本申請屬于棉花抗性育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及棉花GbDREB基因在棉花抗黃萎病中的應(yīng)用的專利申請。

背景技術(shù)：

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌通過土壤傳播，最終引發(fā)一種維管束的真菌性病害，這種病害具有非常嚴(yán)重的危害。具有分布范圍很廣、寄主種類多及存活時間長等多個特點，它可以使棉花大幅度的減產(chǎn)或者特別嚴(yán)重的時候會絕收。

植物之所以能抵抗病原微生物的入侵，是因為植物的天然免疫系統(tǒng)起的作用。以至于植物可以抵抗病原微生物的入侵。這種調(diào)節(jié)的抗性是非常普遍的。還有一種免疫反應(yīng)可以由效應(yīng)蛋白所激發(fā)，它是由抗病基因 (Resistant gene，R gene) 翻譯出來的蛋白來辨別病原菌效應(yīng)子，然后促進(jìn)防衛(wèi)反應(yīng)。預(yù)先形成的防衛(wèi)反應(yīng) (pre-formed defense) 和誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng) (induced defense) 都是植物的防衛(wèi)反應(yīng)。植物防御有物理屏障和能夠抗病的的化學(xué)成分。比如物理屏障有細(xì)胞壁的角質(zhì)、蠟質(zhì)、木質(zhì)素、還有植物體表的絨毛、特殊的氣孔等等。后者是植物的第二道防御體系，它只有當(dāng)病原菌突破植物的第一道防線時才能起作用，主要包括活性氧的釋放、防衛(wèi)基因表達(dá)、過敏反應(yīng)(Hypersensitive response，HR) 和系統(tǒng)獲得抗性 (Systematic acquired resistance，SAR) 等。

DREB類轉(zhuǎn)錄因子序列中只含有一個AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，其中有兩個非常保守的結(jié)構(gòu)域，一個是YGR結(jié)構(gòu)域，一個是RAYD結(jié)構(gòu)域。YRG結(jié)構(gòu)域的N端是由20個氨基酸殘基的堿性親水區(qū)組成，第二個β折疊的第14位和第l9位的氨基酸殘基分別為纈氨酸 (V14) 和谷氨酸 (El9) ，這兩個氨基酸位點是與DRE作用元件相互結(jié)合的關(guān)鍵位點，它可以們識別然后結(jié)合各類順式作用元件。RAYD結(jié)構(gòu)域在AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的C端，它的核心區(qū)域是由大約l8個氨基酸殘基組成，這18個氨基酸可形成雙親性的α螺旋，他可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與DRE順式作用元件結(jié)合的能力，通過影響YRG保守區(qū)的構(gòu)象或通過與其他蛋白發(fā)生相互作用進(jìn)而發(fā)揮作用。DREBs類轉(zhuǎn)錄因子在序列中存在一段富含Ser/Thr的區(qū)域，這個區(qū)域可以在基因間的磷酸化及相互作用中起重要的作用。

DRE/CRT順式作用元件普遍存在于脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的啟動子中，在RD17、KIN1 和COR6.6 等擬南芥干旱和低溫應(yīng)答相關(guān)基因啟動子區(qū)、及大麥 (Hordeum vulgare L.) Dhn 、油菜 (Brassicanapus L.) BN115、玉米 (Zea mays L.) RAB17和小麥 (Triticum aestivum L.) WCS120 等脅迫相關(guān)基因的啟動子區(qū)中，DRE或DRE 核心序列 (CCGAC) 元件均被分離并鑒定。DREBs轉(zhuǎn)錄因子能夠特異地識別并結(jié)合該順式作用元件，進(jìn)而參與調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)及功能行使。

在逆境脅迫時，DREB1/CBF基因是怎么被激活表達(dá)的，能起作用的原因可能是ICE1類上游轉(zhuǎn)錄因子。DREB基因的啟動子有可以和ICE1結(jié)合的元件，使DREB/CBF被激活然后表達(dá)。另一方面，DREB/CBF基因的表達(dá)也能受到鈣離子的調(diào)節(jié)作用，比如Ca²⁺/H⁺轉(zhuǎn)運體和Ca²⁺感應(yīng)蛋白如果突變的話，DREB/CBF基因的表達(dá)也能受到影響。DREB2類轉(zhuǎn)錄因子有可以由兩個方法去調(diào)節(jié)：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)。如在正常的時候，下游基因的激活和DREB2A基因沒有關(guān)系，但如果一段負(fù)調(diào)控的序列缺失，就導(dǎo)致DREB2A的改變。

