本發(fā)明涉及養(yǎng)殖廢水治理領(lǐng)域,具體的說是一種利用已制得的耐鹽具有硝化功能的細(xì)菌凈化海水養(yǎng)殖廢水的方法。該方法用于去除養(yǎng)殖廢水氨氮和總氮含量,為海水養(yǎng)殖廢水無機(jī)氮污染的生物修復(fù)提供理論支持,適應(yīng)于沿海養(yǎng)殖行業(yè)的推廣使用。
背景技術(shù):
海水養(yǎng)殖已有多年的發(fā)展歷史,近年來我國海產(chǎn)品的需求量日益增多,海上捕撈量已經(jīng)不足以滿足市場(chǎng)的需求,因此海水養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展,并趨于由粗養(yǎng)向精養(yǎng)過度。污染的問題也隨著產(chǎn)生,近海水域環(huán)境嚴(yán)重惡化,從而導(dǎo)致了近岸海域生態(tài)系統(tǒng)失衡,嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)安全,制約海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。海水養(yǎng)殖廢水污染主要來源于殘剩飼料、養(yǎng)殖體排泄物、各類化學(xué)藥品等,主要污染元素為氮、磷和有機(jī)物。海水養(yǎng)殖廢水具有兩個(gè)明顯的特點(diǎn),即潛在污染物的含量低、水量大,廢水分布分散。水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中,水體的氨、硝酸鹽、亞硝酸鹽等營養(yǎng)元素含量過高所造成的富營養(yǎng)化情況頻繁出現(xiàn)。氨態(tài)氮和亞硝酸鹽氮等毒性較高會(huì)對(duì)水生動(dòng)物造成嚴(yán)重影響。
目前,海水養(yǎng)殖修復(fù)技術(shù)主要包括三類:物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)。常見物理修復(fù)有底泥疏浚、換水、曝氣、篩網(wǎng)、潑撒沸石灰等方法,但這類方法常需要較高的投資和運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用,并且處理效果不徹底;化學(xué)修復(fù)主要是運(yùn)用水質(zhì)改良劑、水質(zhì)消毒劑和殺藻劑等改善養(yǎng)殖環(huán)境。但化學(xué)修復(fù)劑容易產(chǎn)生有害的次生產(chǎn)物,使得水生態(tài)系統(tǒng)健康狀況更加惡化,水產(chǎn)品品質(zhì)退化;生物修復(fù)是指生物尤其是微生物催化降解
環(huán)境污染物,減少或消除環(huán)境污染的受控或自發(fā)過程。有研究表明,由微生物引起的硝化作用是水中氮素釋放的重要機(jī)制之一。硝化細(xì)菌是一類具有硝化作用的化能自養(yǎng)細(xì)菌,是生物硝化中起主要作用的微生物,污水中硝化細(xì)菌的含量與硝化速度成正比關(guān)系。因此硝化細(xì)菌具有良好的凈化水質(zhì)的效果,可用于海水養(yǎng)殖生物修復(fù)過程。
本發(fā)明引用下述參考文獻(xiàn),所有文獻(xiàn)內(nèi)容在此全部引入并作參考:
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[3]劉衛(wèi)東,蘇浩,鄧立康.微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)科學(xué),2001,20(2):28-31.
[4]趙玉潔,謝風(fēng)行,周可.微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].可持續(xù)發(fā)展,2007,1:27-29.
[5]李正魁,濮培民,胡維平,等.固定化細(xì)菌技術(shù)及其在物理生態(tài)工程中的應(yīng)用—固定化氨循環(huán)細(xì)菌對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2001,17(4):248-252.
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[7]Madsen E L.Metermining in situ biodegradation:facts and challenges[J].Evrion Sci Technol,1991,25(10):1663-1672.
