專利名稱：來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氧化還原酶，羰基化合物到對應(yīng)的(S)-羥基化合物的對映體選擇性還原的方法和涉及獲得手性(R)-羥基化合物的方法。
對于藥理活性化合物，芳族物質(zhì)，信息素，農(nóng)業(yè)化學(xué)藥品或酶抑制劑的合成光學(xué)活性羥基化合物是具有廣泛應(yīng)用的有價值的手性組分。
同時，合適于在生物催化中大規(guī)模應(yīng)用并且可以以低成本足夠量地獲得的羰基還原酶的數(shù)量是極其有限的。下面的依賴NADH的S-特異性羰基還原酶是已知的來自馬肝的醇脫氫酶(HLADH)(EnzymeEngineering，6卷，1982，107頁)，來自酵母的醇脫氫酶(YADH)(Alcohol dehydrogenasesTheEnzymes(1963)，25-83頁。紐約Academic Press)，來自近平滑假絲酵母的羰基還原酶(CPCR)(US 5,523,223和US5,763,236)，來自紅串紅球菌(RECR)(US 5,523,223)和深色諾卡氏菌(Norcardia fusca)的羰基還原酶(Biosci.Biotechnol.Biochem.，63(10)(1999)，1721-1729頁)，來自博伊丁氏假絲酵母的醇脫氫酶(Biochim.，Biophys.Acta 716，(1982)，298-307頁)或來自硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus Solfutaricus)的醇脫氫酶(FEMSMicrobiology Letters，170(1999)，31-39頁)。
以上提到的羰基還原酶迄今沒有一種被大規(guī)模使用。其中的主要原因，除了通常太窄的底物譜或低的酶對映體選擇性，首先是所說的酶的可得性。迄今不可能足量地和低成本地提供大部分以上提到的酶。
在以上提到的羰基還原酶的應(yīng)用中產(chǎn)生的另一個問題是輔因子NADH或NADPH的再生。已知的方法使用底物偶聯(lián)的輔酶再生，例如用2-丙醇，或酶偶聯(lián)的輔酶再生，例如用甲酸脫氫酶。
用甲酸脫氫酶的酶偶聯(lián)的輔酶再生的缺點(diǎn)是其低的比活性(4-10U/mg)，因此，即使重組的甲酸脫氫酶也是相對昂貴的(J.Biotechnol.Bioeng.64，187-193頁)。
用異丙醇的底物偶聯(lián)的輔酶再生的缺點(diǎn)是不利的平衡位置和對于使用的共底物，例如異丙醇不足的酶穩(wěn)定性。
本發(fā)明的目的是提供氧化還原酶，其特征在于廣的底物譜，高的對映體選擇性和對于有機(jī)溶劑的高穩(wěn)定性。
所說的目的通過氧化還原酶以這樣一種方法達(dá)到，即使得其在NADH和水存在的條件下將羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以上提到的現(xiàn)有技術(shù)方法的缺點(diǎn)可以通過新的氧化還原酶避免。
本發(fā)明合適地涉及氧化還原酶，其可以從畢赤氏酵母屬或假絲酵母屬的酵母，特別是從莢膜畢赤氏酵母(Pichia capsulata)中獲得。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶，其具有根據(jù)SEQ ID NO8的DNA-序列和根據(jù)SEQ IDNO9的氨基酸序列。這些序列在附后的序列列表中描述。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及氧化還原酶，其中超過70％的氨基酸與氨基酸序列SEQ ID NO9是相同的并且其具有每mg蛋白質(zhì)超過1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸的反應(yīng)。優(yōu)選其中80％-99.5％，特別是90％-99.5％，更特別是99％-99.5％是與SEQ ID NO9的氨基酸序列相同的氨基酸的氧化還原酶。通過在實(shí)施例1中描述的試驗(yàn)體系進(jìn)行根據(jù)SEQ ID NO9的氧化還原酶或其如以下所定義的衍生物或其類似物的比活性測定。
根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶特征是它比具有氨基酸序列SEQ IDNO9的氧化還原酶具有另外1-40個氨基酸或少1-40個氨基酸并且它具有每mg蛋白質(zhì)超過1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸的反應(yīng)。優(yōu)選與在SEQ ID NO9的氨基酸序列中的相比其中多或少存在1-25個氨基酸，特別是2-20個氨基酸，或優(yōu)選3-10個氨基酸的氧化還原酶。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及氧化還原酶，其具有SEQ ID NO9的氨基酸序列并且通過可水溶聚合物修飾一次，兩次，三次，四次或五次和其中比活性達(dá)到每mg蛋白質(zhì)超過1μmol，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸的反應(yīng)。例如，可水溶聚合物是聚乙二醇。聚乙二醇的結(jié)合優(yōu)選在根據(jù)SEQ ID NO9的蛋白質(zhì)的N-端基末端發(fā)生。根據(jù)SEQ ID NO9的氧化還原酶也可以與固體，例如聚乙烯，聚苯乙烯，多糖，纖維素或纖維素衍生物結(jié)合。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及代表具有氨基酸序列SEQ ID NO9的片段的蛋白質(zhì)片段，每個片段具有5-30個氨基酸數(shù)量。優(yōu)選具有SEQ IDNO9的片段，其具有6-25個氨基酸，特別8-20個氨基酸或10-18個氨基酸，特別是氨基酸序列SEQ ID NO10的鏈長。所說的片段可以，例如，用于發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的來自莢膜畢赤氏酵母或來自任何其他微生物的氧化還原酶。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及融合蛋白，其特征在于它代表具有氨基酸序列SEQ ID NO9或具有氨基酸序列SEQ ID NO9的片段的氧化還原酶，具有5-30個數(shù)量的通過肽鍵在N-端基或羧基-端基末端連結(jié)到進(jìn)一步的多肽上的氨基酸。融合蛋白可以，例如，更易于從其它的蛋白質(zhì)上分離并在在細(xì)胞中更大量地表達(dá)。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及抗體，其特異性地結(jié)合到根據(jù)SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的氧化還原酶上。根據(jù)已知的方法通過免疫接種合適的哺乳動物進(jìn)行所說的抗體的制備并隨后獲得該抗體?？贵w可以是單克隆的或多克隆的。
本發(fā)明還涉及分離的核酸序列，其為根據(jù)SEQ ID NO9和SEQ IDNO10的氧化還原酶編碼。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及分離的氧化還原酶的DNA-序列，其在NADH和水存在的條件下催化羰基化合物到對應(yīng)的(S)-羥基化合物的還原，其中DNA-序列選自a)具有根據(jù)SEQ ID NO8，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6或SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA-序列，或各個互補(bǔ)鏈，b)雜交一個或幾個根據(jù)a)的DNA-序列的DNA-序列或雜交其互補(bǔ)鏈的DNA-序列，雜交在嚴(yán)格的條件下發(fā)生，和c)DNA-序列，其由于遺傳密碼的簡并編碼通過一個或幾個根據(jù)a)或b)的DNA-序列編碼的蛋白質(zhì)。
