本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術領域，更具體地，涉及新鞘脂菌Novosphingobium sp.1MP25菌株在降解多環(huán)芳烴中的應用。

背景技術：

多環(huán)芳烴是指兩個或兩個以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的多元環(huán)化合物，是有機物不完全燃燒或高溫裂解的副產物。廣泛存在于原油、煤炭等生物燃料中，具有潛在的致畸性、致癌性。而且，多環(huán)芳烴的結構穩(wěn)定，半衰期長，一般很難被生物利用。

多環(huán)芳烴在自然界中的有多種可能的去除途徑，例如光氧化、化學氧化、生物積累、土壤吸附和微生物降解等。已有大量研究證明微生物降解是去除環(huán)境中多環(huán)芳烴的最主要途徑。微生物長期生活在多環(huán)芳烴污染的土壤中，經過自然馴化，逐漸進化出以多環(huán)芳烴作為碳源獲取能源的能力，得以生長和繁殖，從而減少多環(huán)芳烴對生態(tài)環(huán)境的影響。

在環(huán)境中，烷基化的多環(huán)芳烴的含量占總多環(huán)芳烴的很大一部分，特別是在原油污染嚴重的土壤和水體中。而烷基化多環(huán)芳烴因其烷基化基團的存在，使其更加難以被微生物利用，因此，具有降解烷基化多環(huán)芳烴能力的新菌種是非常具有研究價值和開發(fā)潛力的。

新鞘脂菌屬的菌種已被報道具有降解多種有機污染物的能力，如母體多環(huán)芳烴(參見文獻Balkwill等，1997；Gao等，2015；Yuan等，2009；Suzuki和Hiraishi，2007；Sohn等，2004；Liu等，2005)，氯乙酰胺，六六六等。但此前尚未發(fā)現該屬菌種具有降解烷基化多環(huán)芳烴的能力。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于根據現有技術中的不足，提供了新鞘脂菌(Novosphingobium sp.)1MP25菌株在降解多環(huán)芳烴中的應用。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現：

本發(fā)明提供了新鞘脂菌(Novosphingobium sp.)1MP25菌株在降解多環(huán)芳烴中的應用，以及在制備能夠降解多環(huán)芳烴的微生物制劑方面的應用。

所述新鞘脂菌1MP25菌株于2016年7月13日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，保藏編號為GDMCC No：60058，保藏地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所。

優(yōu)選地，所述多環(huán)芳烴為烷基化多環(huán)芳烴。

更優(yōu)選地，所述烷基化多環(huán)芳烴為1-甲基菲。

本發(fā)明所述新鞘脂菌1MP25菌株是革蘭氏陰性菌，在LB(Luria–Bertani)培養(yǎng)基平板上菌落呈圓形，濕潤，透明，呈黃色；透射電鏡下細胞呈桿狀，長2.0±0.4μm，寬0.8±0.2μm，有鞭毛。

本發(fā)明另外提供一種降解多環(huán)芳烴的方法，包括如下步驟：

S1：將所述新鞘脂菌1MP25菌株進行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；

S2：將S1中培養(yǎng)液離心后去上清得到菌體，用生理鹽水重懸浮成菌懸液，加入到含多環(huán)芳烴的待處理樣品中進行降解處理。

進一步優(yōu)選地，S2中的菌懸液用生理鹽水稀釋到吸光度0.5～2，再加入到待處理樣品中進行降解。

更優(yōu)選地，S2中的菌懸液用生理鹽水稀釋到吸光度為1.0，再加入到待處理樣品中進行降解。

優(yōu)選地，S2中菌懸液和待處理樣品的體積比為0.2～1：25。

更優(yōu)選地，S2中菌懸液和待處理樣品的體積比為0.5：25。

優(yōu)選地，所述待處理樣品中多環(huán)芳烴的溶度為80～120mg/L。

更優(yōu)選地，所述待處理樣品中多環(huán)芳烴的溶度為100mg/L。

優(yōu)選地，所述多環(huán)芳烴為烷基化的多環(huán)芳烴。

優(yōu)選地，步驟S1所述培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，步驟S1所述培養(yǎng)的時間為20～30h。

更優(yōu)選地，步驟S1所述培養(yǎng)的時間為24h。

優(yōu)選地，步驟S2離心所用方法為5000～8000g離心8～15min。

更優(yōu)選地，步驟S2離心所用方法為6000g離心10min。

另外，作為一種更適用于小規(guī)模降解實驗的優(yōu)選的降解多環(huán)芳烴的方法，包括如下步驟：

S1：將所述的新鞘脂菌1MP25菌株于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；

S2：將S1中培養(yǎng)液離心后去除上清，得到菌體，重懸浮于生理鹽水后制成菌懸液，加入到含多環(huán)芳烴的MS培養(yǎng)基(Mineral salts medium)中降解。

