本發(fā)明涉及環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種從海水養(yǎng)殖廢水沉積物中篩選具有硝化功能的細(xì)菌的方法。

背景技術(shù)：

近幾十年來，我國的海水養(yǎng)殖產(chǎn)量呈逐年遞增態(tài)勢，水產(chǎn)養(yǎng)殖已經(jīng)成為我國農(nóng)業(yè)的支柱性產(chǎn)業(yè)之一。最近30年里，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在全球動物性食品生產(chǎn)中增長最快，而中國對水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品的生產(chǎn)貢獻(xiàn)率最大，最近幾年，中國水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量約占世界水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量的2/3。而我國傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)已由小范圍、分散經(jīng)營向規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展。

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，水體的氨、硝酸鹽、亞硝酸鹽等營養(yǎng)元素含量過高所造成的富營養(yǎng)化情況頻繁出現(xiàn)。除了會改變水質(zhì)與生物平衡外，其中氨態(tài)氮和亞硝酸鹽氮等毒性較高會對水生動物造成嚴(yán)重影響。養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸鹽氮的去除方法主要有物理法、化學(xué)法和微生物法等，其中微生物法是一種較理想的方法，由微生物引起的硝化作用是水中氮素釋放的重要機制之一。

硝化細(xì)菌是一類具有硝化作用的化能自養(yǎng)細(xì)菌，包括亞硝化菌和硝化菌兩個生理菌群。其主要特性是亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌都是絕對好氣的自養(yǎng)菌，由于其好氧性、依附性和產(chǎn)酸性，喜歡生長在堿性的土壤中，它們不能在一般含有機質(zhì)的培養(yǎng)基中生長，生長速率低。由于硝化細(xì)菌的上述特點，在一般的污水處理系統(tǒng)中硝化細(xì)菌的含量較低。而硝化細(xì)菌是生物硝化中起主要作用的微生物,污水中硝化細(xì)菌的含量與硝化速度成正比關(guān)系。

對于硝化細(xì)菌培養(yǎng)方面的研究，國外已有此類技術(shù)專利，其中一些已經(jīng)形成工業(yè)化生產(chǎn)，但產(chǎn)品價格較昂貴，并且必須經(jīng)常性向反應(yīng)器中投加，以補充流失的硝化細(xì)菌量，并抑制其它菌種的生長。法國學(xué)者采用留有微生物的簡易發(fā)酵罐來培養(yǎng)硝化細(xì)菌，認(rèn)為在合適的條件下硝化細(xì)菌經(jīng)過5個星期的連續(xù)純培養(yǎng),其含量可達(dá)2.7×10⁹個mL^-1。Hung Yuanfang等人提出的通過投加葡萄糖和酵母膏等營養(yǎng)物，促進(jìn)硝化菌和亞硝化菌的生長，可使焦化廢水中90％的氨氮在7～14d內(nèi)轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)或硝態(tài)氮，當(dāng)硝化細(xì)菌增加到一定數(shù)量后，不需再投加營養(yǎng)物即可維持一定的硝化速率。

目前已知的硝化細(xì)菌大多是從淡水環(huán)境中分離得來，能用于海水養(yǎng)殖中水處理的報道較少。本研究從海水養(yǎng)殖廢水沉積物中進(jìn)行硝化細(xì)菌的篩選和分離，從而為海水養(yǎng)殖廢水無機氮污染的生物修復(fù)提供菌種儲備和理論支持。

本發(fā)明引用下述參考文獻(xiàn)，所有文獻(xiàn)內(nèi)容在此全部引入并作參考：

[1]劉海洋,戴志軍.中國近海污染現(xiàn)狀分析及對策[J].環(huán)境保護(hù)科學(xué),2001,27(4):6-8.

[2]全為民,沈新強.長江口及鄰近水域漁業(yè)環(huán)境質(zhì)量的現(xiàn)狀及變化趨勢分析[J].海洋漁業(yè),2004(2):524-534.

[3]閆海，林毅雄，孫建新.海水微生物菌群去除氨氮和亞硝酸氮研究[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備,2003,11(4):44-47.

[4]丁彥文,艾紅.微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報,2000 20(1):68-73.

