本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及水稻OsPCF7基因在培育高分蘗水稻品種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻作為單子葉植物的典型代表，在全世界是最重要的三大糧食作物之一，全世界約有二分之一以上的人食用水稻，有三分之一以上的人口以水稻為主食。社會經(jīng)濟(jì)快速的發(fā)展促進(jìn)了對糧食需求的增長，增加了我們對糧食的需要。如今，糧食安全生產(chǎn)已經(jīng)成為一個必須解決的嚴(yán)重問題，然而水稻植株的發(fā)育形態(tài)建成會直接影響植株的產(chǎn)量。水稻是分蘗的作物，分蘗是水稻自身的生理遺傳特性。水稻分蘗實(shí)質(zhì)上就是水稻莖稈的分枝，是水稻株型的重要組成部分，同時也是水稻產(chǎn)量形成的決定因素。大量的研究表明，分蘗對水稻群體結(jié)構(gòu)，光合作用，物質(zhì)生產(chǎn)與分配及產(chǎn)量結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。植物的形態(tài)建成主要通過調(diào)控器官的生長、分化，植物器官的大小和性狀依賴于其持續(xù)增長的細(xì)胞的數(shù)量、大小和性狀，也就是細(xì)胞分裂、增殖和分化的過程。產(chǎn)生一個植物的復(fù)雜結(jié)構(gòu)與這些過程的調(diào)控是必不可少的。然而，細(xì)胞分裂、增殖和分化的主要調(diào)節(jié)者是轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子與DNA或啟動子結(jié)合來啟動該基因的表達(dá)，最終決定了細(xì)胞和完整的組織特征，從而調(diào)控植物的發(fā)育過程。TCP蛋白家族最為植物特異性的轉(zhuǎn)錄因子，已經(jīng)證實(shí)是植物形態(tài)建成的主要調(diào)控者，參與多方面的植物生長發(fā)育相關(guān)的過程，例如胚胎發(fā)育、葉子的發(fā)育、花對稱性、花粉發(fā)育、晝夜節(jié)律、葉形態(tài)發(fā)生和衰老等。近年來，隨著基因工程的迅速發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日益完善，基因工程育種已成為育種領(lǐng)域的一個重要分支，在定向改良水稻特性方面也顯示出極大的潛力。利用分子生物學(xué)手段，將調(diào)控水稻生長發(fā)育的關(guān)鍵基因?qū)肽繕?biāo)水稻品種中，定向改良目標(biāo)水稻品種的特性，是改良水稻品種的一種有效手段。這對提高水稻產(chǎn)量、改善水稻品質(zhì)、保障人們的生活、提高人們的經(jīng)濟(jì)收入有著重要的意義。水稻TCP蛋白家族的OsPCF7基因的核苷酸序列已有文獻(xiàn)報道，但迄今為止，還未見利用該基因在培育高分蘗水稻品種的相關(guān)報道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供水稻OsPCF7基因在培育高分蘗水稻品種中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供含有水稻OsPCF7基因的植物表達(dá)載體在培育高分蘗水稻品種中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之三在于提供含有水稻OsPCF7基因的微生物轉(zhuǎn)化體在培育高分蘗水稻品種中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：1、水稻OsPCF7基因在培育高分蘗水稻品種中的應(yīng)用，其特征在于：所述水稻OsPCF7基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。本發(fā)明中，所述水稻品種為水稻中花11號。2、含有水稻OsPCF7基因的植物表達(dá)載體在培育高分蘗水稻品種中的應(yīng)用，所述水稻OsPCF7基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。本發(fā)明中，所述水稻品種為水稻中花11號。本發(fā)明中，所述含有水稻OsPCF7基因的植物表達(dá)載體含有由35S啟動子、水稻OsPCF7基因和Tnos終止子組成的表達(dá)框。本發(fā)明中，所述含有水稻OsPCF7基因的植物表達(dá)載體是由水稻OsPCF7基因替換pCAMBIA1301載體上GUS基因讀碼框而得。本發(fā)明中，所述含有水稻OsPCF7基因的植物表達(dá)載體由以下方法制備：a.克隆水稻OsPCF7基因：先提取水稻總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)獲得cDNA第一鏈，然后以cDNA第一鏈為模板，SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示核苷酸序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得水稻OsPCF7基因；b.植物表達(dá)載體的構(gòu)建：將步驟a擴(kuò)增獲得的帶酶切位點(diǎn)的水稻OsPCF7基因分別用NcoI和BstEII雙酶切回收水稻OsPCF7基因酶切片段，同時用NcoI和BstEII雙酶切pCAMBIA1301載體回收載體骨架，然后將酶切后的水稻OsPCF7基因酶切片段與pCAMBIA1301載體骨架連接，得含有水稻OsPCF7基因的植物表達(dá)載體。3、含有水稻OsPCF7基因的微生物轉(zhuǎn)化體在培育高分蘗水稻品種中的應(yīng)用，所述水稻OsPCF7基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。本發(fā)明中，所述水稻品種為水稻中花11號。本發(fā)明中，所述微生物轉(zhuǎn)化體為農(nóng)桿菌。