本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種谷氨酸棒狀桿菌與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)，是一類好氧的革蘭氏陽性菌，主要生存于土壤中，不具有致病性。主要應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)槲⑸锇l(fā)酵，其產(chǎn)品包括氨基酸、有機(jī)酸、維生素等，在全世界范圍內(nèi)皆有廣泛應(yīng)用。目前，大部分氨基酸，包括L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸等，都可運(yùn)用谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)。

國(guó)內(nèi)的L-纈氨酸生產(chǎn)以谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵法為主，平均產(chǎn)酸可達(dá)60g/L或更高。目前，L-纈氨酸高產(chǎn)菌株主要通過傳統(tǒng)的誘變育種選育獲得，或在此基礎(chǔ)之上結(jié)合一部分基因工程的改造，但是目前尚未有報(bào)道明確描述L-纈氨酸生產(chǎn)菌株的完整的基因信息和L-纈氨酸的高效合成機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種谷氨酸棒狀桿菌。

本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供由上述谷氨酸棒狀桿菌的應(yīng)用，用于高產(chǎn)纈氨酸。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種谷氨酸棒狀桿菌，與谷氨酸棒桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 13032的基因組序列相比較，與纈氨酸合成相關(guān)的酶的氨基酸序列存在如下堿基突變：

蘇氨酸脫水酶：A95T，核苷酸序列為序列表<400>1所示序列；

乙酰羥酸合酶催化亞基：K30Q、G128S、A138V、A226S、Y252H、T362S，核苷酸序列為序列表<400>2所示序列；

乙酰羥酸合酶調(diào)控亞基：H47L，核苷酸序列為序列表<400>3所示序列；

酮酸異構(gòu)還原酶：T301A，核苷酸序列為序列表<400>4所示序列；

二羥酸脫水酶：V375E，核苷酸序列為序列表<400>5所示序列；

分支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶：Q253H；核苷酸序列為序列表<400>6所示序列；

異丙基蘋果酸合酶：E69K、G92D、I162V、R494H、G526D，核苷酸序列為序列表<400>7所示序列；

異丙基蘋果酸異構(gòu)酶大亞基：K93Q、G317S、S319T、S322N、I481L，核苷酸序列為序列表<400>8所示序列；

異丙基蘋果酸異構(gòu)酶小亞基：Y7H，核苷酸序列為序列表<400>9所示序列；

異丙基蘋果酸脫氫酶：I334V、K336R，核苷酸序列為序列表<400>10所示序列。

優(yōu)選的，上述谷氨酸棒狀桿菌，為谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)XV，保藏號(hào)CGMCC No.12152。

上述谷氨酸棒狀桿菌在制備纈氨酸方面的應(yīng)用。

優(yōu)選的，上述谷氨酸棒狀桿菌的應(yīng)用，制備纈氨酸的具體步驟如下：

(1)斜面培養(yǎng)：置于32-34℃培養(yǎng)箱，第一代活化斜面培養(yǎng)18-24h，第二代活化斜面培養(yǎng)12-16h，經(jīng)過兩代活化培養(yǎng)之后的菌種直接接種于搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，或置于4℃保存；

(2)搖瓶種子培養(yǎng)：從二代斜面上接種2-4環(huán)，置于水平旋轉(zhuǎn)搖床，32-34℃，180-200r/min，培養(yǎng)12h，培養(yǎng)過程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.7-7.2之間；

(3)二級(jí)種子培養(yǎng)：接種量為8-10％，32-34℃培養(yǎng)，溶氧維持在20-30％，培養(yǎng)過程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.7-7.2之間，培養(yǎng)至OD₆₀₀＝15-20；

(4)發(fā)酵罐發(fā)酵：接種量為10-13％，32-34℃培養(yǎng)，溶氧維持在20-30％，培養(yǎng)過程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.7-7.2之間，發(fā)酵液葡萄糖濃度維持不低于10g/L，培養(yǎng)40-50h。

優(yōu)選的，上述谷氨酸棒狀桿菌的應(yīng)用，制備纈氨酸的具體步驟如下：

(1)斜面培養(yǎng)：置于32℃培養(yǎng)箱，第一代活化斜面培養(yǎng)24h，第二代活化斜面培養(yǎng)12h，經(jīng)過兩代活化培養(yǎng)之后的菌種直接接種于搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，或置于4℃保存；