[5]苗衛(wèi)衛(wèi),江敏.我國水產(chǎn)養(yǎng)殖對環(huán)境的影響及其可持續(xù)發(fā)展[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2007,26(增刊):319-323.

[6]崔袁園.低溫硝化細(xì)菌的篩選及應(yīng)用研究[D].哈爾濱工業(yè)大學(xué),2006:6-8.

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所述具有硝化功能的細(xì)菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，命名為nitrification-HN07菌株，于2016年6月1日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號：GDMCC NO.60043。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有硝化功能的及構(gòu)建方法。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述細(xì)菌是從海水養(yǎng)殖廢水沉積物中篩選的。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種具有硝化功能的細(xì)菌，其特征在于：所述硝化細(xì)菌為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，命名為nitrification-HN07菌株，于2016年6月1日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號：GDMCC NO.60043。

所述硝化細(xì)菌如序列編號所示。

所述硝化細(xì)菌的構(gòu)建方法，其包括下述步驟：

1)富集培養(yǎng)；

2)分離純化；

3)菌種保存；

4)菌種鑒定。

優(yōu)選地，所述富集培養(yǎng)步驟包括：取樣品分別接種于亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基和硝化細(xì)菌培養(yǎng)基中，在26℃、160r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)2天，將培養(yǎng)液接種至新的培養(yǎng)基，重復(fù)此操作3次，共培養(yǎng)8天，待用。

優(yōu)選地，所述分離純化步驟包括取已富集的細(xì)菌培養(yǎng)液分別劃線至亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌固體培養(yǎng)基，于30℃下恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3-4d后挑取單菌落劃線至新的平板，重復(fù)操作5次，分別分離出長勢較好的10株單菌落。

優(yōu)選地，所述菌種保存步驟包括分別配制亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌固體斜面培養(yǎng)基，將上述長勢較好的10株單菌落劃線至斜面培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，放置4℃冰箱保存。

優(yōu)選地，所述菌種鑒定步驟包括分別將上述獲得的亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌的純菌落進(jìn)行鑒定，選出好氧硝化性能優(yōu)異的亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌，再對此細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA鑒定，即篩選出好氧硝化細(xì)菌菌株；

所述16S rDNA鑒定方法，包括PCR擴(kuò)增程序，該程序是94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃延伸10min，根據(jù)NCBI及參考文獻(xiàn)設(shè)計引物：

上游引物F：(5'-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3')

下游引物R：(5'-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3')。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為：

亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基成分為：每升培養(yǎng)基由NH₄Cl₄ 0.4g，K₂HPO₄·3H₂O 8.0g，KH₂PO₄1.5g，CH₃COONa 4.4g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，微量元素溶液1mL，PH為7.0-7.3；其中，微量元素：ZnSO₄ 2.2g，CaCl₂·2H₂O 5.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O 1.61g，MnCl₂·4H₂O 5.0g，Na₂MoO₄·4H₂O 1.1g，Na₂EDTA 63.7g，去離子水1000mL組成；pH 7.0，于121℃下滅菌20min備用；

硝化細(xì)菌培養(yǎng)基成分為：每升培養(yǎng)基由NaNO₂ 1.0g，NaCO₃1.0g,CaCO₃ 1.0g，K₂HPO₄·3H₂O 8.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，微量元素溶液1mL，PH為7.0-7.3；其中，微量元素：ZnSO₄ 2.2g，CaCl₂·2H₂O 5.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O 1.61g，MnCl₂·4H₂O 5.0g，Na₂MoO₄·4H₂O 1.1g，Na₂EDTA 63.7g，去離子水1000mL組成；pH 7.0，于121℃下滅菌20min備用。

優(yōu)選地，所述亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌的鑒定方法為：

亞硝化細(xì)菌鑒定：取10株亞硝化細(xì)菌單菌落接種于亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，另取一份亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基接種1.0ml無菌水作為對照，于26℃振蕩器中培養(yǎng)48h，取上述10株菌株培養(yǎng)液以及對照液于白瓷比色板上，加格里斯試劑甲液和乙液各一滴，若有亞硝化存在則呈紅色；