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)水稻OsPCF7基因具有調(diào)控水稻形態(tài)建成的功能，因此根據(jù)水稻OsPCF7基因的序列特點(diǎn)，選取水稻OsPCF7基因的讀碼框片段，構(gòu)建了水稻OsPCF7基因的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將水稻OsPCF7基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入中花11號中，獲得了轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株，檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株中OsPCF7基因的表達(dá)較非轉(zhuǎn)基因水稻植株顯著增加，轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株的分蘗數(shù)量顯著增加，表明水稻OsPCF7基因可用于高分蘗能力水稻的育種，對獲得促進(jìn)水稻穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)水稻具有重要意義。附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖和附表：圖1為OsPCF7基因讀碼框片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為OsPCF7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2為超表達(dá)雙元載體pCAMBIA1301-OsPCF7的PCR鑒定圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為以超表達(dá)雙元載體pCAMBIA1301-OsPCF7為模板獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3為超表達(dá)雙元載體pCAMBIA1301-OsPCF7的酶切鑒定圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為超表達(dá)雙元載體pCAMBIA1301-OsPCF7的酶切產(chǎn)物。圖4為OsPCF7基因植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-OsPCF7的結(jié)構(gòu)圖(LB：左邊界、RB：右邊界；T35S：35S終止子；HPT：潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；Pnos：胭脂堿合成酶啟動子；MCS：多克隆酶切位點(diǎn)；P35S：35S啟動子；OsPCF7：水稻OsPCF7基因；Tnos：終止子)。圖5為轉(zhuǎn)基因陽性植株與非轉(zhuǎn)基因植株基因組DNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，L1、L2、L3和L4分別為不同株系的轉(zhuǎn)基因陽性植株，NT為非轉(zhuǎn)基因植株。圖6為水稻幼苗圖，其中NT為非轉(zhuǎn)基因植株，L1、L2、L3和L4分別為不同株系的轉(zhuǎn)基因陽性植株。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實(shí)施例中使用的水稻品系為中花11號(Oryzasativacv.Zhonghua11)，質(zhì)粒pCAMBIA1301(攜帶CaMV35S啟動子和終止子)和大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0試劑盒、限制性內(nèi)切酶、TaqDNA合成酶等為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)為TIANGEN公司產(chǎn)品。其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。實(shí)施例1、水稻OsPCF7基因讀碼框片段的克隆根據(jù)GenBank中查找到的OsPCF7基因候選序列(NM_001050819)，用序列處理在線工具包(SMS)生物軟件網(wǎng)http://www.bio-soft.net/sms查找其最大開放閱讀框序列，采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物OsPCF7-f：5’-catgccatgggcatgcgcaacgccaagg-3’(SEQIDNo.1，下劃線部分為NcoI酶切位點(diǎn))和OsPCF7-r：5’-gggtaacctcacctgatcacctcacttcc-3’(SEQIDNo.2，下劃線部分為BstEII酶切位點(diǎn))。取不同中花11號水稻幼苗，提取總RNA，然后將提取的總RNA根據(jù)TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，再以該cDNA第一鏈為模板，利用引物OsPCF7-f和OsPCF7-r擴(kuò)增OsPCF7基因的讀碼框序列。PCR擴(kuò)增體系組成為：2×TaqMix25μl、OsPCF7-f2.5μl、OsPCF7-r2.5μl、cDNA2.5μl、ddH2O17.5μl，共50μl。序列擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30s；95℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸50s，循環(huán)35次；最后72℃后延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增出一條大小為833bp的DNA片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收純化，按照試劑盒說明書操作。實(shí)施例2、水稻OsPCF7基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建用NcoI和BstEII雙酶切純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到OsPCF7基因的開放讀碼框片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的載體pCAMBIA1301骨架連接，獲得植物超表達(dá)雙元載體pCAMBIA1301-OsPCF7。