所述具有硝化功能的細(xì)菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.),命名為nitrification-HN07菌株,于2016年6月1日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心,保藏編號(hào):GDMCC NO.60043。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種耐鹽具有硝化功能的細(xì)菌處理海水養(yǎng)殖廢水的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種利用具有硝化功能的細(xì)菌凈化海水養(yǎng)殖廢水的方法,其包括下述步驟:
1)接種該細(xì)菌;
2)恒溫培養(yǎng)。
優(yōu)選地,所述接種該細(xì)菌步驟為:將已有編號(hào)為7號(hào)的細(xì)菌菌株培養(yǎng)液接種于500mL養(yǎng)殖廢水中,接種量為5mL。另取一份養(yǎng)殖廢水加入5mL無菌水作為對(duì)照。121℃下滅菌20min。
優(yōu)選地,所述恒溫培養(yǎng)步驟為:將已滅菌的培養(yǎng)液置于恒溫振蕩器培養(yǎng),條件為120r/min,30℃。
優(yōu)選地,所述方法包括下述步驟:在無菌條件下,測(cè)定樣品氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮含量,取樣時(shí)間為接種后6h,12h,24h,36h,48h;所述測(cè)定樣品氨氮、亞硝氮、硝氮含量采用的方法分別為:海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第4部分:海水分析GB 17378.4-2007(36.2)次溴酸鹽氧化法;水質(zhì)亞硝酸鹽氮的測(cè)定分光光度法GB/T 7493-1987;海洋調(diào)查規(guī)范第4部分:海水化學(xué)要素調(diào)查GB/T 12763.4-2007(11.1)鋅鎘還原法。
優(yōu)選地,一種耐鹽具有硝化功能的細(xì)菌處理海水養(yǎng)殖廢水的方法:
1)將已有編號(hào)為7號(hào)的細(xì)菌菌株培養(yǎng)液接種于500mL養(yǎng)殖廢水中,接種量為5mL。另取一瓶養(yǎng)殖廢水加入5mL無菌水作為對(duì)照。121℃下滅菌20min;
2)將上述已滅菌的培養(yǎng)液置于恒溫振蕩器培養(yǎng),條件為120r/min,30℃;
3)取樣均在無菌條件下,測(cè)定樣品氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮含量,取樣時(shí)間為接種后6h,12h,24h,36h,48h。
4)所述已有編號(hào)為7號(hào)的細(xì)菌菌株篩選自海南石斑魚高位養(yǎng)殖池池底沉積物,所述養(yǎng)殖廢水采自該石斑魚高位養(yǎng)殖池。
所述測(cè)定樣品氨氮、亞硝氮、硝氮含量采用的方法分別為:海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第4部分:海水分析GB 17378.4-2007(36.2)次溴酸鹽氧化法;水質(zhì)亞硝酸鹽氮的測(cè)定分光光度法GB/T 7493-1987;海洋調(diào)查規(guī)范第4部分:海水化學(xué)要素調(diào)查GB/T 12763.4-2007(11.1)鋅鎘還原法。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明利用耐鹽具有硝化功能的細(xì)菌修復(fù)海水養(yǎng)殖廢水無機(jī)氮污染,具有簡(jiǎn)便、無二次污染、修復(fù)效果好等特點(diǎn)。
2、本發(fā)明利用的耐鹽具有硝化功能的細(xì)菌篩選自海南石斑魚高位養(yǎng)殖池池底沉積物,即利用海水養(yǎng)殖系統(tǒng)自產(chǎn)沉污泥對(duì)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)的排放廢水進(jìn)行凈化,成本低廉,操作簡(jiǎn)單可行。且在較短時(shí)間內(nèi)(6h)實(shí)現(xiàn)廢水氨氮和總氮的有效去除,對(duì)于沿海養(yǎng)殖行業(yè)廢水治理有較好的應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1為該細(xì)菌處理下廢水氨氮去除率情況;
圖2為該細(xì)菌處理下廢水總氮含量變化情況;
圖3為該細(xì)菌處理下廢水硝酸鹽氮變化情況;
圖4為該細(xì)菌處理下廢水亞硝酸鹽變化情況。
實(shí)施例
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解的是,本發(fā)明實(shí)施例所述方法僅僅是用于說明本發(fā)明,而不是對(duì)本發(fā)明的限制,在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對(duì)本發(fā)明制備方法的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1:該細(xì)菌的制備
