本發(fā)明涉及一種體外多段重組酶系統(tǒng)及其在基因組裝中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)代分子生物學(xué)在研究基因表達和元件功能時，分子克隆每天都會用到。隨著研究基因數(shù)量的增加和調(diào)控元件序列獲取，通過對研究基因的快速克隆進行分析其功能的需求急劇增加。為了滿足這一需求，需要選擇一種簡單、有效、強健、快速且能與任何DNA序列都能進行高通量克隆的方法。目前，已有許多定向克隆及多片段體外組裝的方法，包括Gateway，In-fusion，Cold-fusion，T4DNApolymerase-basedLigaseIndependentCloning(LIC)，GoldenGate，GibsonAssembly等，考慮到經(jīng)濟及操作的簡易性，成功率等因素，目前，最主要的是Gateway技術(shù)，GoldenGate，基于Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的連接方法和GibsonAssembly。GibsonAssembly方案的酶系(2x，800ul)配置如下：比例試劑128ulCBARbuffer1ulExoIII20ulTaqDNAligase40ulTaqpolymerase610ulddH2O其中，CBARbuffer(4X)體系的配置如下：比例試劑20％PEG-8000600mMTris-HClpH7.540mMMgCl240mMDTT800mMdNTPs4mMNAD反應(yīng)溫度為一步等溫體系，50℃反應(yīng)15-60min分鐘。其中,Gateway技術(shù)不依賴限制性內(nèi)切酶而適用范圍廣泛，但是由于需要構(gòu)建入門載體，需要花費大量時間和財力，以及限制DNA片段數(shù)量的克隆。GoldenGate適用于多片段基因的組裝，然而，它依賴連接酶和Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，此類內(nèi)切酶長度在6～8bp之間，很容易會出現(xiàn)在需克隆的目的片段序列上；Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的連接方法需要尋找合適的酶切位點，這個需要花費較多精力以及需要相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，所花費時間較多，當片段數(shù)量多時，需要較長的周期。GibsonAssembly是使用T5外切酶、DNA聚合酶及Taq連接酶而不依賴限制性內(nèi)切酶點的多段重組方法，反應(yīng)為一步等溫法，這種簡單、有效，強健、快速且適用除正向重復(fù)以外的DNA片段的組裝方法，但是該組裝酶價格較高。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種成本低的體外多段重組酶系統(tǒng)及其在基因組裝中的應(yīng)用。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明的一個目的是提供一種體外多段重組酶系統(tǒng)，按體積百分比計，所述的體外多段重組酶系統(tǒng)包括如下配方：其中，所述的5Xpre-assemblybuffer包括如下配方：占所述的5Xpre-assemblybuffer總體積20～30％的聚乙二醇、450～550mM的三(羥甲基)氨基甲烷、45～55mM的MgCl2、45～55mM的二硫蘇糖醇、0.9～1.1mM的dNTPs。優(yōu)選地，按體積百分比計，所述的體外多段重組酶系統(tǒng)包括如下配方：其中，所述的5Xpre-assemblybuffer包括如下配方：占所述的5Xpre-assemblybuffer總體積23.75～26.25％的聚乙二醇、475～525mM的三(羥甲基)氨基甲烷、47.5～52.5mM的MgCl2、47.5～52.5mM的二硫蘇糖醇、0.95～1.05mM的dNTPs。更優(yōu)選地，按體積百分比計，所述的體外多段重組酶系統(tǒng)包括如下配方：其中，所述的5Xpre-assemblybuffer包括如下配方：占所述的5Xpre-assemblybuffer總體積24.75～25.25％的聚乙二醇、495～505mM的三(羥甲基)氨基甲烷、49.5～50.5mM的MgCl2、49.5～50.5mM的二硫蘇糖醇、0.99～1.01mM的dNTPs。優(yōu)選地，所述的聚乙二醇為聚乙二醇-8000。優(yōu)選地，所述的三(羥甲基)氨基甲烷的pH為7.4～7.6。