本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是上世紀(jì)80年代初期發(fā)展起來的一種新型的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，它既具有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡易、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點，還具有原核生物表達(dá)系統(tǒng)不具有的對外源蛋白的修飾如糖基化、蛋白磷酸化等特點。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點是：(1)具有醇氧化酶aoxl基因啟動子，是目前最強、調(diào)控機理最嚴(yán)格的啟動子之一；(2)表達(dá)效率高，其表達(dá)的外源蛋白可占總表達(dá)蛋白的90％以上，有利于目的蛋白的分離純化；(3)在簡單合成培養(yǎng)基中可實現(xiàn)高密度培養(yǎng)；(4)表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合；(5)該酵母可以甲醇為唯一的碳源，培養(yǎng)基成分無需添加其它有機質(zhì)，減少污染。
目前常用的表達(dá)載體和發(fā)酵工藝多是由美國Invitrogen公司構(gòu)建開發(fā)，該系統(tǒng)己成功地表達(dá)了幾百種外源蛋白。Invitrogen公司開發(fā)的巴斯德畢赤酵母發(fā)酵工藝，其工業(yè)化可分為一級、二級種子培養(yǎng)、甘油培養(yǎng)階段、甘油流加階段及甲醇誘導(dǎo)階段。該工藝是目前巴斯德畢赤酵母表達(dá)生產(chǎn)外源蛋白，較為通用的發(fā)酵工藝(中國專利201010602114.5，201110327865.5)。甘油培養(yǎng)和甘油流加階段目的在于使菌體快速生長和增殖，達(dá)到高密度發(fā)酵最佳的菌體濃度范圍，該階段在工業(yè)化生產(chǎn)中十分關(guān)鍵，需實時監(jiān)控，操作復(fù)雜并較難掌控，高于或低于該范圍，都將造成成本增加、蛋白產(chǎn)量降低的不良后果。
實際的畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)中，主要操作人員以普通工人為主，過于復(fù)雜的操作容易導(dǎo)致較高的出錯率，發(fā)生技術(shù)失誤事件進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵工藝的最終失敗。因此，簡化畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝，尤其是簡化現(xiàn)有的發(fā)酵工藝中復(fù)雜的甘油培養(yǎng)和甘油流加階段的工藝，不僅可以降低生產(chǎn)成本，同時也減少出錯的概率，減少因技術(shù)失誤而導(dǎo)致的發(fā)酵失敗，能夠為重組蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)帶來便利和極大的經(jīng)濟(jì)價值。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于簡化現(xiàn)有的畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝，提供一種工藝簡單，操作方便可行，重組蛋白產(chǎn)收率大、純度高，適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝，采用巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris為菌種，先進(jìn)行一級種子培養(yǎng)，至菌濃為20±2g/L時轉(zhuǎn)接二級種子培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)至菌濃為120±10g/L時轉(zhuǎn)接至甘油培養(yǎng)階段，甘油培養(yǎng)階段中甘油的添加量為60～70g/L，待溶氧迅速上升到達(dá)相對穩(wěn)定狀態(tài)時，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段，誘導(dǎo)120±8h后，發(fā)酵結(jié)束。
本發(fā)明所述的巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5021，并在中國專利201110327865.5中充分公開。
本發(fā)明所述的一級種子培養(yǎng)采用現(xiàn)有的常規(guī)方法，具體為將菌種巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris接種至種子培養(yǎng)基中，30℃搖瓶培養(yǎng)24h～36h，至菌體濕重達(dá)到20±2g/L。
本發(fā)明所述的二級種子培養(yǎng)采用現(xiàn)有的常規(guī)方法，具體為將一級種子液全部轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，用氨水調(diào)節(jié)并控制pH值為5.0，溶氧控制在20％～30％，培養(yǎng)至菌體濕重達(dá)到120±10g/L。
本發(fā)明所述的甘油培養(yǎng)階段的具體步驟為將二級種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量60～70g/L的甘油，30℃培養(yǎng)，用氨水調(diào)節(jié)并控制pH值為5.0，通氣量為30m3/h，攪拌速率為300～500rpm，當(dāng)溶氧陡然上升時，饑餓1h使甘油耗盡。
本發(fā)明所述的甲醇誘導(dǎo)階段采用現(xiàn)有的常規(guī)方法，具體為控制誘導(dǎo)階段溫度為30℃，pH值為5.0，設(shè)定甲醇補料與溶氧聯(lián)動，當(dāng)溶氧高于20％時開始流加甲醇，溶氧低于20％停止流加甲醇，誘導(dǎo)120±8h后，發(fā)酵結(jié)束，對發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集離心后的上清液依次進(jìn)行濃縮、超濾和納濾脫色脫鹽，得到重組人源膠原蛋白。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
(1)本發(fā)明的畢赤酵母的發(fā)酵工藝，不再需要準(zhǔn)備流加用無菌甘油，精簡了甘油滅菌罐，減少了能源、資源的損耗以及甘油的浪費；
(2)本發(fā)明甘油消耗完即可進(jìn)入下一工藝流程，有效解決了畢赤酵母發(fā)酵工藝復(fù)雜，蛋白產(chǎn)量不穩(wěn)定的問題，同時縮短了甘油培養(yǎng)階段的時間；
(3)本發(fā)明的畢赤酵母的發(fā)酵工藝，簡便易行，無需再監(jiān)控菌體濃度，減少了出錯幾率，便于生產(chǎn)人員實施，更適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
與原工藝相比，本發(fā)明工藝簡單，目的蛋白產(chǎn)率相當(dāng)，并且回收率提高至70％左右，純度達(dá)95％以上，更適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)重組人源膠原蛋白。
