本發(fā)明涉及植物病害生物控制
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一株解淀粉芽孢桿菌JNC2及其菌劑的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：柱花草(Stylosanthesspp.)又名筆花豆(penciflower)，天然分布在中南美洲、熱帶北美洲、非洲及東南亞，是全球熱帶地區(qū)栽培面積最大應(yīng)用最廣泛的優(yōu)良豆科牧草，具有很大的發(fā)展?jié)摿ΑＶú萏烤也?Styloanthracnose)是目前嚴(yán)重影響柱花草生產(chǎn)和推廣的最主要病害，該病主要由半知菌類刺盤孢屬的膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起，有時亦可由該屬的平頭刺盤孢(C.truncatum)和菜豆刺盤孢(C.Lindemuthianum)引起。1962年，我國從馬來西亞引入柱花草，但由于受到柱花草炭疽病的危害，柱花草產(chǎn)量受到了嚴(yán)重影響。目前對柱花草炭疽病的控制以化學(xué)藥劑為主，存在病原菌抗藥性增強、防治效果不佳、環(huán)境污染等問題。其中，生防微生物在克服植物病害的抗藥性、減少化學(xué)殺菌劑對環(huán)境的污染、生態(tài)破壞及農(nóng)副產(chǎn)品中化學(xué)農(nóng)藥殘留方面具有獨特的優(yōu)勢，尤其是生防菌的次生代謝產(chǎn)物用于制備生物農(nóng)藥，具有無污染、無殘留、不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性、與環(huán)境相容性高、對人畜安全等特點，已成為無公害綠色農(nóng)藥的主體和未來農(nóng)藥的發(fā)展方向。目前還未看到能夠防治柱花草炭疽病的解淀粉芽孢桿菌及其相關(guān)菌劑制備方法的研究報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明第一方面提供了一株解淀粉芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.11514。第二方面，一種解淀粉芽孢桿菌菌劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌。第三方面，一種解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括以下步驟：將權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌菌株接種于LB培養(yǎng)基平板，在34℃恒溫培養(yǎng)24h，得到活化的解淀粉芽孢桿菌菌株單菌落，然后挑取單菌落接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，在溫度為34℃、轉(zhuǎn)速為200～240rpm條件下振蕩培養(yǎng)24～29h獲得種子液，按7～9％的接種量將種子液接入優(yōu)化培養(yǎng)基中，在26～40℃，200～240rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)60～84h獲得菌劑發(fā)酵液，所述優(yōu)化培養(yǎng)基包括：木糖10～40g/L，蛋白胨4～16g/L，酵母粉4～16g/L，氯化銨2～8g/L，硫酸鎂0.5～2g/L。優(yōu)選地，將解淀粉芽孢桿菌菌株單菌落接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，在34℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)24h獲得種子液，按7％的接種量將種子液接入優(yōu)化培養(yǎng)基中，在34℃，200rpm下?lián)u床培養(yǎng)72h獲得菌劑發(fā)酵液，所述優(yōu)化培養(yǎng)基包括：木糖10g/L，蛋白胨16g/L，酵母粉16g/L，氯化銨8g/L，硫酸鎂2g/L。優(yōu)選地，優(yōu)化培養(yǎng)基的pH調(diào)為5.5～9。第四方面，一種解淀粉芽孢桿菌菌劑，應(yīng)用于防治柱花草炭疽病。本發(fā)明的一株解淀粉芽孢桿菌JNC2是從堅尼草葉片上分離獲得，具有合成拮抗作用的脂肽類功能基因，可有效的拮抗柱花草炭疽病病菌。采用本發(fā)明所提供的一株解淀粉芽孢桿菌JNC2菌劑，由該菌株發(fā)酵而制得的菌劑，可用于防治柱花草炭疽病均有很好的防治效果；菌劑貯藏性質(zhì)穩(wěn)定，防治效果好，尤其是提供了本發(fā)明的優(yōu)化培養(yǎng)基及其工藝，用于培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌菌劑，發(fā)酵效果好，可大規(guī)模生產(chǎn)，工藝簡單、生產(chǎn)成本低廉。