總體而言，現(xiàn)有關(guān)于DREB類家族在植物逆境方面的研究報道很多，但是在抗病的方面報道的較少。因而，進(jìn)一步研究DREB類基因的抗病性具有重要的意義和潛在的應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在前期棉花抗黃萎病基因篩選基礎(chǔ)上，本發(fā)明主要目的是提供了具有一定抗黃萎病應(yīng)用前景的GbDREB基因，從而為新的抗黃萎病棉花品種的培育奠定一定應(yīng)用基礎(chǔ)。

本申請所采取的詳細(xì)技術(shù)方案如下。

棉花GbDREB基因在抗黃萎病中的應(yīng)用，所述GbDREB基因，GenBank編號為KP259810，其ORF有531bp，蛋白序列分析表明，其含有一個典型的高度保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域；該基因?qū)儆贒REB類A4成員，屬海島棉中AP2家族成員；

亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，該基因定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)；

基因表達(dá)檢測結(jié)果表明，該基因在棉花的根、莖、葉中均有表達(dá)，當(dāng)棉花受到黃萎病菌的侵染后，該基因表達(dá)量有明顯提高，此結(jié)果表明該基因在在棉花黃萎病生物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要作用。

進(jìn)一步VIGS技術(shù)應(yīng)用結(jié)果表明，將GbDREB基因沉默后，植株黃萎病發(fā)病率及病情指數(shù)提升。

基于上述研究結(jié)果，在將GbDREB基因進(jìn)行超表達(dá)后，可以用于培育新的具有高抗黃萎病植物新品種。

在前期對棉花黃萎病誘導(dǎo)相關(guān)基因研究基礎(chǔ)上，發(fā)明人對其中表達(dá)量差異明顯的EST序列進(jìn)行了測序，即本申請中所述的GbDREB基因。進(jìn)一步地，通過電子克隆技術(shù)，在海島棉中成功克隆獲得了這個基因，并對其生物學(xué)信息進(jìn)行了詳細(xì)分析。更進(jìn)一步應(yīng)用實驗表明，在將這個基因進(jìn)行沉默后，植株的抗病性降低，表明這個基因與黃萎病的抗性高度相關(guān)?；诖搜芯拷Y(jié)果，可為黃萎病抗性的分子機制研究、新的抗黃萎病植物新品種培育奠定一定應(yīng)用基礎(chǔ)，同時也為新的抗病基因篩選及抗性植物培育提供了新的借鑒和參考。

附圖說明

圖1為PCR產(chǎn)物電泳檢測，其中：M: 2000bp ladder Marker；1-6：PCR產(chǎn)物；

圖2 為GbDREB蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測；

圖3為 DREB蛋白AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對分析；

圖4為棉花AP2轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化樹分析；

圖5為棉花GbDREB轉(zhuǎn)錄因子的亞族進(jìn)化樹分析；

圖6為融合表達(dá)載體p35S-GFP::GbDREB轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101后菌液PCR檢測，其中：2K：2000 bp ladder Marker；1-14：菌液PCR檢測；N:陰性對照；P:陽性對照；

圖7為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時轉(zhuǎn)48 h后觀察GFP::GbDREB融合蛋白表達(dá)情況；

圖8 為GbDREB在不同棉花組織（根、莖、葉）中表達(dá)量的qRT-PCR結(jié)果；

圖9 為GbDREB表達(dá)模式的分析結(jié)果，其中：(A)海島棉海15根系在黃萎病菌V991侵染后，GbDREB基因表達(dá)模式的RT-PCR分析結(jié)果；(B)海島棉海15根系在黃萎病菌V991侵染后，GbDREB基因表達(dá)模式的qRT-PCR分析結(jié)果；