(2)搖瓶種子培養(yǎng)：從二代斜面上接種2-4環(huán)，置于水平旋轉(zhuǎn)搖床，32℃，200r/min，培養(yǎng)12h，培養(yǎng)過程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.7-7.2之間；

(3)二級(jí)種子培養(yǎng)：接種量為8-10％，32℃培養(yǎng)，溶氧維持在20-30％，培養(yǎng)過程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.7-7.2之間，培養(yǎng)至OD₆₀₀＝15-20；

(4)發(fā)酵罐發(fā)酵：接種量為10-13％，32℃培養(yǎng)，溶氧維持在20-30％，培養(yǎng)過程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.7-7.2之間，發(fā)酵液葡萄糖濃度維持不低于10g/L，培養(yǎng)40-50h。

優(yōu)選的，上述谷氨酸棒狀桿菌的應(yīng)用，所述制備纈氨酸的過程中使用培養(yǎng)基具體組成如下：

活化斜面培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，瓊脂條20，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

搖瓶種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆餅粉水解液20，玉米漿20，NaCl 5，MgSO₄·7H₂O 2，KH₂PO₄·12H₂O 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，亮氨酸0.1，異亮氨酸0.1，苯酚紅溶液(0.4g/L)20mL，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

二級(jí)種子培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆餅粉水解液20，玉米漿20，NaCl 5，MgSO₄·7H₂O 2，KH₂PO₄·12H₂O 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，亮氨酸0.1，異亮氨酸0.1，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖60，豆餅粉水解液25，玉米漿40，MgSO₄·7H₂O 2，KH₂PO₄·12H₂O 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，V_B1 0.01，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水。

上述谷氨酸棒狀桿菌的應(yīng)用中所述谷氨酸棒桿菌XV經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵液中平均可檢測(cè)到纈氨酸80g/L。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明所提供谷氨酸棒桿菌是利用傳統(tǒng)育種手段中的化學(xué)誘變法成功篩選到的一株高效的纈氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌XV株，該菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵液中平均可檢測(cè)到纈氨酸30g/L，較原始菌株的0.3g/L，進(jìn)步顯著，經(jīng)30L發(fā)酵罐44-50h發(fā)酵后，發(fā)酵液中平均可檢測(cè)到纈氨酸80g/L；對(duì)該谷氨酸棒桿菌XV株進(jìn)行全基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行基因組學(xué)分析，確認(rèn)誘變之后的菌株的纈氨酸產(chǎn)量明顯提高，其最主要原因就是XV株的纈氨酸合成途徑中相關(guān)基因的堿基突變所導(dǎo)致，為纈氨酸合成及基因研究提供了新的方向與途徑。

附圖說明

圖1是實(shí)施例3中纈氨酸HPLC檢測(cè)結(jié)果圖；

圖2是實(shí)施例4中纈氨酸HPLC檢測(cè)結(jié)果圖；

圖3是實(shí)施例5中纈氨酸HPLC檢測(cè)結(jié)果圖。

保藏信息

分類名詞：谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum

保藏單位名稱：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)

保藏日期：2016年03月01日

保藏號(hào)：CGMCC No.12152

具體實(shí)施方式

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

谷氨酸棒桿菌的化學(xué)誘變

(1)以土壤中分離得到的谷氨酸棒桿菌作為出發(fā)菌株，首先在完全培養(yǎng)基斜面上活化，32℃培養(yǎng)12小時(shí)；

(2)從斜面接種于液體種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B，32℃培養(yǎng)12小時(shí)；

(3)用生理鹽水對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行洗滌，重復(fù)一次后，用pH為7.0的磷酸緩沖液重懸菌體，制成10⁷-10⁸細(xì)胞/mL的菌懸液；

(4)取5-10mL菌懸液，加入到無菌試管中，再加入1％(V/V)硫酸二乙酯，試管用棉塞封口，震蕩30-40min；

(5)用適量無菌水稀釋，涂布于含有磺胺胍、L-纈氨酸結(jié)構(gòu)類似物的抗性篩選培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)，待生長(zhǎng)出單菌落；

(6)初篩方式：?jiǎn)尉淅?6孔板培養(yǎng)，以紙層析檢測(cè)L-纈氨酸產(chǎn)量；

(7)復(fù)篩方式：在搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)物用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例2

谷氨酸棒桿菌XV的基因組測(cè)序

(1)基因組的提?。菏褂肞ROMEGA公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒Genomic DNA Purification Kit A1120，利用核酸分析儀檢測(cè)，保證基因組DNA的質(zhì)量符合測(cè)序需要；

