaK、MBP、GST、Tig、GroEL、Trx。

將dnaK、mbp、gst、tig、groEL、trx六種標(biāo)簽蛋白和pET28b-tevS用Nde Ⅰ，Bgl Ⅱ酶切后連接轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證正確后，再將這六種標(biāo)簽載體和ulp(S)用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切后連接，轉(zhuǎn)化、酶切驗(yàn)證成功后將六種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌常用的表達(dá)菌株BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在平板中挑取單菌落，在5mL Luria-Bertani培養(yǎng)基中37℃，220rpm搖菌培養(yǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)到OD₆₀₀至0.6時(shí)加終濃度為0.5mmol/L的IPTG 28℃誘導(dǎo)12h，然后收集菌體超聲破碎，冷凍離心后將上清蛋白樣品，制得含六種融合標(biāo)簽的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重組載體。

本發(fā)明的所述的釀酒酵母基因sumo(S)、所述的SUMO蛋白酶基因ulp(S)、所述的pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重組載體和所述的含六種融合標(biāo)簽的SUMO蛋白酶基因ulp(S)重組載體在酶工程中的應(yīng)用。

本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)釀酒酵母sumo基因和SUMO蛋白酶ulp基因在大腸桿菌中的高表達(dá)，具體的說是實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌常用的表達(dá)菌株BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，并保證功能不受影響。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)改善來源于釀酒酵母的sumo和ulp基因在大腸桿菌中表達(dá)量低的缺陷，實(shí)現(xiàn)在大腸桿 菌中的高表達(dá)，從而拓廣SUMO融合標(biāo)簽系統(tǒng)在蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用。本發(fā)明利用大腸桿菌密碼子偏愛性人工合成的釀酒酵母小泛素相關(guān)修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier)sumo基因(sumo(S))和SUMO蛋白酶ulp基因(ulp(S))的全序列，通過篩選表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了兩種基因在大腸桿菌中的高表達(dá)，利用構(gòu)建的融合蛋白底物進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)證明合成的ulp基因不影響其功能。

(2)本發(fā)明的合成基因sumo(S)和ulp(S)通過篩選發(fā)現(xiàn)，分別構(gòu)建在pET28b和pMF載體中(N端均含His6標(biāo)簽)，在BL21(DE3)菌株中可以實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá)，表達(dá)量較野生型相比有很大提升。用密碼子偏愛性，在大腸桿菌同義突變庫(kù)篩選替換了sumo和ulp基因中的稀有密碼子，人工合成了兩段基因sumo(S)和ulp(S)。

(3)本發(fā)明同時(shí)構(gòu)建了含六種融合標(biāo)簽(DnaK、MBP、GST、Tig、GroEL、Trx)的ulp(S)重組載體，在BL21(DE3)中表達(dá)均良好。對(duì)含六種融合標(biāo)簽和只含His6標(biāo)簽的ULP(S)測(cè)定酶活顯示，融合標(biāo)簽不能再進(jìn)一步提高ULP(S)的酶活力。定量檢測(cè)ULP(S)酶活性的eDAL底物融合系統(tǒng)為本實(shí)驗(yàn)室早前發(fā)明[Zhou C.et al.2014.A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases.Microbial Cell Factories.13(1):44.]。

(4)本發(fā)明將酶與底物在大腸桿菌胞內(nèi)進(jìn)行共表達(dá)，通過設(shè)置野生型對(duì)照，證明野生型與合成的ULP均可以有效切除野生型SUMO標(biāo)簽，但均不能有效切除合成的SUMO標(biāo)簽。對(duì)H6-ULP(S)進(jìn)行大量蛋白純化，1L Luria-Bertani培養(yǎng)基經(jīng)Ni柱親和層析得到的目的蛋白超濾后得到約62mg H6-ULP(S)蛋白酶。

實(shí)施例1

sumo(S)和ulp(S)重組載體的構(gòu)建、表達(dá)、檢測(cè)和表達(dá)量測(cè)定

sumo(S)基因和pET28b載體用Nde Ⅰ，BamH Ⅰ酶切，ulp(S)基因和pMF載體用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切，切膠回收后將對(duì)應(yīng)的基因和載體用T4DNA連接酶16℃連接5h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，孵育復(fù)性后涂布抗性平板37℃培養(yǎng)12h后挑取單菌落，在5mL Luria-Bertani培養(yǎng)基中37℃，220rpm搖菌培養(yǎng)12h后提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后測(cè)序。