硝化細(xì)菌鑒定：取10株硝化細(xì)菌單菌落接種于硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，另取一份硝化細(xì)菌培養(yǎng)基接種1.0mL無菌水作為對照，于26℃振蕩器中培養(yǎng)48h。分別取上述硝化細(xì)菌培養(yǎng)液10mL于試管中，首先為了去除培養(yǎng)液中的NO-，在培養(yǎng)液中加入醋酸5-8滴使之酸化，再加入數(shù)粒對氨基苯磺酸，當(dāng)停止放氣時，再加入一粒對氨基苯磺酸，此過程中NO-轉(zhuǎn)化為氮氣逸出，分別取此培養(yǎng)液以及對照液于白瓷比色板上，逐滴加入加格里斯試劑，如不呈現(xiàn)紅色，證明亞硝化已完全消失，再加二苯胺試劑2-4滴，如呈現(xiàn)藍(lán)色說明有硝化細(xì)菌的存在。

優(yōu)選地，所述格里斯試劑為A液和B液，A液為對氨基苯磺酸0.5g、稀醋酸150mL；B液為α—萘胺0.1g、蒸餾水20mL、稀醋酸150mL。所述二苯胺試劑為：A液：1.5克二苯胺(C₁₂H₁₁N)溶于100mL冰醋酸(乙酸,C₂H₄O₂)中，再加1.5mL濃硫酸，用棕色瓶保存，如冰醋酸呈結(jié)晶狀態(tài),則需加溫后待其熔化，再使用；B液：體積分?jǐn)?shù)為0.2％的乙醛溶液(C₂H₄O)，將0.1mL B液加入10mL A液中，即為二苯胺試劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

更優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種從海水養(yǎng)殖廢水沉積物中篩選具有硝化功能的細(xì)菌的方法：

1)富集培養(yǎng)：取樣品分別接種于亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基和硝化細(xì)菌培養(yǎng)基中，在26℃、160r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)2天，將培養(yǎng)液接種至新的培養(yǎng)基，重復(fù)此操作3次，共培養(yǎng)8天，待用；

2)分離純化：取上述已富集的細(xì)菌培養(yǎng)液分別劃線至亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌固體培養(yǎng)基，于30℃下恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3-4d后挑取單菌落劃線至新的平板，重復(fù)操作5次，分別分離出長勢較好的10株單菌落；

3)菌種保存：分別配制亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌固體斜面培養(yǎng)基，將上述長勢較好的10株單菌落劃線至斜面培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，放置4℃冰箱保存；

4)菌種鑒定：分別將上述獲得的亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌的純菌落進(jìn)行鑒定，選出好氧硝化性能優(yōu)異的亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌，再對此細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA鑒定，即篩選出好氧硝化細(xì)菌菌株。

所述培養(yǎng)基為：

亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基成分為：每升培養(yǎng)基由NH₄Cl₄ 0.4g，K₂HPO₄·3H₂O 8.0g，KH₂PO₄1.5g，CH₃COONa 4.4g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，微量元素溶液1mL，PH為7.0-7.3。其中，微量元素：ZnSO₄ 2.2g，CaCl₂·2H₂O 5.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O 1.61g，MnCl₂·4H₂O 5.0g，Na₂MoO₄·4H₂O 1.1g，Na₂EDTA 63.7g，去離子水1000mL組成。pH 7.0，于121℃下滅菌20min備用。

硝化細(xì)菌培養(yǎng)基成分為：每升培養(yǎng)基由NaNO₂ 1.0g，NaCO₃ 1.0g，CaCO₃1.0g，K₂HPO₄·3H₂O 8.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，微量元素溶液1mL，pH為7.0-7.3。其中，微量元素：ZnSO₄ 2.2g，CaCl₂·2H₂O 5.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O 1.61g，MnCl₂·4H₂O 5.0g，Na₂MoO₄·4H₂O 1.1g，Na₂EDTA 63.7g，去離子水1000mL組成。pH 7.0，于121℃下滅菌20min備用。