圖10為對照(TRV:00)和GbDREB (pTRV: GbDREB) 棉花材料對黃菱病菌的抗性分析，其中：(A)冀棉11的TRV:00和pTRV: GbDREB用蘸根法接種黃萎病菌V991孢子液(10⁷conidia/mL)16天的發(fā)病情況，冀棉11接種黃萎病菌16天后病指的統(tǒng)計；(B) 新海15的TRV:00和pTRV: GbDREB用蘸根法接種黃萎病菌V991孢子液(10⁷conidia/mL)16天的發(fā)病情況，新海15接種黃萎病菌16天后病指的統(tǒng)計。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本申請做進(jìn)一步的解釋說明。在介紹具體實施例前，就下述實施例中部分物料情況簡要介紹說明如下。

棉花材料包括：陸地棉感黃萎病品種冀棉11，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所朱荷琴研究員提供；

抗黃萎病海島棉新海15，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所杜雄明研究員提供；

黃萎病菌株：棉花黃萎病強致病力菌系V991，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所簡桂良研究員提供；

引物序列：均由華大科技合成提供；

其他生物材料包括：

大腸桿菌菌種DH5α、農(nóng)桿菌菌種GV310、TA克隆載體pMD18-T Vector、BP反應(yīng)入門載體pDONOR221、基因亞細(xì)胞定位載體PK7FWG2.0、VIGS干涉技術(shù)載體TRV1和TRV2等；均屬于商品化菌株或載體，不再贅述；

實驗試劑：

質(zhì)粒提取試劑盒、oligo(dT)18、RNAase抑制劑、dNTP、pMD18-T Vector、T4-DNA連接酶、內(nèi)切酶BamH I和Kpn I、Ex Taq酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、熒光定量PCR試劑盒等均為TaKaRa公司產(chǎn)品；

熒光定量PCR專用板為Labwares公司產(chǎn)品；

RNA提取試劑盒購自Aidlab Biotech（Beijing，China）公司；

反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV為Promega公司產(chǎn)品；

所用培養(yǎng)基及溶液有：LB液體（固體）培養(yǎng)基、YEP液體（固體）培養(yǎng)基、察氏（Czapek）培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、50×TAE Buffer（Na₂EDTA?2H₂O 37.2 g，冰乙酸57.1 mL，NaOH調(diào)pH=8.3，加水定容至1 L）等，均按本領(lǐng)域常規(guī)制備方法制備即可；

其他未描述的抗生素、激素類等試劑均為本領(lǐng)域常用試劑，不再贅述。

實施例1

前期研究基礎(chǔ)上，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在受黃萎病侵染后，棉花GbDREB基因的表達(dá)量發(fā)生了明顯變化，因而，發(fā)明人以海島棉（新海15）為基礎(chǔ)，對GbDREB基因進(jìn)行了詳細(xì)分析，具體過程簡要介紹如下。

一、海島棉GbDREB基因的獲得

首先，種植棉花，提取幼苗棉花的RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；

RNA提取步驟參考EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄步驟如下：

Total RNA，1000/RNA濃度；

Oligo dT18 (10 μM)，1μL；

隨機引物，1μL；

ddH₂O (RNase-free)補齊至13μL；

PCR儀中，65℃運行5 min，迅速放在冰上2 min；

在上述反應(yīng)體系中加入如下試劑：

5×RT Buffer，4μL；

50U/μL Rnasin，1μL；

10 mM dNTPs，1μL；

200U/L M-MLV，1μL；

PCR儀中運行此程序：42℃，60 min，85℃，5min。

以cDNA為模板，設(shè)計引物并進(jìn)行基因的擴(kuò)增，引物序列為：

GbDREB-F: 5’- AGCCAAACATCCAAGTCCC-3’，

GbDREB-R: 5’- TGATGAAAATGAAAAGACCAAA-3’；

PCR擴(kuò)增體系設(shè)計如下：

Taq酶(2.5 U/μL），10μL；

Primer F（GbDREB-F），0.2μL；

Primer R（GbDREB-R），0.2μL；

cDNA，1μL；

ddH₂O，8.6μL；

PCR擴(kuò)增程序：95℃，5min；95℃、30s，57℃、30s，72℃、1min，30個循環(huán)；72℃，10min。

對PCR電泳產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，基因GbDREB大小為770 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