將測(cè)序正確的pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)照質(zhì)粒分別為pET28b-sumo(wt)和pET28b-ulp(wt)，對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在平板中挑取單菌落，在5mL Luria-Bertani培養(yǎng)基中37℃，220rpm搖 菌培養(yǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)到OD₆₀₀至0.6時(shí)加終濃度為0.5mmol/L的IPTG 28℃誘導(dǎo)12h，然后收集菌體超聲破碎，4℃12000rpm離心后將上清蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳和His6抗體的免疫印跡檢測(cè)。

結(jié)果如圖1A、B和圖2A、B所示：SDS-PAGE分離膠的丙烯酰胺濃度均為12％，His6抗體印跡的一抗為Anti-His6Mouse mAb，二抗為Goat Anti-Mouse lgG，HRP。從圖中可看出H6-SUMO(S)和H6-ULP(S)表達(dá)量明顯提高，但兩種蛋白與野生型相比在聚丙烯酰胺中的遷移率均發(fā)生改變。

驗(yàn)證表達(dá)后我們用His Tag ELISA Detection Kit測(cè)定細(xì)胞破碎液離心后上清液含His6標(biāo)簽的蛋白濃度，檢測(cè)合成基因與野生型基因表達(dá)量的區(qū)別。

測(cè)定的方法：從H6-SUMO(S)、H6-ULP(S)的BL21(DE3)平板和H6-SUMO(WT)、H6-ULP(WT)的BL21(DE3)、Rosetta(DE3)平板分別挑取單菌落搖菌過夜至OD值穩(wěn)定，再取10μL菌液在5mL Luria-Bertani培養(yǎng)基中37℃，220rpm搖菌培養(yǎng)，每組3個(gè)平行。細(xì)菌生長(zhǎng)到OD₆₀₀至0.6時(shí)加終濃度為0.5mmol/L的IPTG 28℃誘導(dǎo)12h后收菌2mL，PBS清洗菌體后再加800μL PBS懸浮菌體，超聲破碎至細(xì)胞裂解完全，4℃12000rpm離心后取上清混勻。對(duì)H6-SUMO(WT)和H6-SUMO(S)，將上清用PBS稀釋100倍后測(cè)定含His6標(biāo)簽的蛋白濃度，對(duì)H6-ULP(WT)和H6-ULP(S)，將上清用PBS稀釋200倍后測(cè)定含His6標(biāo)簽的蛋白濃度。測(cè)定方法具體見ELISA試劑盒說明書。結(jié)果如圖1C和圖2C所示，其中：

H6-SUMO(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表達(dá)及H6-SUMO(S)在BL21(DE3)表達(dá)的His6標(biāo)簽蛋白濃度分別為：203pmol/mL，262pmol/mL，889pmol/mL，H6-SUMO(S)在BL21(DE3)菌株中的表達(dá)量分別是前者的4.38倍和3.39倍。

H6-ULP(WT)在BL21(DE3)、Rosetta(DE3)表達(dá)及H6-ULP(S)在BL21(DE3)表達(dá)的His6標(biāo)簽蛋白濃度分別為：568pmol/mL，802pmol/mL，1160pmol/mL。H6-ULP(S)在BL21(DE3)菌株中表達(dá)量分別是前者的2.04倍和1.45倍。

實(shí)施例2

含六種融合標(biāo)簽的ulp(S)重組載體的構(gòu)建和表達(dá)

dnaK、mbp、gst、tig、groEL、trx六種標(biāo)簽和pET28b-tevS用Nde Ⅰ，Bgl Ⅱ酶切后連接轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證正確后，再將這六種標(biāo)簽載體和ulp(S)用BamH Ⅰ，HindⅢ酶切后連接，轉(zhuǎn)化、酶切驗(yàn)證成功后將六種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在平板中挑取單菌落，在5mL Luria-Bertani培養(yǎng)基中37℃，220rpm搖菌培養(yǎng)， 細(xì)菌生長(zhǎng)到OD₆₀₀至0.6時(shí)加終濃度為0.5mmol/L的IPTG 28℃誘導(dǎo)12h，然后收集菌體超聲破碎，冷凍離心后將上清蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。如圖3所示。結(jié)果顯示標(biāo)簽融合的ULP(S)表達(dá)均良好。

