本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)4-甲基苯酚的酪丁酸梭菌，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
4-甲基苯酚(p-cresol，PC)，是一種化工原料，主要用于作為制造抗氧劑2，6-二叔丁基對甲酚和橡膠防老劑的原料，也是生產(chǎn)醫(yī)藥TMP和染料可利西丁磺酸的重要基礎(chǔ)原料，還可以用于制備下游產(chǎn)品4-甲基苯甲醚、乙酸對甲酚酯、苯乙酸對甲酚酯等。目前，PC的主要合成方法是采用化學(xué)合成法，然而，化學(xué)合成法存在安全性低、不夠節(jié)能環(huán)保等問題。
在生物方面，PC主要是作為微生物代謝產(chǎn)物或其它代謝過程中的副產(chǎn)物被研究。早在上世紀(jì)七十年代，Sideny R.elsdend等人就已檢測到PC是Clostridium difficile(難辨梭菌)和Clostridium scatologenes(糞味梭菌)的代謝產(chǎn)物。徐巖團(tuán)隊檢測窖泥中的可揮發(fā)性組分后，應(yīng)用現(xiàn)代分離及風(fēng)味研究技術(shù)，確認(rèn)產(chǎn)生窖泥臭的化合物是PC。雖然已經(jīng)確定濃香型白酒中窖泥臭風(fēng)味主要來源于PC。但濃香型白酒釀造微生物體系復(fù)雜，且窖泥厭氧微生物需要較為嚴(yán)苛的分離及培養(yǎng)條件。因此關(guān)于PC的微生物來源及代謝途徑的研究還是一片空白。
目前，已發(fā)現(xiàn)兩條微生物代謝產(chǎn)PC的途徑。酪氨酸通過轉(zhuǎn)氨作用生成對羥基苯乙酸，對羥基苯乙酸在對羥基苯乙酸脫羧酶(HPAD)的作用下脫羧形成PC，且PC可以抑制其它菌的生長。PC產(chǎn)生的另一條途徑與H2的制備密切相關(guān)。
如果能篩選到一些高產(chǎn)PC的菌株，一方面能夠更好地解析微生物產(chǎn)PC的代謝途徑，為降低發(fā)酵食品(比如白酒)中的PC提供一定的理論依據(jù)，另一方面為生物清潔生產(chǎn)PC提供一定的可能。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明的第一個目的是提供一株高產(chǎn)PC的酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)RQA1。
所述酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum RQA1，已于2016年5月10日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC NO.12431。
所述Clostridium tyrobutyricum RQA1是從濃香型白酒窖泥中篩選得到的。
所述Clostridium tyrobutyricum RQA1具有如下特性：
(1)PC產(chǎn)量受硫酸亞鐵的影響，添加硫酸亞鐵后PC濃度可提高83％，PC產(chǎn)量達(dá)0.13mg/L；
(2)添加20mL·L-1乙醇能夠使PC產(chǎn)量提高40％；
(3)僅產(chǎn)生較少的乙酸、己酸、辛酸等酸類物質(zhì)，幾乎不產(chǎn)脂類、醇類物質(zhì)，風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量很低、對風(fēng)味貢獻(xiàn)小；
(4)在混菌發(fā)酵制備窖泥并用于白酒生產(chǎn)的過程中，可被其他強化接種的同屬菌株所競爭掉，而不會對白酒總體風(fēng)味產(chǎn)生不良影響；
(5)專性厭氧，菌落為圓形，細(xì)胞為桿狀(約1.5*4.5)，近端生芽孢，有鞭毛，最適溫度37℃，最適生產(chǎn)pH 6；能利用或能產(chǎn)生葡萄糖、甘露糖、木糖，不能利用或者不能產(chǎn)生乳糖、鼠李糖、山梨糖、纖維二糖。
本發(fā)明的第二個目的是提供所述酪丁酸梭菌的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用，是用于發(fā)酵生產(chǎn)PC。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵生產(chǎn)具體是：將所述酪丁酸梭菌接種于含有硫酸亞鐵或乙醇的培養(yǎng)基中，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述硫酸亞鐵的濃度為2g·L-1。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述乙醇的濃度為20mL·L-1。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述培養(yǎng)基中還含有(g·L-1)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏3，葡萄糖5，氯化鈉5，醋酸鈉3，硫酸鎂0.2，硫酸銨0.5，磷酸氫二鉀1，磷酸二氫鉀0.5。