二、GbDREB基因的基礎(chǔ)生物信息學(xué)信息分析

回收步驟一中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠試劑盒(天根純化試劑盒)純化后，與pMD18-T載體連接，然后進(jìn)行菌液PCR檢測，并對陽性的質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行測序。

（1）GbDREB蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

初步分析認(rèn)為，本申請中的GbDREB基因與擬南芥AtERF1基因的DNA結(jié)合域較為相似，因此以AtERF1 (PDB ID：1gccA) 作為對照模型，通過http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi id=index對GbDREB的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。

對圖2進(jìn)行分析可以看出，AtERF1、GbDREB的組成基本相同，均由1個α螺旋和3個β折疊組成。

（2）對推測GbDREB所編碼氨基酸的序列分析

對GbDREB基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行Blastp同源性檢索并利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對，結(jié)果如圖3所示。

分析表明：一些玉米、棉花序列和GbDREB的氨基酸序列在某區(qū)段序列極為相似，都是AP2結(jié)構(gòu)域。含有AP2/EREBP domain含有兩個保守的序列元件:YRG和RAYD。該基因的氨基酸序列也符合典型的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的特征。

（3）基因GbDREB的序列比對和進(jìn)化樹分析

由于擬南芥和水稻中的AP2/ERF家族研究的比較完整，所以選取了擬南芥和水稻中典型的AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行同源進(jìn)化比對，對基因GbDREB構(gòu)建了同源進(jìn)化樹。結(jié)果如5所示。

利用MEGA5.0軟件對這個基因的蛋白和其它物種的AP2蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析，分析表明：

由進(jìn)化樹中可以看出，GbDREB在進(jìn)化關(guān)系上屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子中的DREB類亞組 (圖4) ；

將GbDREB同擬南芥、玉米、水稻等中AP2轉(zhuǎn)錄因子中DREB類A1～A6家族進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，基因GbDREB屬于DREB類A4亞族 (圖5) ；GbDREB與同源率最近的棉花GhDBP3的氨基酸相似率為42.98 % 。

GbDREB基因啟動子序列分析

用PlantCare在線網(wǎng)站，預(yù)測順式作用元件，結(jié)果如下表所示。

預(yù)測的GbDREB啟動子順式元件：

。

對上述啟動子順式元件進(jìn)行分析，可以看出，在GbDREB基因的上游均含有TC-rich repeats，該元件在響應(yīng)抗逆、抗病等方面起重要的作用。同時，GbDREB基因啟動子順式元件中均含有響應(yīng)和調(diào)節(jié)低氧或無氧條件的ARE motif。此外，該類基因均含有與光、植物激素響應(yīng)相關(guān)元件。這些結(jié)果表明，GbDREB的表達(dá)模式可能受到多種因素調(diào)控，參與棉花對生物逆境、非生物逆境的響應(yīng)和激素信號路徑的調(diào)控。

三、GbDREB蛋白在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

首先，通過同源重組的Gateway技術(shù)，參考現(xiàn)有載體構(gòu)建及鑒定的方法，將GbDREB的ORF區(qū)段 (不含終止密碼子) 的PCR產(chǎn)物連接到目標(biāo)載體pK7WGF2.0中，獲得融合表達(dá)載體p35S-GFP::GbDREB。

其次，將上述鑒定正確載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，用菌液PCR驗證陽性克?。炞C結(jié)果如圖6所示）。

最后，參考現(xiàn)有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染方法，將上述鑒定正確的農(nóng)桿菌滲透注射煙草葉片；2-3天后，剪一部分葉片，壓片后用激光共聚焦顯微鏡檢測GFP綠色熒光。結(jié)果如圖7所示。

檢測結(jié)果表明，p35S-GFP載體轉(zhuǎn)化的GFP蛋白在煙草細(xì)胞各個部位均有較強的表達(dá)；GFP::GbDREB在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)里均有表達(dá)，這一結(jié)果初步說明GbDREB可能定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)里。