所述亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌鑒定方法為：

亞硝化細(xì)菌鑒定：取上述10株亞硝化細(xì)菌單菌落接種于亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，另取一份亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基接種1.0mL無菌水作為對照。于26℃振蕩器中培養(yǎng)48h。取上述10株菌株培養(yǎng)液以及對照液于白瓷比色板上，加格里斯試劑甲液和乙液各一滴，若有亞硝化存在則呈紅色，實驗結(jié)果表明，7號菌株培養(yǎng)液均呈現(xiàn)紅色，而其他菌株及對照并沒有顯色。因此，7號菌株均有氨氧化作用，即硝化活性，即7號菌株為具有亞硝化功能的細(xì)菌。

硝化細(xì)菌鑒定：取上述10株硝化細(xì)菌單菌落接種于硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，另取一份硝化細(xì)菌培養(yǎng)基接種1.0mL無菌水作為對照。于26℃振蕩器中培養(yǎng)48h。分別取上述硝化細(xì)菌培養(yǎng)液10mL于試管中，首先為了去除培養(yǎng)液中的NO^-，在培養(yǎng)液中加入醋酸5-8滴使之酸化，再加入數(shù)粒對氨基苯磺酸，當(dāng)停止放氣時，再加入一粒對氨基苯磺酸，此過程中NO^-轉(zhuǎn)化為氮氣逸出。分別取此培養(yǎng)液以及對照液于白瓷比色板上，逐滴加入加格里斯試劑，如不呈現(xiàn)紅色，證明亞硝化已完全消失。再加二苯胺試劑2-4滴，如呈現(xiàn)藍(lán)色說明有硝化細(xì)菌的存在。實驗結(jié)果表明，均未出現(xiàn)藍(lán)色，證明不存在將亞硝酸氧化成硝酸的菌株，即不存在硝化細(xì)菌。

所述格里斯試劑為A液和B液，A液為對氨基苯磺酸0.5g、稀醋酸150mL；B液為α—萘胺0.1g、蒸餾水20mL、稀醋酸150mL。

所述二苯胺試劑為：A液：1.5克二苯胺(C₁₂H₁₁N)溶于100mL冰醋酸(乙酸,C₂H₄O₂)中，再加1.5mL濃硫酸，用棕色瓶保存(光下分解)。如冰醋酸呈結(jié)晶狀態(tài),則需加溫后待其熔化,再使用；B液：體積分?jǐn)?shù)為0.2％的乙醛溶液(C₂H₄O)。將0.1mL B液加入10mL A液中，即為二苯胺試劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

所述16S rDNA鑒定方法，其特征在于PCR擴(kuò)增程序，該程序是94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。根據(jù)NCBI及參考文獻(xiàn)設(shè)計引物：

上游引物F：(5'-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3')

下游引物R：(5'-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3')

將編號為7號的細(xì)菌的PCR產(chǎn)物送至華大基因做測序，所測的序列長度在1000bp左右，經(jīng)NCBI的BLAST對比為硝化細(xì)菌，其序列如下：