本發(fā)明中，所述的體外多段重組酶系統(tǒng)為2X體外多段重組酶系統(tǒng)。本發(fā)明的另一個目的是提供一種如權(quán)利要求1至6中任一項所述的體外多段重組酶系統(tǒng)在基因組裝中的應(yīng)用。具體地，所述的基因組裝的制備體系包括：19～21μL的ddH2O、9.5～10.5μL的體外多段重組酶系統(tǒng)、線性化克隆載體和插入片段擴增產(chǎn)物，其中，所述的線性化克隆載體和所述的插入片段擴增產(chǎn)物的每片段最適使用量為(0.02×片段堿基對數(shù))ng。更具體地，所述的基因組裝的制備體系在冰水浴中配制。更具體地，將所述的基因組裝的制備體系在PCR儀器內(nèi)，在47.5～52.5℃下反應(yīng)5～60min。由于上述技術(shù)方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：本發(fā)明的重組酶系統(tǒng)的原料便宜易得，且無需使用NAD，使得整體成本降低，本發(fā)明的重組酶系統(tǒng)能夠一次性組裝多個DNA片段到載體上，大大縮短了組裝周期，提高了生產(chǎn)效率，使企業(yè)在合成生物學(xué)領(lǐng)域提高核心競爭力。說明書附圖圖1為基因組裝的流程圖；圖2為載體酶切后的電泳圖；圖3為擴增后的電泳圖；圖4為培養(yǎng)后的平板圖；圖5為菌檢陽性率的圖片。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。本發(fā)明中若無特別說明，原料均可市購獲得，方法為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實施例1：試驗流程1、重組酶體系的配置：5Xpre-assemblybuffer的配置，其配方如表1：表1比例試劑25％(V/V)聚乙二醇-8000(PEG-8000)500mM三(羥甲基)氨基甲烷Tris-HCl(pH7.5)50mMMgCl250mMDTT1mMdNTPs重組酶系(2X)Mix的配置，其配方如表2：2XHotfusionBuffer(400ul)表2比例試劑160ul5Xpre-assemblybuffer0.5ulT5核酸外切酶20ul高保真Taq酶220ulddH2O2.引物設(shè)計插入片段擴增引物設(shè)計通過在引物5’端引入同源重組序列，擴增產(chǎn)物之間以及擴增產(chǎn)物與線性化克隆載體之間都具有能夠相互同源重組的完全一致的序列(20bp～25bp)。以pUC57作為克隆載體為例、進行三插入片段順序拼接克隆(5’至3’按克隆順序依次為：第一片段、第二片段、第三片段)為例，引物具體設(shè)計方案如下：第一段的5’端與pUC57-Amp的EcoRⅠ酶切端有一段20～25bp一致的序列，稱為重組臂(overlaps，以下用overlaps指重組臂)，第一段3’端與第二段5’端有20～25bp一致的序列，依次類推。3.制備線性化載體選擇合適的酶切位點，并對克隆載體進行線性化，酶切后使用瓊脂糖膠回收。GC含量均勻的區(qū)域進行克隆，當載體克隆位點上下游25bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40％～60％范圍之內(nèi)時，重組效率將達到最高。注：經(jīng)選用無重復(fù)序列但GC含量高或低的區(qū)域進行陽性對照，其結(jié)果證明對重組效率無明顯影響單酶切線性化：線性化程度較差。可適當延長酶切時間以降低轉(zhuǎn)化背景。4.插入片段PCR擴增插入片段可用任意PCR酶擴增PCR擴增的反應(yīng)體系如表3中所示，PCR擴增的反應(yīng)條件如表4中所示。表3體系組分用量(μL)ddH2O355×PCRbuffer1010mMdNTP1template1primerF1primerR1S15酶1表4PCR結(jié)束后，取少量產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳以檢驗擴增產(chǎn)量和特異性，將剩余部分進行回收。5.組裝反應(yīng)體系于冰浴中進行，制備體系如表5：表5每片段最適使用量＝[0.02×片段堿基對數(shù)]ng例如，將長度為0.5kb、1kb、2kb三插入片段克隆至長度為5kb的克隆載體時，各片段最適使用量為：線性化克隆載體最適使用量：0.02×5000＝100ng0.5kb插入片段最適使用量：0.02×500＝10ng1kb插入片段最適使用量：0.02×1000＝20ng2kb插入片段最適使用量：0.02×2000＝40ng然后通過步驟4中PCR擴增所測定的每片段的濃度計算出線性化克隆載體和插入片段擴增產(chǎn)物的體積。