樣品采集自海南某石斑魚高位養(yǎng)殖池池底(具體位置為:海南省文昌市會(huì)文鎮(zhèn)馮家村正盛養(yǎng)殖場(chǎng))。
使用的主要儀器和設(shè)備有:
電子天平(CP124C),奧豪斯(上海)儀器有限公司;
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140A),上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;
立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS),上海申安醫(yī)療器械廠;
水浴恒溫振蕩器(HZS-H),常州普天儀器制造有限公司;
生物潔凈工作臺(tái)(BCM-1000A),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;
電熱恒溫水槽(HH-W600),上海浦東物理光學(xué)儀器廠;
光學(xué)顯微鏡,motic麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;
伯樂梯度PCR儀-S1000,Bio-Rad;
Dragon 5mL、1mL、200uL、200uL、5uL移液槍。
實(shí)驗(yàn)過程:
1)富集培養(yǎng):稱取兩份40g沉積物樣品,在無菌操作臺(tái)上接種于事先已滅菌,內(nèi)裝有玻璃珠的200mL亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基和硝化細(xì)菌培養(yǎng)基的三角瓶中,置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)以26℃、160r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)2天,目的是打散菌膠團(tuán),使細(xì)菌成單細(xì)胞狀態(tài)分散于水中。于無菌操作臺(tái)上分別將培養(yǎng)液接種至新的培養(yǎng)基,接種量為5%。重復(fù)此操作3次,共培養(yǎng)8天,待用;
所述培養(yǎng)基為:
亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基成分為:每升培養(yǎng)基由NH4Cl4 0.4g,K2HPO4·3H2O 8.0g,KH2PO41.5g,CH3COONa 4.4g,MgSO4·7H2O 0.1g,微量元素溶液1mL,pH為7.0-7.3。其中,微量元素:ZnSO4 2.2g,CaCl2·2H2O 5.5g,F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0g,CuSO4·5H2O 1.57g,CoCl2·6H2O 1.61g,MnCl2·4H2O 5.0g,Na2MoO4·4H2O 1.1g,Na2EDTA 63.7g,去離子水1000mL組成。pH7.0,于121℃下滅菌20min備用。
硝化細(xì)菌培養(yǎng)基成分為:每升培養(yǎng)基由NaNO2 1.0g,NaCO3 1.0g,CaCO3 1.0g,K2HPO4·3H2O 8.0g,MgSO4·7H2O 0.1g,微量元素溶液1mL,pH為7.0-7.3。其中,微量元素:ZnSO4 2.2g,CaCl2·2H2O 5.5g,F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0g,CuSO4·5H2O 1.57g,CoCl2·6H2O 1.61g,MnCl2·4H2O 5.0g,Na2MoO4·4H2O 1.1g,Na2EDTA 63.7g,去離子水1000mL組成。pH7.0,于121℃下滅菌20min備用。
2)分離純化:取上述已富集的細(xì)菌培養(yǎng)液分別劃線至亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基和硝化細(xì)菌固體培養(yǎng)基。首先用接種環(huán)挑取細(xì)菌培養(yǎng)液,然后在事先制好的平板上劃線(注意不要?jiǎng)澠骗傊砻?。劃線時(shí)要在所劃的范圍內(nèi)盡量劃滿,然后將接種環(huán)灼燒,再轉(zhuǎn)動(dòng)一定的角度連接已劃線的區(qū)域再劃另一區(qū),最后劃滿整個(gè)平皿,于30℃下恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3-4d后挑取單菌落劃線至新的平板,重復(fù)操作5次,分離出長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落;
3)菌種保存:分別配制亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌固體斜面培養(yǎng)基,首先將已配好的液體培養(yǎng)基分裝入20mL試管中,每支試管裝入1/3容量的培養(yǎng)基。分裝完畢后,需要用棉塞堵住瓶口,堵棉塞的主要目的是過濾空氣,避免污染。塞好棉塞后滅菌備用。分別將上述長(zhǎng)勢(shì)較好的10株亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌單菌落劃線至斜面培養(yǎng)基,首先用接種環(huán)挑取細(xì)菌培養(yǎng)液,然后將接種環(huán)伸進(jìn)斜面培養(yǎng)基試管,在培養(yǎng)基上輕輕劃線,接種菌體于其上。劃線時(shí)要由底部起劃較密的平行線,一直劃到頂部,以充分利用斜面面積。于30℃下恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后,放置4℃冰箱保存;