優(yōu)選地，S2中，多環(huán)芳烴在MS培養(yǎng)基中的溶度為80～120mg/L，所述S2中菌懸液按照(0.2～1)：25的體積比加入到含多環(huán)芳烴的MS培養(yǎng)基中。

優(yōu)選地，S2中，多環(huán)芳烴在MS培養(yǎng)基中的溶度為100mg/L，所述S2中菌懸液按照0.5：25的體積比加入到含多環(huán)芳烴的MS培養(yǎng)基中。

優(yōu)選地，MS培養(yǎng)基組成為：1升水中含有(NH₄)SO₄ 1.0g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，FeSO₄.7H₂O 0.01g，CaCl₂ 0.1g，0.05mol的磷酸緩沖體系。

本發(fā)明所提供的新鞘脂菌1MP25菌株可以快速降解烷基化多環(huán)芳烴1-甲基菲，14天可完全去除無碳源培養(yǎng)基中的1-甲基菲，顯示了較強的降解效果。

與現有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：

本發(fā)明提供了一株可降解多環(huán)芳烴的新鞘脂菌1MP25菌株，所述菌株能夠顯著降解烷基化多環(huán)芳烴1-甲基菲，其在14天后可以實現對1-甲基菲的完全降解，顯示出較強的烷基化多環(huán)芳烴降解能力，在生物降解原油污染嚴重的土壤和水體中等領域中具有很好的應用前景。

附圖說明

圖1為1MP25菌株的細胞透射電鏡圖。

圖2為1MP25菌株Neighbour-Joining算法系統(tǒng)進化樹圖，圖2中黑點標注的分支表示該分支在Maximum-likelihood算法中依然保守。

圖3為1MP25菌株的極性脂組分圖。

圖4為1MP25菌株對1-甲基菲的降解曲線圖。

具體實施方式

以下結合具體實施例和附圖來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規(guī)試劑、方法和設備。

除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。

實施例1新鞘脂菌1MP25菌株的分離、培養(yǎng)與鑒定

1、菌株分離與培養(yǎng)

(1)收集菌落：取新鮮土壤樣品(采集地：廣東省廣州市廣州石化廠區(qū)的廢油污染土壤)5g至50ml滅菌的2.8g/L焦磷酸鈉溶液中，在搖床中(150rpm，28℃)搖晃過夜。

(2)馴化菌群：吸取上述菌液5ml至含有1-甲基菲100mg/L的45ml MS培養(yǎng)基中，進行馴化，150rpm，28℃培養(yǎng)14天。14天后吸取0.5ml接入新的1-甲基菲MS培養(yǎng)基中，重復8次，得到菌群G8。

(3)獲得純菌株：將菌群G8涂板，得到單菌落，選取其中對1-甲基菲降解效果最好的單菌落，經過進一步涂板純化后，得到一株純菌株，命名為1MP25菌株。菌株的擴大培養(yǎng)用LB液體培養(yǎng)基，長期保存在-80℃冰箱中，保護劑為含有40％甘油的LB培養(yǎng)基。

2、菌株形態(tài)學鑒定

(1)1MP25菌株在LB平板上菌落呈圓形，濕潤，透明，黃色。

(2)革蘭氏染色：KOH-Test法，結果顯示，該菌株為革蘭氏陰性菌。

(3)透射電鏡：JEM-100CXII，日本電子株式會社。采用負染法(0.5％磷鎢酸鹽)對樣品進行處理。透射電鏡下觀察，細胞呈桿狀，長2.0±0.4μm，寬0.8±0.2μm，有鞭毛(透射電鏡圖如附圖1所示)。

3、分子鑒定

(1)首先進行16S rRNA測序：用DNA提取試劑盒提取1MP25菌株的基因組DNA后，對16S rRNA基因片段進行擴增，送到生物公司進行測序。

(2)在EzTaxon數據庫(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)中收集所有新鞘脂菌屬的菌種16S rRNA的序列，并選取一個其他屬的菌種作為參考(Rhodospirillum rubrum ATCC 11170^T)。所有的序列采用軟件CLUSTAL_X進行對齊和剪切，采用軟件MEGA 5.0構建進化樹，算法為Neighbour-joining和Maximum-likelihood算法(Bootstrap：1000replications)。

利用序列比對結果進行系統(tǒng)發(fā)育分析，進化樹見圖2。該1MP25菌株屬于新鞘脂菌屬(Novosphingobium)，并且最相近的菌種是Novosphingobium gossypii(相似度98.5％)，N.panipatense(相似度98.2％)，N.mathurense(相似度98.0％)和N.pentaromativorans(相似度96.5％)。

4、測定新鞘脂菌1MP25菌株及其相近菌種的各項生理生化指標

(1)測定方法

1)接觸酶反應和氧化酶反應：接觸酶用雙氧水反應進行驗證，氧化酶用四甲基對苯二胺反應進行驗證。

2)DNA G+C含量：采用反相液相色譜法。方法參見文獻Mesbah等，1989。

Mesbah,M.,Premachandran,U.,Whitman,W.B.(1989).Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography.Int J Syst Bacteriol 39,159-167.