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用，是用于發(fā)酵產(chǎn)酸。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述酸為丁酸。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵產(chǎn)酸的具體條件是：將菌株按照0.1％接種量接種于培養(yǎng)基中，在37℃的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵產(chǎn)酸用的培養(yǎng)基為RCM培養(yǎng)基。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種發(fā)酵食品中異味物質(zhì)PC的控制方法，所述方法是將不產(chǎn)或者低產(chǎn)PC的菌株接種到發(fā)酵食品的生產(chǎn)過程中，通過不產(chǎn)或者低產(chǎn)PC的菌株競爭性替代原發(fā)酵食品生產(chǎn)體系中的產(chǎn)PC的菌株，進(jìn)而控制發(fā)酵食品中的異味物質(zhì)PC。
所述產(chǎn)PC的菌株，是指保藏編號為CGMCC NO.12431的酪丁酸梭菌。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述食品為白酒，不產(chǎn)或者低產(chǎn)PC的菌株是接種到窖泥中。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將不產(chǎn)或者低產(chǎn)PC的菌株接種到窖泥中，通過不產(chǎn)或者低產(chǎn)PC的菌株競爭性替代原窖泥體系中的產(chǎn)PC的菌株CGMCC NO.12431，進(jìn)而控制白酒中的異味物質(zhì)PC。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述不產(chǎn)或者低產(chǎn)PC的菌株為Lactobacillus acidipiscis JGn2，Clostridium sporogenes JGn4和/或Clostridium butyricum JGn6。
本發(fā)明的第四個目的是提供一種提高所述酪丁酸梭菌產(chǎn)PC的方法，是在發(fā)酵的培養(yǎng)基中添加硫酸亞鐵或乙醇。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述硫酸亞鐵的濃度為2g·L-1，所述乙醇的濃度為20mL·L-1。
本發(fā)明的有益效果：
(1)本發(fā)明篩選到高產(chǎn)PC的酪丁酸梭菌，一方面能夠更好地解析微生物產(chǎn)PC的代謝途徑，為降低發(fā)酵食品(比如白酒)中的PC提供一定的理論依據(jù)，另一方面為生物清潔生產(chǎn)PC提供一定的可能。
(2)本發(fā)明的Clostridium tyrobutyricum RQA1，PC產(chǎn)量達(dá)0.13mg/L；僅產(chǎn)生較少的乙酸、己酸、辛酸等酸類物質(zhì)，幾乎不產(chǎn)脂類、醇類物質(zhì)，風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量很低、對風(fēng)味貢獻(xiàn)?。辉诨炀l(fā)酵制備窖泥并用于白酒生產(chǎn)的過程中，可被其他強化接種的同屬菌株所競爭掉，而不會對白酒總體風(fēng)味產(chǎn)生不良影響。
生物材料保藏
Clostridium tyrobutyricum，分類學(xué)命名為酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum RQA1，已于2016年5月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO.12431，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
Lactobacillus acidipiscis JGn2，分類學(xué)命名為Lactobacillus acidipiscis，已于2016年5月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12432，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
Clostridium sporogenes JGn4，分類學(xué)命名為生孢梭菌Clostridium sporogenes，已于2016年5月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12433，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
Clostridium butyricum JGn6，分類學(xué)命名為丁酸梭菌Clostridium butyricum，已于2016年5月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12434，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