雜交中普遍的條件在Sambrok和Russel，Molecular Cloning aLaboratory Manual，卷1，章1，Protocol 30-32中描述。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及DNA-序列，其中超過70％的核酸堿基與根據(jù)SEQ ID NO8的DNA-序列或與其互補(bǔ)鏈?zhǔn)窍嗤牟⑶揖幋a氧化還原酶，該氧化還原酶具有每mg蛋白質(zhì)超過1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸的反應(yīng)。優(yōu)選其中80％-99.5％，特別是90％-99.5％，更特別是99％-99.5％的核酸堿基與根據(jù)SEQ ID NO8的DNA-序列相同的DNA-序列。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及具有10-50個核酸堿基的核酸序列，其具有對應(yīng)根據(jù)SEQ ID NO8的DNA-序列的一部分或幾部分或?qū)?yīng)其互補(bǔ)鏈的序列。優(yōu)選具有15-45個以上提到的DNA-序列的核酸堿基，特別是20-40個堿基或30-40個核酸堿基的核酸序列。以上提到的核酸序列作為分子探針或作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物是合適的。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及包含一個或幾個以上提到的核酸或DNA序列的克隆載體。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及位于細(xì)菌，昆蟲，植物或哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的并包含一個或幾個以上提到的核酸或DNA序列的表達(dá)載體，該序列以合適的方式連接到表達(dá)控制序列上。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌，酵母，昆蟲，植物或哺乳動物細(xì)胞并已經(jīng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
前面提到的DNA-序列或氨基酸序列的同一性通過與各個蛋白質(zhì)或DNA序列的部分序列相同的氨基酸或核酸堿基的數(shù)量相加并除以氨基酸或核酸堿基的總數(shù)并乘以一百計(jì)算的。
合適的克隆載體是，例如ppCR-Script，pCMV-Script，pBluescript(Stratagene)，pDrive克隆載體(Quiagen，Hilden，德國)，pS Blue，pET Blue，pET LIC-載體(Novagen，Madison，美國)和TA-PCR克隆載體(Invitrogen，Karlsruhe，德國)。
合適的表達(dá)載體是，例如pKK223-3，pTrc99a，pUC，pTZ，pSK，pBluescript，pGEM，pQE，pET，PHUB，pPLc，pKC30，pRM1/pRM9，pTrxFus，pAS1，pGEx，pMAL或pTrx。
合適的表達(dá)控制序列是，例如trp-lac(tac)-啟動子，trp-lac(trc)-啟動子，lac-啟動子，T7-啟動子或λpL-啟動子。
來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶是具有34±2kDa的分子量(在SDS-凝膠中測定)和140±10kDa的分子量(通過凝膠滲透層析測定)的同型四聚體。氧化還原酶的最佳溫度范圍是40℃-45℃，還原反應(yīng)的最佳pH是6.5-7.0和氧化反應(yīng)的最佳pH是7.8-8.2。來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶顯示了好的溫度和pH穩(wěn)定性并且在5.5-8.5的pH范圍和在15℃-40℃的溫度范圍穩(wěn)定5小時，并且顯示了在有機(jī)溶劑中的高穩(wěn)定性。
酶可以特別從來自畢赤氏酵母屬的酵母分離并且可以在分光光度試驗(yàn)中在合適底物，例如乙基-4-氯-3-氧代丁酸鹽(butyrat)或2-丁酮存在的條件下通過在340nm下的NADH的減少檢測。
克隆根據(jù)本發(fā)明的來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶并且可以在具有1000-10000U/g E.coli濕重的活性的大腸桿菌(E.coli)中過表達(dá)。該酶不昂貴并且可以大量獲得。數(shù)據(jù)庫中的序列對比顯示根據(jù)本發(fā)明的來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶是依賴鋅的羰基還原酶。
本發(fā)明還涉及從莢膜畢赤氏酵母中獲得氧化還原酶的方法。為此目的，為來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶編碼的DNA例如在合適的原核或真核微生物中表達(dá)。優(yōu)選地，來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶轉(zhuǎn)化成E.coli菌株并特別在E.coli BL21star(DE3)細(xì)胞中表達(dá)。
可以獲得來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶，例如培養(yǎng)以上提到的重組E.coli細(xì)胞，誘導(dǎo)氧化還原酶的表達(dá)并且之后，大約10-18小時(h)后，通過超聲處理或在球磨機(jī)中用玻璃珠濕研磨消化細(xì)胞(RetschGmbH，Haan，德國，10min，24Hz)。獲得的細(xì)胞提取物可以直接使用或進(jìn)一步純化。為此目的，例如離心細(xì)胞提取物，并且獲得的上清液經(jīng)過離子交換層析，例如通過在Q-Sepharose Fast Flow裝置(Pharmacia)中的離子交換層析。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及羰基化合物對映選擇性還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物的方法，該方法特征在于a)在根據(jù)權(quán)利要求1-9的一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，和b)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
根據(jù)本發(fā)明的方法具有高的使用壽命，超過95％的制備的手性(S)-羥基化合物的對映體純度和基于加入的羰基化合物的高產(chǎn)率。
術(shù)語“NADH”理解成還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。
術(shù)語“NAD”理解成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。
術(shù)語“羰基化合物”理解成例如具有下式I的化合物。
R1-C(O)-R2(I)
基團(tuán)R1是，例如1)-(C1-C20)-烷基，其中烷基是線性鏈的或分支的，2)-(C2-C20)-烯基，其中烯基是線性鏈的或分支的并包含一個，二個，三個或四個雙鍵，取決于鏈長，3)-(C2-C20)-炔基，其中炔基是線性鏈的或分支的并任選包含一個，二個，三個或四個三鍵，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(C1-C8)-烷基-(C6-C14-)-芳基，6)-(C5-C14)-雜環(huán)，其是未取代的或被鹵素，羥基，氨基或硝基取代一至三次，或7)-(C3-C7)-環(huán)烷基，其中在1)-7)下提到的部分是未取代的或彼此獨(dú)立地被以下基團(tuán)取代一，二或三次a)-OH，b)鹵素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2。
基團(tuán)R2是，例如1)-(C1-C6)-烷基，其中烷基是線性鏈的或分支的，2)-(C2-C6)-烯基，其中烯基是線性鏈的或分支的并包含一個，二個或三個雙鍵，取決于鏈長，3)-(C2-C6)-炔基，其中炔基是線性鏈的或分支的并任選包含一個或二個三鍵，4)-(C0-C10)-烷基-C(O)-O-(C1-C6)-烷基，其中烷基是線性的或分支的并且是未取代的或被鹵素，羥基，氨基或硝基取代一至三次，其中在1)-4)下提到的部分是未取代的或彼此獨(dú)立地被以下基團(tuán)取代一，二或三次a)-OH，b)鹵素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2。
術(shù)語手性“(S)-羥基化合物”理解成例如具有下式II的化合物，R1-C(OH)-R2 (II)其中-OH-基團(tuán)通常位于相對于其連接的碳原子的(S)-構(gòu)型中，并且R1和R2具有在式I中相同的意思。
然而，如果羰基基團(tuán)或鹵原子位于與醇接近的位置，則名稱改變并且之后對映體選擇性醇也稱作(R)-醇。然而，這僅僅是名稱并且不改變根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶怎樣進(jìn)行還原的立體選擇性方法的問題。
術(shù)語“芳基”，理解成在環(huán)內(nèi)包含6-14個碳原子的芳族碳部分。-(C6-C14)芳基部分是，例如，苯基，萘基，1-萘基，2-萘基，聯(lián)苯基，2-聯(lián)苯基，3-聯(lián)苯基和4-聯(lián)苯基，蒽基或芴基。聯(lián)苯基部分，萘基部分和特別是苯基部分是優(yōu)選的芳基部分。術(shù)語“鹵素”，理解成氟，氯，溴和碘的元素。術(shù)語“-(C1-C20)-烷基”，烴部分理解成碳鏈，其是線性-鏈或分支的并包含1-20個碳原子，例如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，叔丁基，戊基，己基，庚基，辛基，壬基或癸基。術(shù)語“-C0烷基”，理解成共價鍵。