3)DNA-DNA雜交：移交廣東省微生物研究所代為測定。方法參見文獻：Huss 等，1983。

Huss,V.A.R.,H.Festl,and K.H.Schleifer.(1983).Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates.Syst Appl Microbiol 4,184-192.

4)生長溫度，pH，鹽度范圍測定范圍：

溫度：5,10,15,20,25,30,35,40,45,50℃

pH：4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0

NaCl：1,2,3,4,8,12％(w/v)

5)脂肪酸：美國MIDI公司磷脂脂肪酸分析系統(tǒng)(MIDI)。

6)極性脂：提取方法參見文獻Minnikin等，1979。

Minnikin,D.E.,Collins,M.D.,Goodfellow,M.(1979).Fatty acid and polar lipid composition in the classification of Cellulomonas,Oerskovia and related taxa.J Appl Bacteriol 47 87-95.

分離方法為二維薄層色譜法，參見文獻Collins等，1980。

Collins,M.D.&Jones,D.(1980).Lipids in the classification and identification of coryneform bacteria containing peptidoglycans based on 2,4-diaminobutyric acid.J Appl Bacteriol 48,459-470.

7)呼吸醌：提取方法參見文獻Collins等，1977。

Collins,M.D.,Pirouz,T.,Goodfellow,M.&Minnikin,D.E.(1977).Distribution of menaquinones in actinomycetes and corynebacteria.J Gen Microbiol 100,221-230.

分析方法參見文獻Kroppenstedt,1982。

Kroppenstedt,R.M.(1982).Separation of bacterial menaquinones by HPLC using reverse phase(RP18)and a silver loaded ion exchanger as stationary phases.J Liq Chromatogr 5,2359-2367.

8)多胺：提取和分析方法參見文獻Scherer and Kneifel,1983。

Scherer,P.&Kneifel,H.(1983).Distribution of polyamines in methanogenic bacteria.J Bacteriol 154,1315-1322.

9)碳源利用：美國Biolog公司自動微生物鑒定系統(tǒng)。

10)酶活性：梅里埃公司API ZYM試劑條。

11)抗生素藥敏實驗：采用紙片擴散法。參見文獻Bauer等，1966。

Bauer,A.W.,W.M.M.Kirby,J.C.Sherris,M.Turck(1966).Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method.Am J Clin Pathol 36,493-496.

(2)測定結果

經過鑒定，上述新鞘脂菌1MP25菌株的各項生理生化特征描述如下：

接觸酶反應和細胞色素氧化酶反應均呈陰性。

1MP25菌株DNA G+C含量為60.2mol％。與進化樹中最親近菌種N.gossypii的DNA–DNA雜交結果為35.5％，遠低于標準值70％，證明1MP25菌株是新鞘脂菌屬中的獨立的菌種。1MP25菌株生長溫度范圍10-35℃，pH范圍為6.0-8.0，鹽度范圍為0-4％(w/v)。1MP25菌株的主要脂肪酸及其含量：C18:1ω7c(59.7％)，C16:0(11.9％)和C16:1ω7c/C16:1ω6c(10.7％)。

1MP25菌株的極性脂組分主要由雙磷脂酰甘油(DPG)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰二甲基乙醇胺(PDE)，磷脂酰乙醇胺(PE)和新鞘脂菌屬特有的神經鞘糖脂類(SGL)組成，具體見圖3所示。其中圖3中，DPG：雙磷脂酰甘油；PG：磷脂酰甘油；PDE：磷脂酰二甲基乙醇胺；PE：磷脂酰乙醇胺；SGL：新鞘脂菌屬特有的神經鞘糖脂類。PL1,PL2,PL3,PL4,PL5：未知磷脂類；L1,L2：未知脂類；AL：未知氨基脂類；APL1,APL2,APL3：未知氨基磷脂類。

1MP25菌株的呼吸醌是泛醌Q-10，主要的多胺是亞精胺。

1MP25菌株可利用以下碳源：糊精，吐溫40，D-葡萄糖，D-甘露糖，D-半乳糖，L-巖藻糖，D-水楊苷，D-麥芽糖，D-海藻糖，D-纖維二糖，龍膽二糖，D-半乳糖醛酸，半乳糖醛酸內酯，D-葡萄糖醛酸，丙三醇，N-乙酰-D-葡萄糖胺，丙酮酸甲 酯，L-乳酸，檸檬酸，α-羥基丁酸，β-羥基-D L-丁酸，α-酮-丁酸，L-乙酰乙酸，丙酸，醋酸，甘氨酰-L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，L-組氨酸。