實(shí)施例3

只含His6標(biāo)簽的ULP(S)和含六種融合標(biāo)簽的ULP(S)的酶活測(cè)定

本發(fā)明以SUMO(WT)-eDAL為底物測(cè)定只含His6標(biāo)簽的ULP(S)和含六種融合標(biāo)簽的ULP(S)的酶活。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，酶切條件定為七種標(biāo)簽蛋白的細(xì)胞破碎液與底物SUMO-eDAL的蛋白量比例為1∶100,30℃水浴酶切0.5h，酶切反應(yīng)處在20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 8.0緩沖液體系中，冰浴終止反應(yīng)后過Ni-NTA Spin Column，流出液測(cè)DAL酶活。DAL酶活測(cè)定反應(yīng)體系為：

立即加入終止液2M HCl(含0.03w/v 2,4-DNP，即2,4-二硝基苯肼)500μL，冰浴放置10min。

加入顯色液2M NaOH 1mL，混勻，靜置5min，測(cè)520nm處吸光度值A(chǔ)₅₂₀。

酶切電泳圖譜和七種融合蛋白的酶活測(cè)定柱狀圖如圖4所示。顯示標(biāo)簽蛋白對(duì)ULP(S)酶活力沒有明顯的促進(jìn)作用。

實(shí)施例4

ULP(WT)和ULP(S)與底物SUMO(WT)-eDAL和SUMO(S)-eDAL在胞內(nèi)共表達(dá)的酶切效果

本發(fā)明通過胞內(nèi)共表達(dá)探究ULP(WT)和ULP(S)是否可以分別酶切含SUMO(WT)和SUMO(S)標(biāo)簽的底物。首先構(gòu)建了四種重組載體：pACYC-ulp(wt)(Cm+)，pMF-ulp(S)(Amp+)，pSUMO(WT)-edal(Kan+)，pSUMO(S)-edal(Kan+)，不加酶的對(duì)照組設(shè)置為底物與不含ulp(wt)和ulp(S)的空載體共表達(dá)。得到以下四對(duì)組合：

將四種酶-底物組合轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)后蛋白電泳，電泳圖譜如圖5所示。結(jié)果顯示ULP(WT)和ULP(S)均可以有效的切除底物的SUMO(WT)標(biāo)簽，但兩種酶均不能有效切除SUMO(S)標(biāo)簽。

實(shí)施例5

ULP(S)蛋白純化與產(chǎn)量測(cè)定

本發(fā)明將ULP(S)進(jìn)行大量蛋白純化。在pMF-ulp(S)BL21(DE3)平板中挑取單菌落至6mL Luria-Bertani培養(yǎng)基中，添加終濃度為100mg/L的氨芐青霉素，37℃，220rpm過夜搖菌，再按1:200比例擴(kuò)繁至1L含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，細(xì)菌生長(zhǎng)到OD₆₀₀至0.6時(shí)加終濃度為0.5mmol/L的IPTG 28℃誘導(dǎo)12h，然后收集菌體超聲破碎，破碎功率300W，超聲破碎3s，間隔9s，破碎1h后8000rpm冷凍離心30min，上清液過5mL Ni-NTA親和層析樹脂，分別用Lysis Buffer和Wash Buffer洗除雜蛋白，最后用Elution Buffer洗脫下目的蛋白。目的蛋白用截留大小為10kDa的蛋白超濾管濃縮，再將Elution Buffer置換為蛋白儲(chǔ)存液，濃縮至1mL左右加體積分?jǐn)?shù)為25％的甘油混勻分裝后放－80℃超低溫冰箱保存。三種Buffer和蛋白儲(chǔ)存液的組分分別為：

Lysis Buffer：50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0。

Wash Buffer：50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，40mmol/L咪唑，pH 8.0。

Elution Buffer：50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH 8.0。

蛋白儲(chǔ)存液：20mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，pH 8.0。

純化的蛋白電泳檢測(cè)為較純的一條帶。如圖6所示。

用Bradford法測(cè)定超濾后得到的ULP(S)蛋白濃度，1L LB培養(yǎng)基可得到約62mg的蛋白酶，遠(yuǎn)高于已報(bào)道的野生型ULP產(chǎn)量(約20mg)[Lee C,D.et al.2008.An improved SUMO fusion protein system for effective production of native proteins.Protein Sci.17(7):1241-1248.]。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到 的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。