附圖說明
圖1：Fe2+和乙醇濃度對單菌PC產(chǎn)量的影響。
具體實施方式
實施例1：窖泥中產(chǎn)PC菌株的篩選
(1)菌株分離：將5g新鮮窖泥懸于100mL 0.9％NaCl溶液，在固體培養(yǎng)基涂布后，放于厭氧培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)3天；劃線得到單菌落后挑選單菌落于12mL液體培養(yǎng)基中，每 塊平板挑選3個平行，在37℃的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
(2)菌株培養(yǎng)后發(fā)酵液風(fēng)味的檢測：發(fā)酵液經(jīng)8000r·min-1離心10min后取上清液8mL，加3g氯化鈉飽和后，經(jīng)頂空微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術(shù)測定其中的可揮發(fā)性風(fēng)味。
GC-MS條件：
萃取條件：DVB/CAR/PBDS萃取頭萃取45min，萃取溫度為45℃。
GC條件：進(jìn)樣口溫度250℃，載氣He，流速2mL·min-1，不分流進(jìn)樣，色譜柱為CP-Wax(60m×0.25m mi.d.×0.25μm,J&W Scientific)。檢測時的升溫程序為：50℃恒溫2min，以6℃·min-1的速度升溫至230℃，保持15min。
MS條件：EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍35.00～350amu。質(zhì)譜分析用數(shù)據(jù)庫來源于NIST05a.L(Agilent公司)。
(3)菌株16S rRNA鑒定：發(fā)酵液離心后得到細(xì)胞沉淀，提取基因組，測定保守區(qū)域16S rRNA序列鑒定種屬，PCR用的引物序列為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。
按照上述方法，得到了產(chǎn)PC含量較高的菌株C.tyrobutyricum JGn11和C.tyrobutyricum RQA1，以及不產(chǎn)菌株JGn2、JGn4和低產(chǎn)PC的JGn6(0.01mg·L-1)。
其中Clostridium tyrobutyricum RQA1，已于2016年5月10日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC NO.12431。
Lactobacillus acidipiscis JGn2，保藏編號為CGMCC NO.12432；Clostridium sporogenes JGn4保藏編號為CGMCC NO.12433；Clostridium butyricum JGn6保藏編號為CGMCC NO.12434。
實施例2：Clostridium tyrobutyricum RQA1產(chǎn)PC實驗
選擇從窖泥中篩選得到的Staphylococcus aureus JGn8、C.tyrobutyricum JGn11、C.tyrobutyricum RQA1三株菌研究Fe2+和乙醇濃度對PC產(chǎn)生的影響。
對照組是采用RCM培養(yǎng)基，實驗組所用培養(yǎng)基是在RCM培養(yǎng)基中添加2g·L-1硫酸亞鐵或20mL·L-1乙醇的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中接入0.2mL活化的JGn8、JGn11或者本發(fā)明的Clostridium tyrobutyricum RQA1菌體后，于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，檢測發(fā)酵液中PC含量。
其中，RCM培養(yǎng)基即為強化梭菌培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏3，葡萄糖5，氯化鈉5，醋酸鈉3，硫酸鎂0.2，硫酸銨0.5，磷酸氫二鉀1，磷酸二氫鉀0.5。
結(jié)果如圖1所示，Staphylococcus aureus JGn8在對照組與實驗組都不產(chǎn)生PC，C. tyrobutyricum JGn11與C.tyrobutyricum RQA1對照組與實驗組均可產(chǎn)生PC。Staphylococcus aureus JGn8不產(chǎn)PC并非受Fe2+和乙醇濃度的限制。對照組中C.tyrobutyricum JGn11發(fā)酵液中PC含量略高于RQA1。添加一定濃度的Fe2+乙醇后，PC濃度有升高趨勢。培養(yǎng)基中添加2g·L-1硫酸亞鐵后，C.tyrobutyricum JGn11發(fā)酵液中PC濃度提高了50％，C.tyrobutyricum RQA1提高了83％(達(dá)到0.13mg/L)。培養(yǎng)基中添加20mL·L-1乙醇后，C.tyrobutyricum JGn11發(fā)酵液中PC濃度提高了83％，C.tyrobutyricum RQA1僅提高了40％。Fe2+和乙醇對C.tyrobutyricum JGn11和C.tyrobutyricum RQA1產(chǎn)PC能力的影響效果存在較大差異。