體系配制完成后，用移液器上下吹打幾次混勻各組分，然后瞬離，避免產(chǎn)生氣泡(請勿劇烈震蕩或者渦旋混勻)。置于PCR儀內(nèi)50℃反應(yīng)5～60min。6.反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)取20μl冷卻反應(yīng)液，加入到200μl感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30min。42℃熱激90秒，冰水浴孵育2min。加入400～500μlLB培養(yǎng)基，37℃孵育10min充分復(fù)蘇。37℃搖菌45min。取100μl菌液均勻涂布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。7.菌檢用無菌槍頭或者牙簽挑選單菌落于230μl左右LB培養(yǎng)基中，放入37℃搖床1.5～2h后，取2～3μl菌液進行PCR，剩余菌檢繼續(xù)放入搖床。6h后將檢到的菌液送測2～4個，以防止假陽性克隆。實施例2：1、在pUC57-Amp為載體，酶切位點EcoRI和HindIII。其中，片段1的5’端和片段3的3’端分別與載體EcoRI酶切位點后25bp和HindIII酶切位點前25bp序列一致，片段2的5’端與片段1的3’端有25bp一致，片段2的3’端與片段3的5’段有25bp一致，片段1至3的序列參見SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3。2、反應(yīng)酶系的配置與實施例1中相同。3、線性化載體的制備用EcoRI和HindIII限制性酶切位點對pUC57載體進行酶切，其體系如下表6。表6pUC57質(zhì)粒2ngddH2OUpto50μl10X限制性內(nèi)切酶Buffer5μlEcoRI2μlHindIII2μl酶切完全后，進行瓊脂糖凝膠回收，回收后用分光光度計測定濃度。pUC57載體酶切后電泳圖如圖2。4、片段的擴增以泓迅高保真酶(S15酶)進行擴增，擴增片段為1.0kb，PCR結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳回收，回收后用分光光度計測定濃度。其電泳圖如圖3。5、反應(yīng)體系同實施例1。6、組裝反應(yīng)于冰浴中進行，制備體系如表7：表7反應(yīng)條件同實施例1。7、反應(yīng)的轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)取20μl冷卻反應(yīng)液，加入到200μl感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30min。42℃熱激90秒，冰水浴孵育2min。加入400～500μlLB培養(yǎng)基，37℃孵育10min充分復(fù)蘇。37℃搖菌45min。取100μl菌液均勻涂布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)，平板圖片見圖4。8、菌檢用無菌槍頭或者牙簽挑選單菌落于230μl左右LB培養(yǎng)基中，放入37℃搖床1.5～2h后，取2～3μl菌液進行PCR，剩余菌檢繼續(xù)放入搖床。6h后將檢到的菌液送測2～4個，以防止假陽性克隆。圖5為菌檢陽性率，三段組裝陽線概率30/32。實施例3基本上與實施例2相同，不同之處在于反應(yīng)酶系，實施例3的重組酶體系的配置：5Xpre-assemblybuffer的配置，其配方如表8：表8重組酶系(2X)Mix的配置，其配方如表9：2XHotfusionBuffer(400ul)表9比例試劑160ul5Xpre-assemblybuffer0.4ulT5核酸外切酶18ul高保真Taq酶222ulddH2O實施例3的三段組裝陽線概率為27/32。實施例4基本上與實施例2相同，不同之處在于反應(yīng)酶系，實施例4的重組酶體系的配置：5Xpre-assemblybuffer的配置，其配方如表10：表10比例試劑20％(V/V)聚乙二醇-8000(PEG-8000)450mM三(羥甲基)氨基甲烷Tris-HCl(pH7.5)55mMMgCl255mMDTT1mMdNTPs重組酶系(2X)Mix的配置，其配方如表11：2XHotfusionBuffer(400ul)表11實施例4的三段組裝陽線概率為27/32。以上對本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍，且本發(fā)明不限于上述的實施例，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3