附圖說明
圖1為對比例1(a)和實施例2(b)得到的發(fā)酵液經(jīng)分離純化后的HPLC檢測圖。
具體實施方式
本發(fā)明的畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝，包括四個階段：一級種子培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)，甘油培養(yǎng)階段，甲醇流加階段。
現(xiàn)有的畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝，包括五個階段：一級種子培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)，甘油培養(yǎng)階段，甘油流加階段，甲醇流加階段。
除特殊說明外，本發(fā)明的實施例和對比例中使用的菌種及各培養(yǎng)基基本如下：
1、菌種：巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris，保藏編號：CGMCCNo.5021，已于2011年6月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，并在中國專利201110327865.5中充分公開。
2、培養(yǎng)基：
(1)一級種子培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基，組成為：
(2)二級種子培養(yǎng)基組成為：
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：
對比例中的甘油濃度為40g/L，流加質(zhì)量濃度為50％的甘油水溶液。實施例中的甘油濃度為55～75g/L，甘油階段結(jié)束后進(jìn)入甲醇流加階段，不再更換培養(yǎng)基。
其中PTM1組成為：
實施例1
一種畢赤酵母表達(dá)蛋白的發(fā)酵工藝，步驟如下：
(1)一級種子培養(yǎng)
將甘油保存的菌種接種至含有200mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中，30℃，250rpm培養(yǎng)24h～36h，培養(yǎng)至菌體濕重達(dá)到20±2g/L；
(2)二級種子培養(yǎng)
將一級種子液全部轉(zhuǎn)接入含有60L發(fā)酵培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)，用氨水調(diào)節(jié)并控制pH值為5.0，溶氧控制在20％～30％，培養(yǎng)至菌體濕重達(dá)到120±10g/L；
(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)
將二級種子液轉(zhuǎn)入含有60L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，添加60g/L的甘油，30℃培養(yǎng)，用氨水調(diào)節(jié)并控制pH值為5.0，通氣量為30m3/h，攪拌速率為300～500rpm，當(dāng)溶氧陡然上升時，饑餓1h使甘油耗盡；
然后開始甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)階段溫度為30℃，pH值控制在5.0，設(shè)定甲醇補料與溶氧聯(lián)動，當(dāng)溶氧高于20％開始流加甲醇，溶氧低于20％停止流加甲醇，誘導(dǎo)112后達(dá)到平臺期，誘導(dǎo)120h后出罐，對誘導(dǎo)表達(dá)后的發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集離心后的上清液依次進(jìn)行濃縮、超濾和納濾脫色脫鹽，得到重組人源膠原蛋白。
實施例2
本實施例與實施例1不同的是甘油添加量為65g/L，其他步驟與實施例1相同。
實施例3
本實施例與實施例1不同的是甘油添加量為70g/L，其他步驟與實施例1相同。
對比例1
本對比例與實施例1不同的是甘油添加量為55g/L，其他步驟與實施例1相同。
對比例2
本實施例與實施例1不同的是甘油添加量為75g/L，其他步驟與實施例1相同。
對比例3
(1)一級種子培養(yǎng)
將甘油保存的菌種接種至含有200mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中，30℃，250rpm培養(yǎng)24h～36h，培養(yǎng)至菌體濕重達(dá)到20±2g/L；
(2)二級種子培養(yǎng)
將一級種子液全部轉(zhuǎn)接入含有60L發(fā)酵培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)，用氨水調(diào)節(jié)并控制pH值為5.0，溶氧控制在20％～30％，培養(yǎng)至菌體濕重達(dá)到120±10g/L；
(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)
將二級種子液轉(zhuǎn)入含有60L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，添加40g/L的甘油，30℃培養(yǎng)，用氨水調(diào)節(jié)并控制pH值為5.0，通氣量為30m3/h，攪拌速率為300～500rpm，當(dāng)溶氧陡然上升時，開始流加補甘油，pH值控制為5.0，溶氧控制在20％以上，當(dāng)菌體濃度達(dá)到160±10g/L時停止流加甘油，饑餓1h使甘油耗盡；
然后開始甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)階段溫度為30℃，pH值控制在5.0，設(shè)定甲醇補料與溶氧聯(lián)動，當(dāng)溶氧高于20％開始流加甲醇，溶氧低于20％停止流加甲醇，誘導(dǎo)112后達(dá)到平臺期，誘導(dǎo)120h后出罐；對誘導(dǎo)表達(dá)后的發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集離心后的上清液依次進(jìn)行濃縮、超濾和納濾脫色脫鹽，得到重組人源膠原蛋白。
圖1為對比例1和實施例2得到的發(fā)酵液經(jīng)分離純化后的HPLC檢測圖，圖中峰為重組人源膠原蛋白，其中a為對比例1，b為實施例2。從圖中可知，對比例1的發(fā)酵液經(jīng)分離純化后，蛋白純度為91.7％，實施例2的發(fā)酵液經(jīng)分離純化后，蛋白純度為96.4％，本發(fā)明的發(fā)酵工藝得到的重組人源膠原蛋白的純度優(yōu)于對比例。
對各實施例和對比例中的發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行檢測，分別測定甲醇流加前菌體濕重、膠原蛋白產(chǎn)量、蛋白回收率和蛋白純度，具體檢測結(jié)果如表1所示。
表1各實施例和對比例的發(fā)酵結(jié)果
從表中可以看出，采用本發(fā)明發(fā)酵工藝，重組人源膠原蛋白的回收率達(dá)到70％以上，純度達(dá)到95％以上，優(yōu)于對比例。利用HPLC測定純化之后膠原蛋白濃度和純度，蛋白表達(dá)量與對比例相當(dāng)，蛋白收率和純度均高于對比例。綜上所述，本發(fā)明工藝簡單，更適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)重組人源膠原蛋白。