術(shù)語“-(C3-C7)環(huán)烷基”，理解成環(huán)烴部分，例如環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基或環(huán)庚基。
術(shù)語“-(C5-C14)雜環(huán)”代表部分或完全飽和的單環(huán)或雙環(huán)5元-14元雜環(huán)。雜原子的例子是N，O和S。術(shù)語“-(C5-C14)雜環(huán)”的例子是衍生自吡咯，呋喃，噻吩，咪唑，吡唑，噁唑，異噁唑，噻唑，異噻唑，四唑，1，2，3，5-噁噻二唑-2-氧化物，三唑酮，噁二唑酮，異噁唑酮，噁二唑啉硫酮，被F，-CN，-CF3或-C(O)-O-(C1-C4)烷基取代的三唑，3-羥基吡咯-2，4-二酮，5-氧代-1，2，4-噻二唑，吡啶，吡嗪，嘧啶，吲哚，異吲哚，吲唑，2，3-二氮雜萘，喹啉，異喹啉，喹喔啉，喹唑啉，噌啉的部分，所說的雜環(huán)的咔啉-和苯-anellated的，環(huán)戊-，環(huán)己-或環(huán)庚-anellated的衍生物。該部分特別優(yōu)選2-或3-吡咯基，苯基吡咯基，例如4-或5-苯基-2-吡咯基，2-呋喃基，2-噻吩基，4-咪唑基，甲基咪唑基，例如1-甲基-2-，-4-或-5-咪唑基，1，3-噻唑-2-基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-，3-或4-吡啶-N-氧化物，2-吡嗪基，2-，4-或5-嘧啶基，2-，3-或5-吲哚基，取代的2-吲哚基，例如1-甲基，5-甲基，5-甲氧基-，5-芐氧基-，5-氯-或4，5-二甲基-2-吲哚基，1-芐基-2-或-3-吲哚基，4，5，6，7-四氫-2-吲哚基，環(huán)庚[b]-5-吡咯基，2-，3-或4-喹啉基，1-，3-或4-異喹啉基，1-氧代-1，2-二氫-3-異喹啉基，2-喹喔啉基，2-苯并呋喃基，2-苯并噻吩基，2-苯并噁唑基或苯并噻唑基或二氫吡啶基(dihydropyrinidyl)，吡咯烷基，例如2-或3-(N-甲基吡咯烷基)，哌嗪基，嗎啉基，硫代嗎啉基，四氫噻吩基或苯并二氧戊環(huán)基。
優(yōu)選的具有式I的化合物是，例如，乙基-4-氯-乙酰乙酸酯，甲基乙酰乙酸酯，乙基-8-氯-6-氧代辛酸，乙基-3-氧代戊酸酯，4-羥基-2-丁酮，乙基-2-氧代戊酸酯，乙基-2-氧代-4-苯基丁酸，丙酮酸乙酯，乙醛酸乙基苯基酯，1-苯基-2-丙酮，2，3-二氯乙酰苯，乙酰苯，2-辛酮，3-辛酮或2-丁酮。
對應(yīng)形成的S-醇是，例如，(R)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸，乙基-(S)-2-羥基-4-苯基丁酸，(S)-2-辛醇或(R)-乙基-8-氯-6-羥基辛酸。
合適的氧化還原酶來自，例如莢膜畢赤氏酵母。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，氧化還原酶可以以完全純化的狀態(tài)或以部分純化的狀態(tài)使用。該方法用根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶或用包含根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的細(xì)胞進(jìn)行。在這樣做的過程中，使用的細(xì)胞可以以天然的，可滲透的或溶胞的狀態(tài)提供。優(yōu)選地，使用根據(jù)SEQ ID NO9的克隆氧化還原酶。
使用的氧化還原酶的體積活性是100單位/ml(U/ml)-5000U/ml，優(yōu)選-大約500U/ml。
每kg反應(yīng)的具有式I的化合物使用5000-2000000U的氧化還原酶，優(yōu)選大約10000-200000U。由此，酶單位1U對應(yīng)每分鐘反應(yīng)1μmol具有式I的化合物需要的酶的數(shù)量。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及羰基化合物對映體選擇性還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物的方法，其中a)在根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，b)通過氧化還原酶形成的NAD用共底物還原成NADH，和c)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
使用的羰基化合物和氧化還原酶的量等于以上提到的在描述的方法中的量。對于根據(jù)本發(fā)明的方法合適的共底物是醇，例如乙醇，2-丙醇(異丙醇)，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。這些共底物通過根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶和NAD反應(yīng)生成對應(yīng)的酮和NADH。由此，再生NADH。
對于NAD到NADH的再生的共底物，例如異丙醇的量是5％-50％，基于總體積，優(yōu)選8％-20％，特別是10％-15％。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及(S)-羥基化合物對映體選擇性回收的方法，其中a)在根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，b)通過氧化還原酶形成的NAD用脫氫酶和共底物還原成NADH，和c)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
合適的脫氫酶是，例如，來自面包酵母，來自博伊丁氏假絲酵母或近平滑假絲酵母的依賴于NADH的醇脫氫酶。對于使用的醇脫氫酶合適的共底物是醇，例如乙醇，2-丙醇(異丙醇)，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。
進(jìn)一步地，NAD還原也可以通過甲酸脫氫酶(Tishkov等，J.Biotechnol.Bioeng.64，187-193，中試規(guī)模的生產(chǎn)和重組NAD和NADP特異性甲酸脫氫酶的分離(Pilot-scale production and isolation ofrecombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase))進(jìn)行。合適的甲酸脫氫酶的共底物是，例如，甲酸的鹽，例如甲酸銨，甲酸鈉或甲酸鈣。
底物偶聯(lián)的輔酶的再生優(yōu)選使用仲醇，例如乙醇，2-丙醇(異丙醇)，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。因此，該方法優(yōu)選在無另外的脫氫酶的條件下進(jìn)行。
在本方法中優(yōu)選向使用的水中添加緩沖液，例如具有5-10的pH，優(yōu)選6-9的pH的磷酸鉀，三/HCl或三乙醇胺緩沖液。緩沖液濃度是10mM-150mM。
緩沖液還可以包含穩(wěn)定或激活酶的離子，例如鋅離子或鎂離子。
溫度是，例如，10℃-60℃，優(yōu)選30℃-55℃。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及(S)-羥基化合物對映體選擇性回收的方法，其中a)在氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，b)在有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行該反應(yīng)，和c)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
優(yōu)選的有機(jī)溶劑是，例如，乙醚，叔丁基甲基醚，二異丙基醚，二丁基醚，乙酸丁酯，庚烷，己烷或環(huán)己烷。
如果使用另外的溶劑，反應(yīng)批料由含水相和有機(jī)相組成。有機(jī)相通過合適溶劑或通過本身不溶于水的底物形成，在該溶劑中底物以溶解狀態(tài)存在。
有機(jī)相占總反應(yīng)體積的5％-80％，優(yōu)選10％-40％。
在根據(jù)本發(fā)明的兩相體系中，水形成一種液相，和有機(jī)溶劑形成第二液相。另外，可以任選提供固相或另一液相，其例如產(chǎn)生自還未完全溶解的氧化還原酶和/或添加的酶或羰基化合物。然而，優(yōu)選沒有固相的兩種液相。優(yōu)選兩種液相機(jī)械混合以便在兩液相之間形成大的表面積。