實施例3：Clostridium tyrobutyricum RQA1的生理生化特性
Clostridium tyrobutyricum RQA1的生理生化特性如表1所示。
表1 菌株的生理生化特性
注：a芽孢位置端生(T)或近端生(ST)；ND：不確定；+：表示微生物能利用該碳源或能產(chǎn)生該代謝物；-：表示微生物不能利用該碳源或能產(chǎn)生該代謝物。
實施例4：Clostridium tyrobutyricum RQA1產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)測定
將上述菌株按照0.1％接種量接種于RCM培養(yǎng)基中，在37℃的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。 菌株培養(yǎng)后發(fā)酵液風(fēng)味的檢測：發(fā)酵液經(jīng)8000r·min-1離心10min后取上清液8mL，加3g氯化鈉飽和后，經(jīng)頂空微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術(shù)測定其中的可揮發(fā)性風(fēng)味。
結(jié)果如表2所示，Clostridium tyrobutyricum RQA1產(chǎn)的主要風(fēng)味物質(zhì)為酸類，除丁酸外，其他酸類物質(zhì)如乙酸、己酸、辛酸的產(chǎn)量較低，而且產(chǎn)的醇類、脂類物質(zhì)極低或不產(chǎn)。由此可見，該菌株風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量低、對風(fēng)味貢獻(xiàn)小。
表2 風(fēng)味物質(zhì)含量(單位mg/L)
實施例5：控制白酒中的異味物質(zhì)PC
將不產(chǎn)PC的CGMCC NO.12432、CGMCC NO.12433和低產(chǎn)PC的CGMCC NO.12434活化后，各按照0.1％的接種量與含有Clostridium tyrobutyricum RQA1的窖泥混菌懸浮液接種于己酸菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)窖泥1天，并每隔3天再次強化接種不產(chǎn)/低產(chǎn)PC菌液(即CGMCC NO.12432、CGMCC NO.12433、CGMCC NO.12434的混合菌液，各0.1％)接兩次，得到強化后窖泥混菌微生物。隨后，在新的己酸菌培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)強化后窖泥混菌微生物9天，得到強化后的樣品。
發(fā)酵后樣品分別進(jìn)行GC-MS檢測和MiSeq基因組16S rDNA測序，以觀察強化后窖泥微生物風(fēng)味代謝以及菌群結(jié)構(gòu)變化情況。對照樣品(改造前樣品)，即為不添加本發(fā)明的CGMCC NO.12432、CGMCC NO.12433、CGMCC NO.12434的按照上述方法得到的樣品。表3為改造前后PC含量以及微生物結(jié)構(gòu)變化。
表3結(jié)果顯示，CGMCC NO.12433、CGMCC NO.12434可通過接種強化的方式替代部分原有發(fā)酵體系中的Clostridium tyrobutyricum RQA1，強化后的窖泥具有窖泥微生物自穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，然而PC含量卻降低了73.3％，顯著降低了窖泥臭。
表3 功能菌株強化前后PC含量以及微生物結(jié)構(gòu)變化
對強化前后的窖泥的主要酸類進(jìn)行檢測，結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示，強化后的窖泥的主要有機酸己酸提高到了4倍，丁酸含量提高到了3.42倍。
表4 改造前后窖泥主要有機酸濃度比較
將本方法得到的窖泥用于白酒釀造，并比較了窖泥改造前后的窖池產(chǎn)酒的主要風(fēng)味物質(zhì)，如表5所示，酯含量增加了50％左右，酸含量增加了44倍左右。
表5 改造前后窖池中產(chǎn)酒主要風(fēng)味物質(zhì)濃度比較
本發(fā)明的Clostridium tyrobutyricum RQA1，高產(chǎn)PC，而風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量低、對發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味貢獻(xiàn)小，在發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中可以被其他菌株所替代而不會導(dǎo)致食品的有益風(fēng)味物質(zhì)的喪失。
可以理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。