附圖說明圖1為解淀粉芽孢桿菌JNC2和柱花草炭疽病菌的對峙培養(yǎng)實驗結(jié)果；圖2為解淀粉芽孢桿菌JNC2菌落形態(tài)；圖3為解淀粉芽孢桿菌JNC2致死溫度的測定，其中A為50℃、B為60℃、C為70℃、D為80℃、E為90℃、F為99℃、G為121℃；圖4為解淀粉芽孢桿菌JNC2抗生素抗性圖，其中A為對照，B為頭孢霉素、C為紅霉素、D為鏈霉素、E為卡那霉素、F為四環(huán)素、G為氨芐青霉素、H為利福平、I為氯霉素；圖5為解淀粉芽孢桿菌JNC2脂肽類相關(guān)基因克隆電泳圖；圖6為解淀粉芽孢桿菌JNC2所產(chǎn)揮發(fā)物的抑菌活性；圖7為解淀粉芽孢桿菌JNC2的生長曲線圖；圖8為解淀粉芽孢桿菌JNC2菌劑對柱花草炭疽病菌離體葉片的拮抗效果圖。具體實施方式以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實施例一：解淀粉芽孢桿菌JNC2的篩選及其鑒定1、菌株JNC2是從我國海南省儋州市牧草種資資源圃的堅尼草植株葉片上分離到的，具體方法為：在無菌超凈工作臺上分別剪取直徑約為5mm×5mm大小的葉片組織，用75％酒精和0.1％的升汞進行表面消毒30s，無菌水清洗3次后，移植到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑取菌落形態(tài)不同的菌株，進一步劃線純化保存?zhèn)溆?；后?點接菌法將柱花草炭疽病病菌接入PDA培養(yǎng)基平板中央，生防菌接于柱花草炭疽病病菌四周，篩選出一株對柱花草炭疽病菌具有抑制作用的生防菌株，如圖1。將該菌株命名為JNC2。2、分別對菌株JNC2的形態(tài)、生化性質(zhì)及分子生物學(xué)進行鑒定，結(jié)果如下：(1)形態(tài)學(xué)觀察與鑒定：將解淀粉芽孢桿菌JNC2菌株在LB培養(yǎng)基上于28℃下培養(yǎng)2d，觀察其菌落形態(tài)，革蘭氏染色陽性，桿狀，兩端鈍平，在LB培養(yǎng)基平板上菌落呈白色，近圓形，表面濕潤，光滑，易挑起。如圖2。(2)生理生化反應(yīng)觀察：將JNC2菌株分別接種于耐鹽性、檸檬酸鹽利用、明膠液化、淀粉水解、接觸酶、甲基紅、V_P、纖維素水解、吲哚實驗等測試培養(yǎng)基中，觀察其反應(yīng)情況，說明JNC2菌株可以在甲基紅、10％NaCl、明膠液化、檸檬酸鹽、淀粉、V_P、接觸酶、酪氨酸或溶菌酶存在的條件下生長或利用。結(jié)果如表1。表1JNC2菌株的基本生物學(xué)特性氧化酶實驗-甲基紅實驗+12％NaCl-10％NaCl+吲哚實驗-明膠液化實驗+檸檬酸鹽生長實驗+淀粉水解+v-p實驗+纖維素水解-接觸酶實驗+酪氨酸水解+溶菌酶+注：“+”呈陽性反應(yīng)，可以生長或利用、“-”呈陰性反應(yīng)，不可以生長或利用。(3)分子生物學(xué)鑒定：提取菌株的基因組DNA，以細菌通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，以JNC2菌株的基因組DNA為模板，PCR擴增后經(jīng)電泳檢測，測其序列，結(jié)果如DNA序列表。3、分別對菌株JNC2的特性進行研究，結(jié)果如下：(1)菌株JNC2致死溫度的測定將JNC2菌株接入LB培養(yǎng)基，200r/min，37℃培養(yǎng)24h，然后分裝于試管中，每管10mL，分別置于溫度50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、99℃(水浴鍋溫度達不到100℃)的水浴鍋、121℃(高壓滅菌鍋)20min，然后涂平板，24h后觀察菌落生長情況。結(jié)果顯示，菌株在50～99℃均能正常生長，在121℃不能生長，表明菌株致死溫度為121℃，20min。結(jié)果如圖3。(2)菌株JNC2的抗生素抗性測定了菌株JNC2對氨芐青霉素，四環(huán)素，鏈霉素，卡那霉素，利福平，頭孢霉素及氯霉素的抗性反應(yīng)。將上述抗生素溶解在蒸餾水或乙醇中，配制成適當(dāng)濃度的溶液，過濾法滅菌后備用。將菌株JNC2接入LB培養(yǎng)基制成含菌平板，以無菌鑷子取含抗生素的紙片于平板上，置34℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后觀察菌株生長情況。結(jié)果表明JNC2菌株對上述抗生素均具有抗性，如圖4。該結(jié)果可為JNC2菌劑在大田實施時與化學(xué)藥劑協(xié)同防治柱花草炭疽病提供科學(xué)依據(jù)。(3)具有合成拮抗作用的脂肽類功能基因提取JNC2菌株的基因組DNA，參照文獻報道的引物，以JNC2DNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)方法檢測JNC2是否具有合成拮抗作用的脂肽類功能基因，PCR產(chǎn)物電泳圖結(jié)果發(fā)現(xiàn)JNC2菌株含有脂肽類抗生素ituD、mycB、tas、hag、Ipa-14的生物合成相關(guān)基因，如圖5，說明該菌株具有廣譜抗菌性，可以廣泛應(yīng)用于多種植物真菌病害的防治。(4)JNC2產(chǎn)生的揮發(fā)物對病原真菌具有拮抗作用將柱花草炭疽病病原菌菌塊(5mm)接種于含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿皿蓋，將JNC2菌液涂于含有LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿皿底，然后將接有真菌的皿蓋與涂有JNC2菌液的皿底對扣，用封口膜密封，于28℃恒溫培養(yǎng)，以培養(yǎng)皿皿底不涂布細菌發(fā)酵液的培養(yǎng)基平板為對照。