輔因子NADH的濃度是0.01mM-1mM，特別是0.05mM-0.2mM，基于含水相。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，羰基化合物以基于總體積的3％-30％，優(yōu)選5％-15％，特別是10％的量使用。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及羰基化合物對映體選擇性還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物的方法，其中a)在氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，b)在有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行該反應(yīng)，c)通過氧化還原酶形成的NAD用共底物還原成NADH，和d)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
使用的羰基化合物和氧化還原酶的量對應(yīng)以上提到的方法。對于本方法合適的共底物是醇，例如乙醇，2-丙醇(異丙醇)，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。這些共底物通過氧化還原酶和NAD反應(yīng)生成對應(yīng)的酮和NADH。由此，再生NADH。
對于NAD到NADH的再生的共底物，例如異丙醇的量是5％-50％，基于總體積，優(yōu)選8％-20％，特別是10％-15％。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及羰基化合物對映體選擇性還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物的方法，其中a)在氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，b)通過氧化還原酶形成的NAD同時用脫氫酶和共底物還原成NADH，c)在有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行該反應(yīng)，和d)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
對于醇脫氫酶優(yōu)選在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用進(jìn)一步的穩(wěn)定劑。合適的穩(wěn)定劑是，例如，甘油，山梨糖醇，1，4-DL-二硫蘇糖醇(DTT)或二甲基亞砜(DMSO)。
例如，根據(jù)本發(fā)明的方法在由玻璃或金屬制成的密閉反應(yīng)容器中進(jìn)行。為此目的，組分各自轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中并在例如氮或空氣氛下攪拌。取決于使用的底物和羰基化合物，反應(yīng)時間達(dá)1小時-48小時，特別是2小時-24小時。
隨后，后處理反應(yīng)混合物。為此目的，分離含水相并過濾有機(jī)相。任選含水相可再萃取一次并可以象有機(jī)相一樣后處理。之后，任選從過濾的有機(jī)相蒸發(fā)溶劑。以這種方法，獲得了具有超過99％的對映體純度和基本不含原料乙基-4-氯乙酰乙酸酯的產(chǎn)物(R)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸。產(chǎn)物蒸餾后，本方法的總產(chǎn)率達(dá)50％-95％，基于使用的原料的量。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及具有下式II的手性(R)-羥基化合物的回收方法，其包含如前面所定義的R1和R2部分。
R1-C(OH)-R2 (II)在所說的方法中，a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶，NAD和水培養(yǎng)，和b)分離殘余的具有式II的手性(R)-羥基化合物。
由此，具有式II的(S)-羥基化合物反應(yīng)成對應(yīng)的酮化合物和NADH。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及具有式II的手性(R)-羥基化合物的回收方法，其中a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶，NAD和水培養(yǎng)，b)通過氧化還原酶形成的NADH用共底物氧化成NAD，和c)分離殘余的具有式II的手性(R)-羥基化合物。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及具有式II的手性(R)-羥基化合物的回收方法，其中a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶，NAD和水培養(yǎng)，b)通過氧化還原酶形成的NADH用脫氫酶和共底物氧化成NAD，和c)分離殘余的具有式II的手性(R)-羥基化合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有式II的手性(R)-羥基化合物的回收方法，其中a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶，NAD和水培養(yǎng)，b)在有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行該反應(yīng)，和c)分離殘余的具有式II的手性(R)-羥基化合物。
根據(jù)本發(fā)明具有式II的手性(R)-羥基化合物的進(jìn)一步的方法特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶，NAD和水培養(yǎng)，b)在有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行該反應(yīng)，c)通過氧化還原酶形成的NADH用脫氫酶和共底物氧化成NAD，和d)分離殘余的具有式II的手性(R)-羥基化合物。
反應(yīng)條件與在前面具有式I的酮化合物的對映體選擇性還原方法中的基本相同。然而，僅僅具有式II的(S)-羥基化合物對映體選擇性地氧化成對應(yīng)的酮化合物，而非具有式I的酮化合物由具有式II的化合物的消旋混合物對映體選擇性還原。因此，具有式II的(R)-羥基化合物保留并可以被分離。
進(jìn)一步地，其對應(yīng)的酮，例如丙酮用于NAD的再生方法而非用作共底物的醇，例如乙醇，2-丙醇(異丙醇)，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。例如，丙酮和NADH用根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶或另外的脫氫酶反應(yīng)成NAD和異丙醇。使用的酮的量是5％-50％，基于總體積，優(yōu)選8％-20％和特別是10％-15％。
在以下中，本發(fā)明通過實(shí)施例解釋。
實(shí)施例實(shí)施例1對于S-特異性醇脫氫酶酵母的篩選為了篩選，許多不同的酵母菌株在以下的培養(yǎng)基(所有數(shù)據(jù)以g/l表示)中培養(yǎng)酵母提取物(3)，麥芽提取物(3)，蛋白胨(5)和葡萄糖(10)。在121℃下培養(yǎng)基滅菌并且在25℃下和在160轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)的搖動器上在未進(jìn)一步調(diào)整pH的條件下培養(yǎng)酵母。隨后，用800μl消化緩沖液(100mM三乙醇胺(TEA)，pH＝7.0)重懸浮125mg細(xì)胞，在球磨機(jī)(Retsch)中在4℃下用1g玻璃珠混合并消化10分鐘(min)。在12000rpm下離心2min后獲得的上清液(溶菌產(chǎn)物)用于以下的活性篩選和測定對映體過量(ee-值)。乙基-4-氯乙酰乙酸酯和2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-酮用作底物。
用于活性篩選的批料860μl0.1M KH2PO4/K2PO4pH＝7.01mM MgCl220μl NADPH或NADH(10mM)20μl 溶菌產(chǎn)物100μl各個底物(100mM)反應(yīng)在340nm的波長下進(jìn)行1分鐘。
用于測定ee-值的批料20μl 溶菌產(chǎn)物100μlNADH或NADPH(50mM)60μl 底物(乙基-4-氯乙酰乙酸酯100mM)24小時(h)后，測定ee的批料用氯仿萃取并且通過氣相色譜(GC)測定對映體過量。
對映體過量計(jì)算如下ee(％)＝((R-醇-S-醇)/(R-醇+S-醇))×100。
DSMZ代表Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen，Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig酶單位的定義1U對應(yīng)每分鐘反應(yīng)1μmol底物需要的酶的量實(shí)施例2來自于莢膜畢赤氏酵母依賴于NADH的(S)-特異性氧化還原酶的分離為了從莢膜畢赤氏酵母(P.capsulata)中分離依賴于NADH的氧化還原酶，微生物如實(shí)施例1描述培養(yǎng)。一旦達(dá)到穩(wěn)定期，收獲細(xì)胞并通過離心從培養(yǎng)基中分離。通過使用玻璃珠濕研磨進(jìn)行酶釋放但也可以通過其它的消化方法取得。為此目的，用400ml消化緩沖液(100mM三乙醇胺，1mM MgCl2，pH＝7.0)懸浮100g P.capsulata并通過弗氏細(xì)胞壓碎器均化。