將構(gòu)建的超表達(dá)雙元載體pCAMBIA1301-OsPCF7用引物OsPCF7-f和OsPCF7-r擴(kuò)增進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，獲得了長833bp的DNA片段，與OsPCF7基因的開放讀碼框片段大小一致。同時，將構(gòu)建的超表達(dá)雙元載體pCAMBIA1301-OsPCF7用NcoI和BstEII進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示。酶切后產(chǎn)物長分別為9771bp和813bp，分別與載體pCAMBIA1301骨架片段和水稻OsPCF7基因的開放讀碼框片段大小一致，表明水稻OsPCF7基因成功連接于pCAMBIA1301骨架上，OsPCF7基因植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-OsPCF7的結(jié)構(gòu)如圖4所示。然后將陽性重組子委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果顯示，構(gòu)建的植物超表達(dá)雙元載體pCAMBIA1301-OsPCF7序列正確，其開放讀碼框序列如SEQIDNo.3所示。實(shí)施例3、水稻PCF7基因農(nóng)桿菌工程菌株的制備將超表達(dá)雙元載體pCAMBIA1301-OsPCF7采用液氮冷激法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGL0感受態(tài)細(xì)胞，涂布于YEB固體培養(yǎng)基(含有1.5％(w/w)的瓊脂、50mg/L的卡那霉素(Kan)、500mg/L的鏈霉素(Sm)和50mg/L的利福平(Rif))，pH7.0)上，在28±2℃、黑暗條件下培養(yǎng)2天，挑取單菌落，用YEB液體培養(yǎng)基(含有50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，pH7.0)培養(yǎng)2天，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，陽性重組子即為水稻OsPCF7基因農(nóng)桿菌工程菌株，-80℃冷凍保存，備用。實(shí)施例4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻OsPCF7基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻與鑒定將剝?nèi)ネ鈿さ闹谢?1種子在NBD2愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，待長出愈傷后，選取呈球形，顏色亮黃的愈傷組織轉(zhuǎn)入NBD2愈傷繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。一次繼代時間為20d左右。繼代兩次后選取緊實(shí)、呈球形或片狀、顏色亮黃、直徑為10μm左右大小的愈傷浸入上述OsPCF7基因農(nóng)桿菌工程菌株的AAM懸液中共培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化植株的再生和培養(yǎng)按文獻(xiàn)方法進(jìn)行(HuTZ.OsLEA3,aLateembryogenesisabundantproteingenefromrice,conferstolerancetowaterdeficitandsaltstresstotransgenicrice.RussJPlantPhysiol.2008,55:530-537)。PCR檢測轉(zhuǎn)基因水稻中潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPT)的存在：分別取不同株系的轉(zhuǎn)基因水稻植株及非轉(zhuǎn)基因水稻植株，提取基因組DNA，然后以所得基因組DNA為模板，以HPT-f(SEQIDNo.4)和HPT-r(SEQIDNo.5)為特異引物進(jìn)行PCR檢測，篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株。PCR擴(kuò)增體系如前所述。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性2min；然后94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)；最后72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示不同株系轉(zhuǎn)基因陽性植株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物都在1026bp的特異電泳條帶，而非轉(zhuǎn)基因植株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在相應(yīng)位置沒有出現(xiàn)電泳條帶，表明轉(zhuǎn)基因陽性植株中OsPCF7基因成功整合入水稻植株中。實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因陽性植株與非轉(zhuǎn)基因植株分蘗情況比較分別將轉(zhuǎn)基因陽性植株株系L1、L2、L3、L4號和非轉(zhuǎn)基因水稻幼苗植株種植于田中，觀察植株的狀態(tài)，結(jié)果如圖6和表1所示。表1、轉(zhuǎn)基因陽性植株與非轉(zhuǎn)基因植株的分蘗數(shù)和抽穗數(shù)比較辣椒植株平均分蘗數(shù)量平均抽穗數(shù)量非轉(zhuǎn)基因植株25.422.6轉(zhuǎn)基因陽性植株株系L136.234.2轉(zhuǎn)基因陽性植株株系L244.744.3轉(zhuǎn)基因陽性植株株系L335.834.0轉(zhuǎn)基因陽性植株株系L436.034.5在同一生長時期，轉(zhuǎn)基因陽性植株株系L1、L2、L3、L4號的分蘗數(shù)量較非轉(zhuǎn)基因植株多。轉(zhuǎn)基因陽性植株株系L1、L2、L3、L4號最終分蘗數(shù)和抽穗數(shù)也高于非轉(zhuǎn)基因植株(表1)。上述結(jié)果表明OsPCF7提高水稻分蘗的作用，可以用于培育高分蘗水稻品種。最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3