4)菌種鑒定:將上述獲得的純菌落進(jìn)行亞硝化酸細(xì)菌和硝化細(xì)菌鑒定,選出好氧硝化性能優(yōu)異的菌株。再對(duì)此細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA鑒定,即篩選出好氧硝化細(xì)菌菌株。
亞硝化細(xì)菌鑒定:取上述10株亞硝化細(xì)菌單菌落接種于亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基,另取一份亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基接種無菌水作為對(duì)照。于26℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)48h。取上述10株菌株培養(yǎng)液以及對(duì)照液于白瓷比色板上,加格里斯試劑甲液和乙液各一滴,若有亞硝酸存在則呈紅色,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,7號(hào)菌株培養(yǎng)液均呈現(xiàn)紅色,而其他菌株及對(duì)照并沒有顯色。因此,7號(hào)菌株有氨氧化作用,即硝化活性,即7號(hào)菌株為具有亞硝化功能的細(xì)菌。
硝化細(xì)菌鑒定:取上述10株硝化細(xì)菌單菌落接種于硝化細(xì)菌培養(yǎng)基,另取一份硝化細(xì)菌培養(yǎng)基接種1.0mL無菌水作為對(duì)照。于26℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)48h。分別取上述硝化細(xì)菌培養(yǎng)液10mL于試管中,首先為了去除培養(yǎng)液中的NO-,在培養(yǎng)液中加入醋酸5-8滴使之酸化,再加入數(shù)粒對(duì)氨基苯磺酸,當(dāng)停止放氣時(shí),再加入一粒對(duì)氨基苯磺酸,此過程中NO-轉(zhuǎn)化為氮?dú)庖莩觥7謩e取此培養(yǎng)液以及對(duì)照液于白瓷比色板上,逐滴加入加格里斯試劑,如不呈現(xiàn)紅色,證明亞硝酸已完全消失。再加二苯胺試劑2-4滴,如呈現(xiàn)藍(lán)色說明有硝化細(xì)菌的存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,均未出現(xiàn)藍(lán)色,證明不存在將亞硝酸氧化成硝酸的菌株,即不存在硝化細(xì)菌。
16S rDNA鑒定:其特征在于PCR擴(kuò)增程序,該程序是94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,55℃退火45s,72℃延伸90s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。根據(jù)NCBI及參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物如下:
上游引物F:(5'-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3');
下游引物R:(5'-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3')。
將編號(hào)為7號(hào)的細(xì)菌的PCR產(chǎn)物送至華大基因做測(cè)序,所測(cè)的序列長(zhǎng)度在1000bp左右,經(jīng)NCBI的BLAST對(duì)比為硝化細(xì)菌,其序列如下:
7號(hào)細(xì)菌序列
GCGGCACATAGAACAGCATCGGCAGCGTGCGGAACTCCGGATGCAACGGCAGCGCGATGCCCCATTTCTTCACGAACTGG
AAAACCGGGAGACTTCTGCGCAGCCTCGATCTTCGCATCTGGAATCCCGTTCGCCCTCGCGGCGGCGATGATCTCCGGAT
CAAACGGATCCTTGATGATGTTGCGCTGAGCCATCACCAGCTGGTCTGCGGCGACTTCGCGGTCTCCTCGATCGCATCCG
CATCGTAAAGCACGAGGCCGATATACCGGATGCGTCCGACGCAGGAGTGGAAGCACGCCGGCGGCTGGCCGCTCTCCAGA
CGCGGATAGCACAGGATGCACTTCTCGGCCTTGCCGGTCGACCAGTTGAAGTAGGTCTTCTTGTAGGGGCAGCCGGAAAC
GCACATGCGCCAGGCGCGGCAGCGTTCCTGGCTCACCAGCACAACGCCGTCCTCACCGCGCTTGTAGAGCGCGCCCTGCG
GACACGCCGCAACGCATCCCGGATTGAGGCAATGGTTGCAGATGCGCGGCAGATAGAAAAACACCGTGCTGTTGATCTCG
TTGATCTGGCGCATCTCCTCGTCGGAAGCGCCGTCGAAGTTCGGGTCGTTGTTGGCGTAAACCTGCGAACCGCCGAGGTC