離心(7000rpm)后獲得的粗提取物之后進(jìn)一步純化并通過FPLC(快速蛋白質(zhì)液相層析)后處理。
根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶可以在Q-Sepharose Fast Flow(Messrs.Pharmacia)和Uno Q(Biorad，慕尼黑，德國)上通過離子交換層析以兩個連續(xù)的步驟純化。為此目的，離心后獲得的溶菌產(chǎn)物直接應(yīng)用于Q-Sepharose FF-柱，該柱用50mM的磷酸鉀緩沖液，pH＝7.0平衡，并用增加的線性鹽梯度洗脫。在這樣做的過程中，在0.2-0.3MNaCl下洗脫氧化還原酶。合并包含氧化還原酶的級分并通過超濾(排阻限10kDa)濃縮至適當(dāng)?shù)捏w積。隨后，后處理濃縮的氧化還原酶級分并進(jìn)一步通過Uno Q純化，使用以上提到的相同緩沖液。由此酶在0.1M NaCl下洗脫。
緊隨其后，通過凝膠滲透(Superdex 200HR；Pharmacia，100mM三乙醇胺，pH＝7.0，0.15M NaCl)測定獲得的純化的氧化還原酶的分子量。
過氧化氫酶(232kDa)，醛縮酶(158kDa)，清蛋白(69.8kDa)和卵清蛋白(49.4kDa)用作分子量標(biāo)準(zhǔn)。
下表2總結(jié)了獲得的結(jié)果。
表2
氧化還原酶的酶活性在根據(jù)實(shí)施例1(批料活性篩選)的試驗(yàn)體系中測定，并且根據(jù)Lowry等，Journal of Biological Chemistry，193(1951)265-275或Peterson等，Analytical Biochemistry，100(1979)201-220進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)量的測定。酶活性與蛋白質(zhì)數(shù)量的商產(chǎn)生了比活性，其中每分鐘1μmol的轉(zhuǎn)化率對應(yīng)1單位(U)。
通過凝膠滲透測定的根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的的分子量在天然狀態(tài)下是140±10kDa。
實(shí)施例3根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的N-末端序列的測定凝膠滲透后，根據(jù)實(shí)施例2的酶制劑在10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠中分級并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF-膜)上。在大約35-45kDA下的顯著帶(band)通過埃德曼降解(procise 492(PE-Biosystems)進(jìn)行N-末端序列測定。獲得以下的N-末端序列。
SEQ ID NO10KTQAGYIFKKGA實(shí)施例4來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶的克隆真核微生物莢膜畢赤氏酵母屬于糖酵母科。所說的生物的基因結(jié)構(gòu)顯示了外顯子-內(nèi)含子排列。因此，為了確定為對映體選擇性氧化還原酶編碼的基因序列由莢膜畢赤氏酵母的活性細(xì)胞制備cDNA文庫。
4.1由莢膜畢赤氏酵母細(xì)胞制備總的RNA600mg來自莢膜畢赤氏酵母的新細(xì)胞重懸浮于2.5ml冰冷的LETS(10mM三-HCl，pH＝7.4，10mM EDTA，100mM LiCl，0.2％SDS)緩沖液中。向所說的細(xì)胞懸浮液中添加5ml(大約20g)在硝酸中洗滌過并用3ml苯酚(pH 7.0)平衡過的玻璃珠。因此，整個批料交替一次搖動30秒(Vortex Genie，Scientific Industries Inc.，紐約，美國)和在冰上冷卻30秒并處理總共10分鐘。隨后，添加另外5ml冰冷的LETS緩沖液。所說的細(xì)胞懸浮液在11000g和4℃下離心5分鐘。除去含水相并用相同體積的苯酚∶氯仿∶3-甲基-1-丁醇(24∶24∶1)萃取兩次。接著是用氯仿萃取。最后萃取后，通過添加1/10體積的5M LiCl在-20℃下沉淀獲得的總RNA。
通過寡-dT纖維素(mRNA PrpKit，Qiagen)1mg分離的RNA用于回收m-RNA。
隨后沉淀后，5μg mRNA用于cRNA的合成(pBluescript II X RcDNA Library Construction Kit，Stratagene)。根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)建造的文庫轉(zhuǎn)化成XL-10Gold E.coli并檢查(S)-ADH活性。
確定兩個克隆(2/1和2/2)并在滅絕下降的基礎(chǔ)上用作為輔因子的NADH和作為底物的乙基-4-氯乙酰乙酸酯分離。通過包含在克隆中的質(zhì)粒的多個克隆位點(diǎn)用Primer T7(SEQ ID NO3)和Primer T3(SEQ ID NO4)測序?qū)е铝司哂?175bp(SEQ ID NO1)大小的片段。所說的片段為包含366個氨基酸(SEQ ID NO2)的融合蛋白編碼并該片段由β-半乳糖苷酶的a-片段和根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的序列構(gòu)成。
4.2通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))由莢膜畢赤氏酵母合成為(S)-ADH編碼的全長轉(zhuǎn)錄物基于SEQ ID NO1，為了隨后的全長轉(zhuǎn)錄物的克隆特異性引物被建造成適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系。在這樣做的過程中，改性(SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7)具有對Nde I(或Sph I，分別)識別序列的5′-引物和具有對Hind III識別序列的3′-引物。寡1-Nde I5‘-GGAATTCCATATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-3’寡2-Sph I5‘-CACTGCATGCTGATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-3’寡3-Hind III5′-CCCAAGCTTTCATGGAAGCATAACCAATCTT-3′從莢膜畢赤氏酵母的表達(dá)文庫的克隆2/1分離的質(zhì)粒DNA作為聚合酶鏈反應(yīng)的模板。用50ng模板和以下的溫度循環(huán)在PCR緩沖液[10mM三-HCl，(pH 8.0)；50m KCl；10mM MgSO4；1mM dNTP混合物(由此N代表堿基A，T，C或G)中進(jìn)行擴(kuò)增；每30pMol引物和2.5U platinum Pfx DNA-Polymerase(Invitrogen)]循環(huán)1 94℃，2min
循環(huán)2×3094℃，15sec58℃，30sec68℃，75sec循環(huán)368℃，7min4℃，∞純化后，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物通過1％瓊脂糖凝膠在內(nèi)切核酸酶NdeI和Hind III或內(nèi)切核酸酶Sph I和Hind III的幫助下消化并連接到pET21a載體(Novagen)或pQE30載體(Qiagen)的骨架，該骨架已經(jīng)用相同的內(nèi)切核酸酶處理。2il連接批料轉(zhuǎn)化成E.coli Top 10F的細(xì)胞(Invitrogen)后，抗氨芐青霉素的克隆的質(zhì)粒DNA通過使用內(nèi)切酶限制性酶切分析測試具有1100bp的大小的插入片段的存在，該限制性內(nèi)切酶酶切分析使用內(nèi)切核酸酶Nde I和Hind III或內(nèi)切核酸酶Sph I和Hind III。測序該表達(dá)構(gòu)造物pET21-PC#10。來自為根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶編碼的莢膜畢赤氏酵母的轉(zhuǎn)錄物具有總共1026bp的可讀框，該可讀框?qū)?yīng)341個氨基酸(SEQ ID NO9)。