(2)利用三代測(cè)序平臺(tái)PacBio RS II對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序；

(3)利用PacBio公司提供的裝軟件對(duì)基因組進(jìn)行組裝，并使用相關(guān)軟件進(jìn)行常規(guī)的比較基因組分析。在基因組序列的基礎(chǔ)上，通過對(duì)纈氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌XV與谷氨酸棒桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 13032的基因組序列相比較，發(fā)現(xiàn)其纈氨酸合成相關(guān)基因序列中存在較多堿基突變，堿基突變導(dǎo)致各基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列存在以下改變(采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示谷氨酸棒桿菌XV相較于標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 13032(Genebank：NC_003450)在相同的酶上發(fā)生的氨基酸突變，突變前后的各基因序列所包含的堿基數(shù)均與標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 13032一致)：

蘇氨酸脫水酶：A95T；核苷酸序列為序列表<400>1所示序列。

乙酰羥酸合酶催化亞基：K30Q、G128S、A138V、A226S、Y252H、T362S；核苷酸序列為序列表<400>2所示序列。

乙酰羥酸合酶調(diào)控亞基：H47L；核苷酸序列為序列表<400>3所示序列。

酮酸異構(gòu)還原酶：T301A；核苷酸序列為序列表<400>4所示序列。

二羥酸脫水酶：V375E；核苷酸序列為序列表<400>5所示序列。

分支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶：Q253H；核苷酸序列為序列表<400>6所示序列。

異丙基蘋果酸合酶：E69K、G92D、I162V、R494H、G526D；核苷酸序列為序列表<400>7所示序列。

異丙基蘋果酸異構(gòu)酶大亞基：K93Q、G317S、S319T、S322N、I481L；核苷酸序列為序列表<400>8所示序列。

異丙基蘋果酸異構(gòu)酶小亞基：Y7H；核苷酸序列為序列表<400>9所示序列。

異丙基蘋果酸脫氫酶：I334V、K336R；核苷酸序列為序列表<400>10所示序列。

實(shí)施例3

基因突變前后菌株纈氨酸合成能力比較

(1)活化斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，瓊脂條20，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

(2)搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆餅粉水解液20，玉米漿20，NaCl 5，MgSO₄·7H₂O 2，KH₂PO₄·12H₂O 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，亮氨酸0.1，異亮氨酸0.1，苯酚紅溶液(0.4g/L)20mL，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，豆餅粉水解液25，玉米漿40，MgSO₄·7H₂O 2，KH₂PO₄·12H₂O 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，V_B1 0.01，苯酚紅溶液(0.4g/L)20mL，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

(4)斜面培養(yǎng)：置于32℃培養(yǎng)箱，第一代活化斜面培養(yǎng)24h，第二代活化斜面培養(yǎng)12h，經(jīng)過兩代活化培養(yǎng)之后的菌種可直接接種于搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可置于4℃保存；

(5)搖瓶種子培養(yǎng)：容積500mL的三角瓶，裝液量為30mL，從二代斜面上接種1-2環(huán)，置于水平旋轉(zhuǎn)搖床，32℃，200r/min，培養(yǎng)12h，培養(yǎng)過程使用氨水維持發(fā)酵液的pH在6.7到7.2之間；

(6)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：容積500mL的三角瓶，裝液量為30mL，接種量為10％，置于水平旋轉(zhuǎn)搖床，32℃，200r/min，培養(yǎng)36h，培養(yǎng)過程使用氨水維持發(fā)酵液的pH在6.7到7.2之間，發(fā)酵液葡萄糖濃度維持不低于10g/L；

(7)發(fā)酵結(jié)束后，用HPLC分析發(fā)酵液中纈氨酸濃度，標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 13032的發(fā)酵液中基本檢測(cè)不到纈氨酸，基因突變之前的菌株的發(fā)酵液中最多檢測(cè)到纈氨酸0.3g/L，突變后菌株的發(fā)酵液中平均可檢測(cè)到纈氨酸30g/L,見圖1。

實(shí)施例4

基因突變后菌株(XV株)的30L發(fā)酵罐分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

(1)活化斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，瓊脂條20，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

(2)搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆餅粉水解液20，玉米漿20，NaCl 5，MgSO₄·7H₂O 2，KH₂PO₄·12H₂O 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，亮氨酸0.1，異亮氨酸0.1，苯酚紅溶液(0.4g/L)20mL，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