GCGGCACATAGAACAGCATCGGCAGCGTGCGGAACTCCGGATGCAACGGCAGCGCGATGCCCCATTTCTTCACGAACTGG

AAAACCGGGAGACTTCTGCGCAGCCTCGATCTTCGCATCTGGAATCCCGTTCGCCCTCGCGGCGGCGATGATCTCCGGAT

CAAACGGATCCTTGATGATGTTGCGCTGAGCCATCACCAGCTGGTCTGCGGCGACTTCGCGGTCTCCTCGATCGCATCCG

CATCGTAAAGCACGAGGCCGATATACCGGATGCGTCCGACGCAGGAGTGGAAGCACGCCGGCGGCTGGCCGCTCTCCAGA

CGCGGATAGCACAGGATGCACTTCTCGGCCTTGCCGGTCGACCAGTTGAAGTAGGTCTTCTTGTAGGGGCAGCCGGAAAC

GCACATGCGCCAGGCGCGGCAGCGTTCCTGGCTCACCAGCACAACGCCGTCCTCACCGCGCTTGTAGAGCGCGCCCTGCG

GACACGCCGCAACGCATCCCGGATTGAGGCAATGGTTGCAGATGCGCGGCAGATAGAAAAACACCGTGCTGTTGATCTCG

TTGATCTGGCGCATCTCCTCGTCGGAAGCGCCGTCGAAGTTCGGGTCGTTGTTGGCGTAAACCTGCGAACCGCCGAGGTC

GTCGTCCCAGTTCGGACCCGCCTCGATCGTGTCCATGTACTTGCCGGTCACCATCGAGATCGCCCGCGCAGTCGGCTGCT

CGTCGGCCAGCGGCGCATTGATCAGGTTCTGGTAGTCGTAGGTCCAGGGCTCGAAATAATCGTCGAGCGTCGGCAGATAG

GGGTTGTAGAAAATGTTCGTCAGCGTGCCCCACTTGCCCTGCAGCCGCAGCCGCAGGCTCTTCTGCCGCTGACCGTCAAC

CACCCAGCCGCCACGATACTTGGTCTGGTCTTCCCAACGTGTCGGGTAACCCGTACCCGGCTTGGTCTCCACGTTGTTCC

AGTACATGTACTCGGTGCCCTTGCGATCGGTCCAGATGTTCTTGCACGCGATGCTGCAGGTGTGGCAACCGAT

本發(fā)明所具有的優(yōu)點：

1、采用本發(fā)明可從海水養(yǎng)殖廢水沉積物中分離篩選一種耐鹽具有硝化功能的細(xì)菌，具有簡便、快速、重復(fù)性好、分離菌株效果好、準(zhǔn)確可靠等特點。

2、采用本發(fā)明篩選出來的耐鹽硝化具有硝化功能的細(xì)菌可用于海水養(yǎng)殖廢水無機氮污染的生物修復(fù)。

實施例

下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實施例所述方法僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方法的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

樣品采集自海南某石斑魚高位養(yǎng)殖池池底(具體位置為：海南省文昌市會文鎮(zhèn)馮家村正盛養(yǎng)殖場)。

使用的主要儀器和設(shè)備有：

電子天平(CP124C)，奧豪斯(上海)儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140A)，上海飛越實驗儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS)，上海申安醫(yī)療器械廠；

水浴恒溫振蕩器(HZS-H),常州普天儀器制造有限公司；

生物潔凈工作臺(BCM-1000A)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

電熱恒溫水槽(HH-W600)，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；

光學(xué)顯微鏡，motic麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司；

伯樂梯度PCR儀-S1000，Bio-Rad；

Dragon 5mL、1mL、200uL、200uL、5uL移液槍。

實驗過程：

1)富集培養(yǎng)：稱取兩份40g沉積物樣品，在無菌操作臺上分別接種于事先已滅菌，內(nèi)裝有玻璃珠的200mL亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基和硝化細(xì)菌培養(yǎng)基的三角瓶中，置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)以26℃、160r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)2天，目的是打散菌膠團(tuán)，使細(xì)菌成單細(xì)胞狀態(tài)分散于水中。于無菌操作臺上分別將培養(yǎng)液接種至新的培養(yǎng)基，接種量為5％。重復(fù)此操作3次，共培養(yǎng)8天，待用；

所述培養(yǎng)基為：

亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基成分為：每升培養(yǎng)基由NH₄Cl₄ 0.4g，K₂HPO₄·3H₂O 8.0g，KH₂PO₄1.5g，CH₃COONa 4.4g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，微量元素溶液1mL，pH為7.0-7.3。其中，微量元素：ZnSO₄ 2.2g，CaCl₂·2H₂O 5.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O 1.61g，MnCl₂·4H₂O 5.0g，Na₂MoO₄·4H₂O 1.1g，Na₂EDTA 63.7g，去離子水1000mL組成。PH7.0，于115℃下滅菌20min備用。

硝化細(xì)菌培養(yǎng)基成分為：每升培養(yǎng)基由NaNO₂ 1.0g，NaCO₃ 1.0g，CaCO₃ 1.0g，K₂HPO₄·3H₂O 8.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，微量元素溶液1mL，pH為7.0-7.3。其中，微量元素：ZnSO₄ 2.2g，CaCl₂·2H₂O 5.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O 1.61g，MnCl₂·4H₂O 5.0g，Na₂MoO₄·4H₂O 1.1g，Na₂EDTA 63.7g，去離子水1000mL組成。pH7.0，于115℃下滅菌20min備用。