4.3根據(jù)本發(fā)明來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶在Star BL 21(De3)大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)感受態(tài)大腸桿菌Star BL 21(De3)細(xì)胞(Invitrogen)用為根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶編碼的表達(dá)構(gòu)造物pET21-PC#10轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化的菌株在具有氨芐青霉素(50ig/ml)的LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)中培養(yǎng)直到達(dá)到0.5的光密度，在500nm下測定。重組氧化還原酶蛋白質(zhì)的產(chǎn)生通過以1mM的最終濃度添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)引發(fā)。誘導(dǎo)批料在25℃和220rpm下再培養(yǎng)15h。
取得的酶活性達(dá)到大約6000U/g的濕細(xì)胞質(zhì)量。
4.4根據(jù)本發(fā)明來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶在RB791大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)感受態(tài)大腸桿菌RB791細(xì)胞(Invitrogen)用為根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶編碼的表達(dá)構(gòu)造物pQE30-PC#12轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化的菌株在具有氨芐青霉素(50ig/ml)的LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)中培養(yǎng)直到達(dá)到0.5的光密度，在500nm下測定。重組氧化還原酶蛋白質(zhì)的產(chǎn)生通過以0.1mM的最終濃度添加IPTG引發(fā)。誘導(dǎo)批料在25℃和220rpm下再培養(yǎng)15小時。取得的酶活性達(dá)到大約1000U/g濕細(xì)胞質(zhì)量。
實(shí)施例5來自莢膜畢赤氏酵母的重組氧化還原酶的特征5.1最佳pH制備在表3中指明的緩沖液。各個緩沖液組分的濃度在每一種情況下達(dá)到50mM。
表3
測定批料(30℃)870μl 每一種在表3中提到的緩沖液體系20μlNADH 10mM(8.6mg/ml水)10μl稀釋酶培養(yǎng)持續(xù)大約2-3min，因此添加100μl底物溶液(100mM乙基-4-氯-3-氧代丁酸)。
為了測定最佳pH，在表3中指明的各個緩沖液中測定酶反應(yīng)。為了測定氧化反應(yīng)的最佳pH，NADH用作輔因子和(S)-甲基-3-羥基丁酸用作底物。為了根據(jù)本發(fā)明的酶，由此可以測定6.5-7為還原反應(yīng)的最佳pH和7.8-8.2為氧化反應(yīng)的最佳pH。
5.2pH穩(wěn)定性重組氧化還原酶的活性的測定通過貯存在表3中提到的緩沖液體系中檢查。為此目的，在4-11的pH范圍制備各種緩沖液(50mM)，并且用其稀釋根據(jù)實(shí)施例4制備的氧化還原酶。30，60和300min培養(yǎng)后，從批料中取出10μl并用于根據(jù)實(shí)施例1活性試驗(yàn)。
因此，初始值是測定值，其在磷酸鉀緩沖液50mM pH＝7.0中稀釋(1∶20)酶后立刻獲得。在給定的條件下，所說的值對應(yīng)大約0.70/min的滅絕變化并設(shè)定為100％值，并且所有以下的測定值與所說的值相關(guān)設(shè)定。
在這樣做的過程中，檢測到來自莢膜畢赤氏酵母的重組氧化還原酶在5.5-8.5的pH下是穩(wěn)定的并且可以在活性無任何實(shí)質(zhì)損失的情況下培養(yǎng)至少5h。在9.0以上和5.0以下的pH值下培養(yǎng)導(dǎo)致了酶的立刻失活。
5.3最佳溫度為了測定最佳試驗(yàn)溫度，在15℃-70℃的溫度范圍在標(biāo)準(zhǔn)測定批料中測定酶活性。正如在表4中可以看到的，酶在45℃下達(dá)到了它的最大活性，之后活性快速下降。
表4
5.4溫度穩(wěn)定性溫度穩(wěn)定性以在實(shí)施例5.2下描述的類似的方式在15℃-70℃的范圍測定。為此目的，1∶20稀釋的純化氧化還原酶在每一種情況下在各個溫度下培養(yǎng)60min和180min并隨后在30℃下用以上提到的試驗(yàn)批料測定。也在這種情況下，在磷酸鉀緩沖液50mM pH＝7.0中稀釋純化的氧化還原酶后立刻獲得的測定值用作初始值。所說的值在本實(shí)施例中也設(shè)定為100％值。
這里，酶在15℃-40℃的溫度范圍是完全穩(wěn)定的并3h的培養(yǎng)后未顯示任何活性損失。在55℃下，30分鐘后已經(jīng)不再能夠檢測到酶活性。
5.5底物譜/對映體過量根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的底物譜通過用多種酮，含氧酸和其酯測定酶活性來測定。為此目的，根據(jù)實(shí)施例5.1的標(biāo)準(zhǔn)測定批料和不同的底物一起使用。使用乙基-4-氯乙酰乙酸酯的活性等于100％并且所有的其它底物與其相關(guān)設(shè)定。
為了測定ee-值，使用下列的反應(yīng)批料用于所選擇的底物。
100μl NADH 50mM60μl 底物(100mM)+1-2U的根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶24小時后測定ee的批料用氯仿萃取并通過GC測定產(chǎn)生的醇的對映體過量。
表5
n.b.指未測定正如在表5中可以看到的，廣譜的2-和3-含氧酸酯和芳族和脂族酮由根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶對映體選擇性地還原。
5.5溶劑穩(wěn)定性在有機(jī)溶劑存在的條件下測定來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶酶的穩(wěn)定性。為此目的，在每一種情況下氧化還原酶用指明的溶劑混合物(在可水混溶的有機(jī)溶劑情況下)稀釋1∶20并且在室溫(20℃-24℃；RT)下培養(yǎng)。隨后，10μl酶溶液用于標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)批料。也在這種情況下，在緩沖液(磷酸鉀緩沖液(KPP)100mM，pH＝7.0)中稀釋后初始值等于100％，并且所有的其它值也與所說的初始值相關(guān)設(shè)定。
在可水混溶的有機(jī)溶劑情況下，稀釋同樣發(fā)生在磷酸鉀緩沖液中，向批料中添加相同體積的有機(jī)溶劑并且該批料在RT下在170rpm的熱混合器(thermomixer)中培養(yǎng)。活性由含水相測定。表6顯示了結(jié)果。
表6
EtOH代表乙醇；DSMO代表二甲基亞砜正如在表6中可以看到的，來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶對于有機(jī)溶劑顯示了驚人的穩(wěn)定性。和確立的學(xué)說形成對比，與在純的緩沖液中的培養(yǎng)相比較，根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶甚至在有機(jī)可水混溶的和不可水混溶的溶劑中是穩(wěn)定的。因此，正如在DE 101 19274 A1中描述根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶可以用于兩相體系。
5.7制備轉(zhuǎn)化5.7.1乙基-4-氯乙酰乙酸酯到乙基-(R)-4-氯-3-羥基丁酸的還原為了制備批料，34l緩沖液(100mM TEA，pH＝7，1mM ZnCl2，10％甘油)，4l異丙醇，4l 4-氯乙酰乙酸酯，4g NAD和3.6百萬U來自莢膜畢赤氏酵母的重組氧化還原酶在室溫下在恒定混合下培養(yǎng)24h。24h后，使用的99％的4-氯乙酰乙酸酯被還原。隨后，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合物，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑并蒸餾粗產(chǎn)物。以這種方式，回收2.8l(3.4kg)具有99％的對映體過量的乙基-(R)-4-氯-3-羥基丁酸。這對應(yīng)70％的產(chǎn)率，基于使用的原料的量。