實施例2

在前述實施例1中對于基因GbDREB基本特性了解基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步對這個基因在棉花組織中的自然情況下的組織表達(dá)模式、及受脅迫后組織表達(dá)情況進(jìn)行了具體分析，相關(guān)實驗簡要介紹如下。

一、自然情況下(野生型)基因GbDREB的組織表達(dá)模式

分別取新海15的根、莖、葉的組織，提取RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，采用如下定量PCR引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增：

QRT-PCR-GbDREBF: 5’- CTACAGGAGAGTATGTGGATGAGGATG-3’，

QRT-PCR-GbDREBR: 5’- CGTCGTCATCGGAAGGTATCAAG-3’；

內(nèi)參基因選用泛素蛋白7 (Ubiquitin7，UB7) ，引物序列設(shè)計如下：

UBQ7F: 5’-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’，

UBQ7R: 5’-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’；

qRT-PCR 是在 ABI 7500 Real-time PCR 序列檢測系統(tǒng)和軟件 (Applied Biosy stems，USA) 上進(jìn)行的；10 μL反應(yīng)體系設(shè)計如下：

cDNA（可進(jìn)行適當(dāng)稀釋），4.4 μL；

10×SYBR Green PCR Master Mix，5 μL；

引物，0.2 μL（正、反引物各0.1μL）；

ROXⅡ，0.2 μL；

PCR 程序為：95℃變性1 min，然后40個循環(huán) (95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性延伸40 s)。

40個循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性用溶解曲線分析檢測。每個反應(yīng)都包括了至少三個重復(fù)。用單一模板稀釋至不同濃度，通過模板稀釋倍數(shù)的log值對每個稀釋樣品的Ct值作圖檢測引物擴(kuò)增效率。

檢測結(jié)果如圖8所示。分析表明：GbDREB表達(dá)量在葉中的較高，在根中的相對較低。這一結(jié)果表明GbDREB的表達(dá)具有一定的組織差異性。

二、生物脅迫(黃萎病菌侵染)情況下GbDREB的表達(dá)模式

發(fā)明人在前期基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，GbDREB在棉花接種黃萎病菌前后表達(dá)量發(fā)生了顯著變化，為了進(jìn)一步分析該基因在棉花中受黃萎病菌侵染后的表達(dá)模式，發(fā)明人進(jìn)一步利用RT-PCR和qRT-PCR技術(shù)對該基因進(jìn)行了分析，具體過程如下。

選取兩葉一心的抗病品種海島棉新海15進(jìn)行傷根接種，接種所用的黃妻病菌V991分生孢子液濃度為1×10⁷spores/mL，以水處理做為對照。分別在接種1小時、12小時、24小時、48小時、120小時等時間點選取棉花根系，并分別在0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h等時間點取樣品葉片，提取RNA后并反轉(zhuǎn)錄出cDNA進(jìn)行表達(dá)模式分析。

RT-PCR分析時，引物設(shè)計如下：

F: 5’- TGGGTGTCTGAAATCCGTGAA-3’，

R: 5’- GGCGGTGAAACCAGCAAT-3’；

反應(yīng)體系設(shè)計如下：

Taq酶(2.5 U/μL），10μL；

Primer F，0.2μL；

Primer R，0.2μL；

cDNA，5.0μL；

ddH₂O，4.6μL；

PCR擴(kuò)增程序：95℃，5min；94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，30個循環(huán)；72℃，10min。

以泛素蛋白7（Ubiquitin7，UB7）作為內(nèi)參基因，設(shè)計引物進(jìn)行平行PCR反應(yīng)，相關(guān)引物及PCR反應(yīng)程序參考前述“自然情況下(野生型)基因GbDREB的組織表達(dá)模式”部分內(nèi)容即可。

在進(jìn)行樣品的均一性分析后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

實驗結(jié)果如圖9A所示，對其進(jìn)行分析可以看出：RT-PCR的結(jié)果表明，V991分生孢子液和水處理后，GbDREB的表達(dá)量在棉花根系中1小時、48小時都表現(xiàn)為上調(diào)。 qRT-PCR的結(jié)果表明，GbDREB的表達(dá)量在棉花葉中12小時、24小時、36小時都表現(xiàn)為表達(dá)量上調(diào)，且變化趨勢非常相似(圖9B)。