2)分離純化：取上述已富集的細(xì)菌培養(yǎng)液分別劃線至亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基和硝化細(xì)菌固體培養(yǎng)基。首先用接種環(huán)挑取細(xì)菌培養(yǎng)液，然后在事先制好的平板上劃線(注意不要劃破瓊脂表面)。劃線時要在所劃的范圍內(nèi)盡量劃滿，然后將接種環(huán)灼燒，再轉(zhuǎn)動一定的角度連接已劃線的區(qū)域再劃另一區(qū)，最后劃滿整個平皿，于30℃下恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3-4d后挑取單菌落劃線至新的平板，重復(fù)操作5次，分離出長勢較好的單菌落；

3)菌種保存：分別配制亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌固體斜面培養(yǎng)基，首先將已配好的液體培養(yǎng)基分裝入20mL試管中，每支試管裝入1/3容量的培養(yǎng)基。分裝完畢后，需要用棉塞堵住瓶口，堵棉塞的主要目的是過濾空氣，避免污染。塞好棉塞后滅菌備用。分別將上述長勢較好的10株亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌單菌落劃線至斜面培養(yǎng)基，首先用接種環(huán)挑取細(xì)菌培養(yǎng)液，然后將接種環(huán)伸進(jìn)斜面培養(yǎng)基試管，在培養(yǎng)基上輕輕劃線，接種菌體于其上。劃線時要由底部起劃較密的平行線，一直劃到頂部，以充分利用斜面面積。于30℃下恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，放置4℃冰箱保存；

4)菌種鑒定：將上述獲得的純菌落進(jìn)行亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌鑒定，選出好氧硝化性能優(yōu)異的菌株。再對此細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA鑒定，即篩選出好氧硝化細(xì)菌菌株。

亞硝化細(xì)菌鑒定：取上述10株亞硝化細(xì)菌單菌落接種于亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，另取一份亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基接種無菌水作為對照。于26℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)48h。取上述10株菌株培養(yǎng)液以及對照液于白瓷比色板上，加格里斯試劑甲液和乙液各一滴，若有亞硝化存在則呈紅色，實驗結(jié)果表明，7號菌株培養(yǎng)液均呈現(xiàn)紅色，而其他菌株及對照并沒有顯色。因此，7號菌株有氨氧化作用，即硝化活性。即7號菌株為亞硝化細(xì)菌。

硝化細(xì)菌鑒定：取上述10株硝化細(xì)菌單菌落接種于硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，另取一份硝化細(xì)菌培養(yǎng)基接種1.0mL無菌水作為對照。于26℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)48h。分別取上述硝化細(xì)菌培養(yǎng)液10mL于試管中，首先為了去除培養(yǎng)液中的NO^-，在培養(yǎng)液中加入醋酸5-8滴使之酸化，再加入數(shù)粒對氨基苯磺酸，當(dāng)停止放氣時，再加入一粒對氨基苯磺酸，此過程中NO^-轉(zhuǎn)化為氮氣逸出。分別取此培養(yǎng)液以及對照液于白瓷比色板上，逐滴加入加格里斯試劑，如不呈現(xiàn)紅色，證明亞硝化已完全消失。再加二苯胺試劑2-4滴，如呈現(xiàn)藍(lán)色說明有硝化細(xì)菌的存在。實驗結(jié)果表明，均未出現(xiàn)藍(lán)色，證明不存在將亞硝化氧化成硝化的菌株。即不存在硝化細(xì)菌。

16S rDNA鑒定：其特征在于PCR擴(kuò)增程序，該程序是94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。根據(jù)NCBI及參考文獻(xiàn)設(shè)計引物如下：

上游引物F：(5'-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3')；

下游引物R：(5'-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3')。

將編號為7號的細(xì)菌的PCR產(chǎn)物送至華大基因做測序，所測的序列長度在1000bp左右，經(jīng)NCBI的BLAST對比為硝化細(xì)菌，經(jīng)測試該細(xì)菌具有硝化功能。