5.7.2 2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-酮到(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-醇的還原為了制備批料，164ml緩沖液(100mM TEA，pH＝7,1mM ZnCl2，20％甘油)，16ml異丙醇，20g溶解于20ml甲基叔-丁基醚(MTBE)中的2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-酮，10mg NAD和20000U來自莢膜畢赤氏酵母的重組氧化還原酶在室溫下在恒定混合下培養(yǎng)24h。24h后，使用的96％的2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-酮被還原。隨后，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合物，并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑。以這種方式，回收15g具有100％的對映體過量的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-醇。這對應(yīng)77％的產(chǎn)率，基于使用的原料的量。
序列表<110>Juelich Enzyme Products GmbH<120>來自莢膜畢赤氏酵母的氧化還原酶<130>(TH)4090<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1175<212>DNA<213>莢膜畢赤氏酵母<400>1cgcggtggcg gccgctctag aactagtgga tcccccgggc tgcaggaatt cggcacgagg 60atctttctca actacaatgt ctgctctctc caaaacccag gccggttaca tcttcaagaa120gggtgccggt cacatcgtca aggccgaggt tccaatcccc aagccaactg gtgcccaatc180tcttcttagg gtcaaggctg caggaatgtg ccactctgac ttgcacgtca ttggagaaac240attggaggtc cctaccgatg ggtacgtgct cggtcacgaa attgctggtg aattggtgga300gatcggagac tcggtcaacc ctgaagtttt taaggtggga ggccgttatg ctgttcatgg360actgaattcg tgtggatcct gtgagatgtg tcgtaccggt catgacaatg actgtactgg420aaatgaatcg aaatggtacg gtctgggaat tagtggtggt taccagcagt acctgctggt480gccaaattcg caccatctat tgcctattcc agataacgtg tcctacgaag ttgctgctgc540cacctctgat gctgtcttga ctccatacca tgctatcaag aattccggag tgactccatc600ttctaaggtg ttgatgtttg gtctgggtgg tttgggatcg aacgcacttc agatcctcaa660ggcatttgga gcctatgtgg ttgccgttga tgtcaagccc gcatccaaag caattgccga720cgaattcaaa gcggatgaat tctataccga tatcagccaa tcttcttgga aaccagcctc780gtttgattac tgttttgact tcgtttcgct gcaggtcacc ttcgacatct gccagaagta840tatcaagtcc cacggtacca tcttcccagt gggtctgggc tcgagcaagc tgactttcga900cttgggaaac ctggcattgc gtgaagtaaa aattgttggt aacttctggg gtacttctca960
ggaacagatc gaagcaatgg agctggttag ctcgggtagg gtcaagcctc aagttcacac1020caccgaactt gaaaaccttc ctgaatcact tgaaaaactg gaggagggta agatcaatgg1080aagattggtt atgcttccat gatcacaaac tatttataac gagatacgag aaaaagttta1140atatgatgtc gtttttccaa tcaaaagggg ggccc 1175<210>2<211>366<212>PRT<213>人工的<400>2Ala Val Ala Ala Ala Leu Glu Leu Val Asp Pro Pro Gly Cys Arg Asn1 5 10 15Ser Ala Arg Gly Ser Phe Ser Thr Thr Met Ser Ala Leu Ser Lys Thr20 25 30Gln Ala Gly Tyr Ile Phe Lys Lys Gly Ala Gly His Ile Val Lys Ala35 40 45Glu Val Pro Ile Pro Lys Pro Thr Gly Ala Gln Ser Leu Leu Arg Val50 55 60Lys Ala Ala Gly Met Cys His Ser Asp Leu His Val Ile Gly Glu Thr65 70 75 80Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Tyr Val Leu Gly His Glu Ile Ala Gly85 90 95Glu Leu Val Glu Ile Gly Asp Ser Val Asn Pro Glu Val Phe Lys Val100 105 110
Gly Gly Arg Tyr Ala Val His Gly Leu Asn Ser Cys Gly Ser Cys Glu115 120 125Met Cys Arg Thr Gly His Asp Asn Asp Cys Thr Gly Asn Glu Ser Lys130 135 140Trp Tyr Gly Leu Gly Ile Ser Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Leu Leu Val145 150 155 160Pro Asn Ser His His Leu Leu Pro Ile Pro Asp Asn Val Ser Tyr Glu165 170 175Val Ala Ala Ala Thr Ser Asp Ala Val Leu Thr Pro Tyr His Ala Ile180 185 190Lys Asn Ser Gly Val Thr Pro Ser Ser Lys Val Leu Met Phe Gly Leu195 200 205Gly Gly Leu Gly Ser Asn Ala Leu Gln Ile Leu Lys Ala Phe Gly Ala210 215 220Tyr Val Val Ala Val Asp Val Lys Pro Ala Ser Lys Ala Ile Ala Asp225 230 235 240Glu Phe Lys Ala Asp Glu Phe Tyr Thr Asp Ile Ser Gln Ser Ser Trp245 250 255Lys Pro Ala Ser Phe Asp Tyr Cys Phe Asp Phe Val Ser Leu Gln Val260 265 270Thr Phe Asp Ile Cys Gln Lys Tyr Ile Lys Ser His Gly Thr Ile Phe275 280 285
Pro Val Gly Leu Gly Ser Ser Lys Leu Thr Phe Asp Leu Gly Asn Leu290 295 300Ala Leu Arg Glu Val Lys Ile Val Gly Asn Phe Trp Gly Thr Ser Gln305 310 315 320Glu Gln Ile Glu Ala Met Glu Leu Val Ser Ser Gly Arg Val Lys Pro325 330 335Gln Val His Thr Thr Glu Leu Glu Asn Leu Pro Glu Ser Leu Glu Lys340 345 350Leu Glu Glu Gly Lys Ile Asn Gly Arg Leu Val Met Leu Pro355 360 365<210>3<211>17<212>DNA<213>人工的<400>3gtaatacgac tataggg17<210>4<211>21<212>DNA<213>人工的<400>4caattaaccc tcactaaagg g 21<210>5<211>30<212>DNA<213>人工的<400>5