GTCGTCCCAGTTCGGACCCGCCTCGATCGTGTCCATGTACTTGCCGGTCACCATCGAGATCGCCCGCGCAGTCGGCTGCT
CGTCGGCCAGCGGCGCATTGATCAGGTTCTGGTAGTCGTAGGTCCAGGGCTCGAAATAATCGTCGAGCGTCGGCAGATAG
GGGTTGTAGAAAATGTTCGTCAGCGTGCCCCACTTGCCCTGCAGCCGCAGCCGCAGGCTCTTCTGCCGCTGACCGTCAAC
CACCCAGCCGCCACGATACTTGGTCTGGTCTTCCCAACGTGTCGGGTAACCCGTACCCGGCTTGGTCTCCACGTTGTTCC
AGTACATGTACTCGGTGCCCTTGCGATCGGTCCAGATGTTCTTGCACGCGATGCTGCAGGTGTGGCAACCGAT
所述硝化細(xì)菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.),命名為nitrification-HN07菌株,于2016年6月1日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心,保藏編號(hào):GDMCC NO.60043。其如序列編號(hào)所示。
實(shí)施例2:廢水處理
廢水樣品采集在海南某石斑魚高位養(yǎng)殖池(具體位置為:海南省文昌市會(huì)文鎮(zhèn)馮家村正盛養(yǎng)殖場(chǎng))。
使用的主要儀器和設(shè)備有:
電子天平(CP124C),奧豪斯(上海)儀器有限公司;
V-1200型可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;
JPSJ-605型溶解氧儀(臺(tái)式),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140A),上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;
立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS),上海申安醫(yī)療器械廠;
生物潔凈工作臺(tái)(BCM-1000A),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;
電熱恒溫水槽(HH-W600),上海浦東物理光學(xué)儀器廠;
光學(xué)顯微鏡,motic麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司
Dragon 5mL、1mL、200uL移液槍。
實(shí)驗(yàn)過程:
1)將已有編號(hào)為7號(hào)的細(xì)菌菌株培養(yǎng)液接種于500mL養(yǎng)殖廢水中,接種量均為10mL。另取一瓶養(yǎng)殖廢水加入5mL無菌水作為對(duì)照。121℃下滅菌20min;
2)將上述已滅菌的培養(yǎng)液置于恒溫振蕩器培養(yǎng),條件為120r/min,30℃;
3)取樣均在無菌條件下,測(cè)定樣品溶解氧、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮含量,取樣時(shí)間為接種后6h,12h,24h,36h,48h。
測(cè)定樣品氨氮、亞硝氮、硝氮含量采用的方法分別為:海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第4部分:海水分析GB 17378.4-2007(36.2)次溴酸鹽氧化法;水質(zhì)亞硝酸鹽氮的測(cè)定分光光度法GB/T 7493-1987;海洋調(diào)查規(guī)范第4部分:海水化學(xué)要素調(diào)查GB/T 12763.4-2007(11.1)鋅鎘還原法。
廢水水質(zhì)如下表:
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
7號(hào)菌在48h內(nèi)氨氮去除率均為正,在6h最高,氨氮去除率為48%如圖1。
廢水總氮含量為1.996mg/L,7號(hào)菌株處理的廢水總氮呈現(xiàn)減少趨勢(shì),其處理的廢水總氮含量在5個(gè)取樣點(diǎn)均低于初始值,如圖2。
廢水硝氮含量為0.927mg/L,7號(hào)菌株處理的廢水硝氮含量在6h、12h高于初始值,而到了24、36、48h其值低于初始值,如圖3。
廢水亞硝氮含量為0.341mg/L,7號(hào)菌株處理的廢水亞硝氮含量與初始值相差不大,如圖4。其變化可忽略。
由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,7號(hào)硝化細(xì)菌有較好的去除海水養(yǎng)殖廢水中氨氮的作用,其氨氮去除率最大為48%,出現(xiàn)時(shí)間為6h。而其總氮并未增加反而減少,7號(hào)硝化細(xì)菌在第6h總氮含量相比廢水有所下降。處理過程中,廢水亞硝氮含量基本不變,硝氮先升高后降低,推測(cè)升高是由于氨氮轉(zhuǎn)化為硝氮,而降低則可能存在反硝化作用,使得硝氮以氮?dú)庑问揭莩?。可?號(hào)硝化細(xì)菌能有效去除海水養(yǎng)殖廢水中無機(jī)氮含量,有效修復(fù)海水養(yǎng)殖廢水無機(jī)氮污染。