1MP25菌株具有以下酶活性：堿性磷酸酶，亮氨酸芳胺酶，纈氨酸芳胺酶，胱氨酸芳胺酶，酸性磷酸酶，萘酚AS-BI磷酸水解酶，β-半乳糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶。

1MP25菌株對以下抗生素敏感：氨芐西林，頭孢他啶，環(huán)丙沙星，頭孢噻肟，頭孢吡肟，青霉素，哌拉西林/三唑巴坦，四環(huán)素，阿莫西林/克拉維酸，紅霉素，亞胺培南，替卡西林，甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑。

1MP25菌株對以下抗生素具有抗性，莫西沙星，左氧氟沙星，頭孢曲松，克林霉素，頭孢西丁，利奈唑胺，美羅培南，利福平，替考拉寧，萬古霉素。

1MP25與最相近四株菌種的各項生理生化特征詳細結果見表1。通過以上各項生理生化特征差異，表明1MP25菌株是新鞘脂菌屬的一株新種，定名為新鞘脂菌Novosphingobium sp.1MP25。并于2016年7月13日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，保藏編號為GDMCC No：60058。

表1為1MP25菌株及其相近菌株的生理生化特征對比

注：菌株1，1MP25；菌株2，N.gossypii JM-1396^T；菌株3，N.panipatense DSM22890^T；菌株4，N.mathurense DSM 23374^T；菌株5，N.pentaromativorans DSM17173^T。

+，陽性；-,陰性；w,弱陽性。

表中未出現的數據：

*所有菌株對以下物質的同化反應都呈現陽性：糊精，D-麥芽糖，β-羥基-D L-丁酸，醋酸，甘氨酰-L-脯氨酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸。所有菌株對以下物質的同化反應都呈現陰性：3-甲酰葡糖，D-巖藻糖，肌苷，水蘇糖，葡糖醛酰胺，粘液酸，D-葡萄糖二酸，D-乳酸甲酯，D-山梨醇，D-甘露醇，D-阿拉伯醇，肌醇，N-乙酰-β- 甘露糖醇，N-乙酰-D-半乳糖胺，N-乙酰神經氨酸，p-羥基苯乙酸，α-酮戊二酸，D-蘋果酸，γ-氨基丁酸，D-天門冬氨酸，D-絲氨酸，L-精氨酸。

*所有菌株都具有以下酶活性：堿性磷酸酶，亮氨酸芳胺酶，纈氨酸芳胺酶，酸性磷酸酶，萘酚AS-BI磷酸水解酶。所有菌株都不具有以下酶活性：脂肪酶(C14)，α-糜蛋白酶，α-甘露糖苷酶，β-巖藻糖苷酶。

*所有菌株都對以下抗生素敏感：頭孢他啶，頭孢吡肟，哌拉西林/三唑巴坦，四環(huán)素，阿莫西林/克拉維酸，紅霉素，亞胺培南，替卡西林，甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑。所有菌株都具有克林霉素抗性。

實施例2新鞘脂菌1MP25菌株降解能力的驗證

1、方法

(1)MS培養(yǎng)基：1升水中有無機鹽(NH₄)SO₄ 1.0g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，FeSO₄.7H₂O 0.01g，CaCl₂ 0.1g和磷酸緩沖體系K₂HPO₄.3H₂O 8.22g，KH₂PO₄ 1.91g，使pH穩(wěn)定在7.2。

(2)取實施例1中1MP25菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，6000g離心，去上清，加入生理鹽水震蕩清洗，重復以上步驟，去除有機物。整個步驟注意保持無菌操作。最后將菌液稀釋到吸光度1.0，取0.5ml加入到25ml含有1-甲基菲(100mg/L)的MS培養(yǎng)基中，放入28℃，150rpm的搖床中進行降解實驗。

(3)在計劃的采樣時間，將含有1-甲基菲的MS培養(yǎng)基取出，用乙酸乙酯進行液液萃取，濃縮定容后，用氣相色譜質譜聯用儀進樣，并對結果進行定量計算。

(4)設置對照實驗，其為不加入菌株的空白實驗，其他處理步驟同(1)、(2)和(3)。

2、結果如圖4所示，相比較空白實驗，本發(fā)明所提供的新鞘脂菌1MP25菌株可以快速降解烷基化多環(huán)芳烴1-甲基菲，14天可完全去除無碳源培養(yǎng)基中的1-甲基菲(100mg/L)。