結(jié)果表明，菌株JNC2所產(chǎn)揮發(fā)物質(zhì)對柱花草炭疽病病原真菌具有強烈的抑制效果，如圖6。該結(jié)果可為研制新型誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)性誘導(dǎo)劑或激發(fā)子打下基礎(chǔ)。綜上，JNC2菌株在LB培養(yǎng)基上呈白色，近圓形，光滑濕潤，半透明。在顯微鏡下觀察，菌株菌體桿狀，產(chǎn)芽孢，革蘭氏反應(yīng)為陽性。菌株JNC2部分生理生化指標(biāo)的測定依據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，JNC2菌株生理生化特征符合解淀粉芽孢桿菌。另外以解淀粉芽孢桿菌JNC2的基因組DNA為模板，以細菌16SrDNA序列通用引物作為引物，PCR擴增出的1.5kb的產(chǎn)物片段。測序結(jié)果表明序列長度為1510bp，具體見DNA序列表。因此菌株JNC2鑒定為解淀粉芽孢桿菌JNC2。本實施例提供的一株解淀粉芽孢桿菌JNC2，拉丁文名為Bacillusamyloliquefaciens，于2015年10月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱：CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號：CGMCCNo.11514。實施例二：解淀粉芽孢桿菌JNC2菌劑的制備方法其發(fā)酵培養(yǎng)方法包括以下步驟：將實施例一的解淀粉芽孢桿菌JNC2接種于LB培養(yǎng)基平板，在34℃恒溫培養(yǎng)24h，得到活化的JNC2菌株單菌落，然后挑取單菌落接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，34℃、200～240rpm條件下振蕩培養(yǎng)24～29h，即得JNC2菌株種子液。按7～9％的接種量將解淀粉芽孢桿菌JNC2種子液接入優(yōu)化培養(yǎng)基中，在26～40℃，200～240rpm下?lián)u床培養(yǎng)60～84h獲得菌劑發(fā)酵液。其中，優(yōu)化培養(yǎng)基包括：木糖10～40g/L，蛋白胨4～16g/L，酵母粉4～16g/L，氯化銨2～8g/L，硫酸鎂0.5～2g/L。其中，通過研究實驗培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分獲得最佳工藝參數(shù)，包括接種時間、培養(yǎng)基成分及其組分配比、碳源、氮源、最佳金屬離子、菌株生長溫度、pH值、通氣量、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間和接種量。1、接種時間將解淀粉芽孢桿菌JNC2在LB平板培養(yǎng)基上劃線活化培養(yǎng)12h，得到活化的JNC2菌株單菌落，然后挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)12h即得JNC2種子液，按1％的接種量將解淀粉芽孢桿菌JNC2種子液接入LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)，每隔1h取樣測定OD600，連續(xù)測定36h。繪制生長曲線圖以確定種子液的最佳接種時間如圖7。由圖7可知，0～24h時菌株處于對數(shù)生長期，菌體生長力旺盛，菌體濃度迅速增大，這個時期JNC2菌株以幾何級數(shù)極快增長，24h時OD600最大值為2.558，24～29h期間JNC2菌液進入穩(wěn)定期，生長菌群總數(shù)處于平坦階段，OD600值在2.558左右，在29h后，OD600值開始下滑，選擇培養(yǎng)24～29h后的JNC2菌液作為接種液。2、JNC2菌株生長培養(yǎng)基在LB平板培養(yǎng)基上劃線活化培養(yǎng)24h，取1環(huán)，置于LB培養(yǎng)液中200rpm振蕩培養(yǎng)24h，按照1％的接種量分別接入以下幾種培養(yǎng)基中：NA培養(yǎng)基(葡糖糖10g，蛋白胨5g，酵母粉1g，牛肉膏3g，蒸餾水1000mL)，LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL)，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(葡糖糖10g，蛋白胨10g，KH2PO40.2g，MgSO40.2g，蒸餾水1000mL)，NYBD培養(yǎng)基(牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL)，初始發(fā)酵培養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL)和BPY培養(yǎng)基(蛋白胨5g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，蒸餾水1000mL)，37℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)24h，以菌體OD600值為指標(biāo)檢測JNC2的最適培養(yǎng)基。