(3)二級(jí)種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆餅粉水解液20，玉米漿20，NaCl 5，MgSO₄·7H₂O 2，KH₂PO₄·12H₂O 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，亮氨酸0.1，異亮氨酸0.1，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，豆餅粉水解液25，玉米漿40，MgSO₄·7H₂O 2，KH₂PO₄·12H₂O 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，V_B1 0.01，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

(5)斜面培養(yǎng)：置于32℃培養(yǎng)箱，第一代活化斜面培養(yǎng)24h，第二代活化斜面培養(yǎng)12h，經(jīng)過兩代活化培養(yǎng)之后的菌種可直接接種于搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可置于4℃保存；

(6)搖瓶種子培養(yǎng)：容積1000mL的三角瓶，裝液量為100mL，從二代斜面上接種2到4環(huán)，置于水平旋轉(zhuǎn)搖床，32℃，200r/min，培養(yǎng)12h，培養(yǎng)過程使用氨水維持發(fā)酵液pH在6.7到7.2之間；

(7)二級(jí)種子培養(yǎng)：采用5L發(fā)酵罐，裝液量為3L，接種量為8％，32℃培養(yǎng)，溶氧維持在20-30％，培養(yǎng)過程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.7-7.2之間，培養(yǎng)周期在12小時(shí)，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為600納米處檢測(cè)吸光度為16；

(8)30L發(fā)酵罐分批發(fā)酵：裝液量為16L，接種量為10％，32℃培養(yǎng)，發(fā)酵過程的溶氧控制在20％到30％之間，培養(yǎng)過程使用氨水維持發(fā)酵液pH在6.7到7.2之間，發(fā)酵液葡萄糖濃度維持不低于10g/L，發(fā)酵周期為40小時(shí)；

(9)發(fā)酵結(jié)束后，用HPLC分析發(fā)酵液中纈氨酸濃度，可檢測(cè)到纈氨酸67g/L，見圖2。

實(shí)施例5

基因突變后菌株(XV株)的30L發(fā)酵罐分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

(1)活化斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，瓊脂條20，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

(2)搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆餅粉水解液20，玉米漿20，NaCl 5，MgSO₄·7H₂O 2，KH₂PO₄·12H₂O 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，亮氨酸0.1，異亮氨酸0.1，苯酚紅溶液(0.4g/L)20mL，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

(3)二級(jí)種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆餅粉水解液20，玉米漿20，NaCl 5，MgSO₄·7H₂O 2，KH₂PO₄·12H₂O 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，亮氨酸0.1，異亮氨酸0.1，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，豆餅粉水解液25，玉米漿40，MgSO₄·7H₂O 2，KH₂PO₄·12H₂O 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，V_B1 0.01，pH 6.7-7.2，其余為蒸餾水；

(4)斜面培養(yǎng)：置于32℃培養(yǎng)箱，第一代活化斜面培養(yǎng)24h，第二代活化斜面培養(yǎng)12h，經(jīng)過兩代活化培養(yǎng)之后的菌種可直接接種于搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可置于4℃保存；

(5)搖瓶種子培養(yǎng)：容積1000mL的三角瓶，裝液量為100mL，從二代斜面上接種2到4環(huán)，置于水平旋轉(zhuǎn)搖床，32℃，200r/min，培養(yǎng)12h，培養(yǎng)過程使用氨水維持發(fā)酵液pH在6.7到7.2之間；

(6)二級(jí)種子培養(yǎng)：采用5L發(fā)酵罐，裝液量為3L，接種量為10％，32℃培養(yǎng)，溶氧維持在20-30％，培養(yǎng)過程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.7-7.2之間，培養(yǎng)周期在16小時(shí)，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為600納米處檢測(cè)吸光度到20；

(7)30L發(fā)酵罐分批發(fā)酵：裝液量為16L，接種量為13％，32℃培養(yǎng)，發(fā)酵過程的溶氧控制在20％到30％之間，培養(yǎng)過程使用氨水維持發(fā)酵液pH在6.7到7.2之間，發(fā)酵液葡萄糖濃度維持不低于10g/L，發(fā)酵周期為50小時(shí)；

(8)發(fā)酵結(jié)束后，用HPLC分析發(fā)酵液中纈氨酸濃度，可檢測(cè)到纈氨酸80g/L，見圖3。

上述參照具體實(shí)施方式對(duì)該一種谷氨酸棒狀桿菌與應(yīng)用進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。