上述結(jié)果表明，在新海15的根系被黃萎病菌的侵染后，基因GbDREB的表達(dá)量變化明顯。

實施例3

進(jìn)一步地，發(fā)明人利用VIGS技術(shù)構(gòu)建了VIGS干涉載體，以對基因GbDREB進(jìn)行沉默。在觀察基因沉默后棉花對黃萎病菌侵染時的表型變化情況后，結(jié)果進(jìn)一步證明，基因GbDREB與黃萎病抗性高度相關(guān)，相關(guān)實驗情況簡要介紹如下。

（1）構(gòu)建VIGS干涉載體

在基因GbDREB的非保守區(qū)段設(shè)計引物：

F: 5’- GCGGATCCATTTTTCTAATAATGCTGCTGTAAG-3’，

R: 5’- GGGGTACCGCTGCAACTTAATACCACCAAT-3’；

引物設(shè)計原則為：在上游引物加上酶Kpn I的酶切位點和保護(hù)堿基，在下游引物加上酶BamH I的酶切位點和保護(hù)堿基；

PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列 (約200 bp) ；

然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后和空載體pTRV2，分別用酶BamH I和酶Kpn I在37℃水浴的條件下進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下：

10×K Buffer，5 μL；

BamH I和Kpn I，各2.5 μL；

DNA片段，30 μL（雙酶切pTRV2質(zhì)粒時，用量為20 μL)；

ddH2O，10 μL（雙酶切pTRV2質(zhì)粒時，ddH₂O加20 μL)，，

酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳；回收目的序列，并利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建VIGS干涉載體pTRV::GbDREB。

（2）基因GbDREB分別在冀棉11和新海15沉默后，棉花對黃萎病菌響應(yīng)情況

將pTRV1、pTRV2和pTRV2::GbDREB分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌中，分別搖瓶培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6~0.8左右；

將pTRV1侵染液分別與pTRV2、pTRV2::GbDREB的侵染液按照體積比1: 1 的比例均勻混合（制備侵染液時，首先離心獲得菌體，然后重懸浮，重懸浮時，懸浮液配方為：AS，100 mmol/L、200μL；MES，1 mol/L 、1000μL；MgCl₂，1 mol/L 、1000μL；ddH₂O加至100mL）。

注射菌液（侵染液）時，采用2 mL注射器進(jìn)行注射，具體過程為：

在子葉平展，還沒有長出真葉的時候，在棉花幼苗子葉的背面輕輕劃個斜面，把菌液慢慢打入子葉中，盡量使子葉都被注滿；

之后避光24小時，待棉花幼苗生長至兩葉一心時，取葉片提取RNA (最好是新長的真葉)，然后進(jìn)行RT-PCR，檢測目標(biāo)基因是否被降低表達(dá)。

侵染棉花的方法是采用傷根接種的方法，用黃萎病菌V991孢子液 (1×10⁷ conidia/mL) 侵染棉花。到真葉開始出現(xiàn)變黃、萎蔫的時候統(tǒng)計棉花黃萎病發(fā)病的情況。

參照《棉花黃萎病菌檢疫檢測與鑒定》中方法，統(tǒng)計棉花的病情指數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)號:GB/T28084-2011)：

病情指數(shù)=∑(病級株數(shù)×代表數(shù)值)×100/調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最重級的代表數(shù)值。

結(jié)果表明，基因沉默的棉花植株的病指比對照棉花植株要高20%左右 (圖10A、B) 。

形態(tài)觀察表明，基因沉默的棉花植株的葉片黃化，掉落的葉片比對照組的棉花嚴(yán)重 (圖10 A、B) 。

綜合上述結(jié)果可以看出，無論是在感病品種冀棉11還是抗病品種新海15中，沉默GbDREB基因后，在受到黃萎病菌侵染時，棉花的發(fā)病率和病指明顯提高，說明GbDREB基因的沉默降低了棉花對黃萎病的抗性。