結(jié)果表明，JNC2菌株在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基上生長最佳，OD600達到0.717。在NYBD培養(yǎng)基上生長最差，OD600僅為0.257，差異達到極顯著，見表2。表2JNC2菌株在不同培養(yǎng)基條件下的生長情況3、優(yōu)化培養(yǎng)基以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(葡糖糖10g，蛋白胨10g，KH2PO40.2g，MgSO40.2g，蒸餾水1000mL)為基礎(chǔ)，通過單因子(碳源、氮源和金屬離子)和正交試驗篩選JNC2的優(yōu)選培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。(1)培養(yǎng)碳源在LB培養(yǎng)基中原有成分不變的前提下，以1％的木糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、淀粉、葡萄糖、山梨醇為碳源，于37℃，200rpm的搖床培養(yǎng)24h，測定其OD600。結(jié)果表明，各種碳源差異顯著，其中，木糖為碳源時，OD值最大，為0.537，其次是淀粉，依次是麥芽糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇，可溶性淀粉的OD值最小，僅為0.246(見表3)。因此，優(yōu)先選用木糖為優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源。表3JNC2菌株在不同C源條件下的生長情況(2)培養(yǎng)氮源在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基上分別用1％酵母浸出粉、牛肉膏、麩皮、尿素、硝酸銨、氯化銨、酵母粉：胰蛋白胨為1:1、酵母粉：胰蛋白胨：氯化銨為2:2:1、酵母粉：胰蛋白胨：硝酸銨為2:2:1等10種氮源，替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，于37℃，200rpm的搖床培養(yǎng)24h，測定其OD600。結(jié)果表明選用酵母粉：胰蛋白胨：氯化銨為2:2:1作為氮源時，其JNC2的菌體濃度最高，OD600達到0.367，當(dāng)?shù)礊槟蛩亍⑾跛徜@和氯化銨時，JNC2不能生長，其OD600均為0，且10種氮源間差異顯著。因此優(yōu)先選用酵母浸出粉：胰蛋白胨：氯化銨為2:2:1(質(zhì)量比)作為優(yōu)化培養(yǎng)基的氮源。表4JNC2菌株在不同N源條件下的生長情況(3)金屬離子在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基上分別按0.1％(m/V)含量添加KH2PO4、FeSO4、ZnSO4、NaCl、MnSO4、MgSO4、CaCl2以及不添加無機鹽離子的空白對照，替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的KH2PO4和MgSO4，其他條件同上，試驗表明，當(dāng)金屬離子為硫酸鎂時，其OD600最大，為2.288，其次是氯化鈣，OD600為2.167，金屬離子為KH2PO4、FeSO4、ZnSO4、NaCl和MnSO4時，其OD值均比空白對照小，且差異顯著。優(yōu)選硫酸鎂為優(yōu)化培養(yǎng)基的金屬離子。表5JNC2菌株在不同金屬離子條件下的生長情況(4)優(yōu)化培養(yǎng)基組分根據(jù)最佳碳源、氮源和金屬離子的篩選結(jié)果，通過正交實驗設(shè)計，選用5因素4水平L16(45)正交表確定各組分的配比，以確定適宜JNC2菌株生長的組合。通過正交實驗設(shè)計對篩選到的碳源、氮源和金屬離子進行優(yōu)化，確定JNC2的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基組分為：木糖10～40g/L，蛋白胨4～16g/L，酵母粉4～16g/L，氯化銨2～8g/L，硫酸鎂0.5～2g/L。表6JNC2在不同培養(yǎng)基比例下的生長情況4、培養(yǎng)溫度按1％接種量將JNC2種子液接入裝有100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，分別在10℃、15℃、20℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、37℃、40℃，200rpm條件下培養(yǎng)24h，以接菌前培養(yǎng)基為空白對照，利用紫外分光光度計測定其OD600。表7結(jié)果表明，JNC2菌株在10～40℃均能生長，顯著差異，當(dāng)溫度為26～40℃，其OD600范圍為0.864～1.085，最適溫度是34℃，其OD600為1.085。表7JNC2菌株在不同溫度條件的生長情況5、培養(yǎng)溫度利用HCl和NaOH將優(yōu)化培養(yǎng)基的pH值調(diào)至4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0，按1％的接種量將JNC2種子液接入不同pH值的培養(yǎng)液中，于37℃，200rpm的搖床培養(yǎng)24h，用紫外分光光度測定OD600值。結(jié)果表明JNC2菌株在pH5.5～9時培養(yǎng)最佳，最適pH為6.0，OD600值0.620，見表8。表8JNC2菌株在不同pH的生長情況7、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速將JNC2種子液按1％接種量接入裝有100mL優(yōu)化培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，將搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置120、140、160、180、200、220和240rpm，在37℃培養(yǎng)24h，以接種前培養(yǎng)基為空白對照，用紫外分光光度計測定OD600。結(jié)果表明，JNC2菌株在轉(zhuǎn)速為200～240rpm時生長最佳，在轉(zhuǎn)速為200rpm時最適生長，OD600為0.819，結(jié)果見表9。表9JNC2菌株在不同轉(zhuǎn)速條件的生長情況8、菌株培養(yǎng)時間將JNC2種子液按1％接種量接入裝有100mL優(yōu)化培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃，200rpm培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84、96、120h，以接種前培養(yǎng)基為空白對照，用紫外分光光度計測定OD600。結(jié)果表明，JNC2菌株在培養(yǎng)72h時生長最好，OD600為0.737(結(jié)果如表10)。表10JNC2在不同培養(yǎng)時間條件的生長情況9、菌株生長最佳接種量250mL三角瓶中裝優(yōu)化培養(yǎng)基為100mL，將JNC2種子液的接種量(V/V)分別調(diào)節(jié)為1％、3％、5％、7％、9％，于37℃、200rpm條件下培養(yǎng)24h。結(jié)果表明，菌株在接種量為7～9％時，菌株生長較佳，在接種量為7％時生長最好，OD600為0.659，見表11。表11JNC2菌株在不同接種量條件的生長情況實施例三：JNC2菌株發(fā)酵液對柱花草炭疽病菌離體葉片的拮抗效果1、菌株JNC2發(fā)酵液制備將JNC2菌株接種于LB培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)24h，得到活化的JNC2菌株單菌落，然后挑取單菌落接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，34℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)24h即得JNC2種子液，按7％的接種量將解淀粉芽孢桿菌JNC2種子液接入優(yōu)化培養(yǎng)基中，34℃，200rpm，搖床培養(yǎng)72h，取培養(yǎng)液測定其OD600＝2.5，菌液濃度過高可用無菌水稀釋備用。每片葉片噴灑2mL菌液。2、病原菌制備將保存于斜面培養(yǎng)基的柱花草炭疽病病原菌轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5d后，用5mm打孔器打孔，備用。取嫩綠柱花草葉片，用針刺法刺傷。具體處理如下：①先噴涂生防菌后病原菌(J+C)：先噴灑JNC2發(fā)酵液于柱花草葉片，待風(fēng)干后馬上接病原菌于針刺處；②先病原菌后生防菌(C+J)：先接病原菌菌餅于針刺處，后噴灑JNC2發(fā)酵液；③只接病原菌(C)；④空白(CK)，只噴清水于葉片表面；⑤僅噴曬JNC2發(fā)酵液(J)。3d后觀察結(jié)果，如圖8，按十字交叉法測病斑直徑并求出面積，按下式計算病斑抑制率，病斑抑制率(％)＝(對照病斑總面積－處理病斑總面積)/對照病斑總面積。表12JNC2發(fā)酵液對柱花草炭疽病離體葉片的拮抗作用本發(fā)明的一株解淀粉芽孢桿菌JNC2是從堅尼草葉片上分離獲得，具有合成拮抗作用的脂肽類功能基因，可有效的拮抗柱花草炭疽病病菌。采用本發(fā)明所提供的一株解淀粉芽孢桿菌JNC2菌劑，由該菌株發(fā)酵而制得的菌劑，可用于防治柱花草炭疽病均有很好的防治效果；菌劑貯藏性質(zhì)穩(wěn)定，防治效果好。不同的菌株培養(yǎng)方法差異很大，選用本發(fā)明提供的優(yōu)化培養(yǎng)基和工藝方法進行發(fā)酵用于拮抗柱花草炭疽病病菌的解淀粉芽孢桿菌JNC2菌劑，可大規(guī)模生產(chǎn)，工藝簡單、生產(chǎn)成本低廉。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明保護的范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3