ggaattccat atgtctgctc tctccaaaac 30<210>6<211>32<212>DNA<213>人工的<400>6cactgcatgc tgatgtctgc tctctccaaa ac 32<210>7<211>31<212>DNA<213>人工的<400>7cccaagcttt catggaagca taaccaatct t31<210>8<211>1026<212>DNA<213>莢膜畢赤氏酵母<400>8atgtctgctc tctccaaaac ccaggccggt tacatcttca agaagggtgc cggtcacatc 60gtcaaggccg aggttccaat ccccaagcca actggtgccc aatctcttct tagggtcaag120gctgcaggaa tgtgccactc tgacttgcac gtcattggag aaacattgga ggtccctacc180gatgggtacg tgctcggtca cgaaattgct ggtgaattgg tggagatcgg agactcggtc240aaccctgaag tttttaaggt gggaggccgt tatgctgttc atggactgaa ttcgtgtgga300tcctgtgaga tgtgtcgtac cggtcatgac aatgactgta ctggaaatga atcgaaatgg360tacggtctgg gaattagtgg tggttaccag cagtacctgc tggtgccaaa ttcgcaccat420ctattgccta ttccagataa cgtgtcctac gaagttgctg ctgccacctc tgatgctgtc480ttgactccat accatgctat caagaattcc ggagtgactc catcttctaa ggtgttgatg540
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Asn Pro Glu Val Phe Lys Val Gly Gly Arg Tyr Ala Val His Gly Leu85 90 95Asn Ser Cys Gly Ser Cys Glu Met Cys Arg Thr Gly His Asp Asn Asp100 105 110Cys Thr Gly Asn Glu Ser Lys Trp Tyr Gly Leu Gly Ile Ser Gly Gly115 120 125Tyr Gln Gln Tyr Leu Leu Val Pro Asn Ser His His Leu Leu Pro Ile130 135 140Pro Asp Asn Val Ser Tyr Glu Val Ala Ala Ala Thr Ser Asp Ala Val145 150 155 160Leu Thr Pro Tyr His Ala Ile Lys Asn Ser Gly Val Thr Pro Ser Ser165 170 175Lys Val Leu Met Phe Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Asn Ala Leu Gln180 185 190Ile Leu Lys Ala Phe Gly Ala Tyr Val Val Ala Val Asp Val Lys Pro195 200 205Ala Ser Lys Ala Ile Ala Asp Glu Phe Lys Ala Asp Glu Phe Tyr Thr210 215 220Asp Ile Ser Gln Ser Ser Trp Lys Pro Ala Ser Phe Asp Tyr Cys Phe225 230 235 240Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Thr Phe Asp Ile Cys Gln Lys Tyr Ile245 250 255
Lys Ser His Gly Thr Ile Phe Pro Val Gly Leu Gly Ser Ser Lys Leu260 265 270Thr Phe Asp Leu Gly Asn Leu Ala Leu Arg Glu Val Lys Ile Val Gly275 280 285Asn Phe Trp Gly Thr Ser Gln Glu Gln Ile Glu Ala Met Glu Leu Val290 295 300Ser Ser Gly Arg Val Lys Pro Gln Val His Thr Thr Glu Leu Glu Asn305 310 315 320Leu Pro Glu Ser Leu Glu Lys Leu Glu Glu Gly Lys Ile Asn Gly Arg325 330 335Leu Val Met Leu Pro340<210>10<211>12<212>PRT<213>莢膜畢赤氏酵母<400>10Lys Thr Gln Ala Gly Tyr Ile Phe Lys Lys Gly Ala1 5 10
權(quán)利要求
1.氧化還原酶，特征在于在NADH和水存在的條件下其將羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的氧化還原酶，特征在于其可以從畢赤氏酵母屬或假絲酵母屬的酵母，特別是從莢膜畢赤氏酵母中獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的氧化還原酶，特征在于其具有根據(jù)SEQ IDNO8的DNA-序列和根據(jù)SEQ ID NO9的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，特征在于超過70％的氨基酸與氨基酸序列SEQ ID NO9是相同的并且其具有每mg蛋白質(zhì)超過1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸的反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的氧化還原酶，特征在于80％-99.5％，特別是90％-99.5％，更特別是99％-99.5％是與SEQ ID NO9的氨基酸序列相同的氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，特征在于與具有SEQ ID NO9的氨基酸序列的氧化還原酶相比其具有另外1-40個氨基酸或少1-40個氨基酸并且其具有每mg蛋白質(zhì)超過1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸的反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的氧化還原酶，特征在于比SEQ ID NO9的氨基酸序列中多或少存在1-25個氨基酸，特別是2-20個氨基酸，或3-10個氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，特征在于其具有SEQ ID NO9的氨基酸序列并且被可水溶聚合物改性一次，兩次，三次，四次或五次并且比活性達(dá)到每mg蛋白質(zhì)超過1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸的反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的氧化還原酶，特征在于可水溶聚合物是聚乙二醇。
10.蛋白質(zhì)片段，特征在于其代表氨基酸序列SEQ ID NO9的片段，每個片段具有5-30個數(shù)量的氨基酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10蛋白質(zhì)片段，特征在于該片段是SEQ ID NO9的片段，具有6-25個氨基酸，特別8-20個氨基酸或10-18個氨基酸，特別是氨基酸序列SEQ ID NO10的鏈長。
12.融合蛋白質(zhì)，特征在于其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO9或具有氨基酸序列SEQ ID NO9的片段的氧化還原酶，具有5-30個數(shù)量的通過肽鍵在N-端基或羧基-端基末端連結(jié)到進(jìn)一步的多肽上的氨基酸。
13.抗體，特征在于其特異性地結(jié)合到根據(jù)SEQ ID NO9或SEQ IDNO10的氧化還原酶上。
14.分離的核苷酸序列，其為根據(jù)SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的氧化還原酶編碼。
15.分離的氧化還原酶的DNA-序列，其在NADH和水存在的條件下催化羰基化合物到對應(yīng)的(S)-羥基化合物的還原，其中DNA-序列選自a)具有根據(jù)SEQ ID NO8，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6或SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA-序列，或其各個互補(bǔ)鏈，b)雜交一個或幾個根據(jù)a)的DNA-序列的DNA-序列或雜交其互補(bǔ)鏈的DNA-序列，雜交在嚴(yán)格的條件下發(fā)生，和c)DNA-序列，其由于遺傳密碼的簡并編碼通過一個或幾個根據(jù)a)或b)的DNA-序列編碼的蛋白質(zhì)。
16.分離的DNA序列，特征在于超過70％的核酸堿基與根據(jù)SEQID NO8的DNA-序列或與其互補(bǔ)鏈?zhǔn)窍嗤牟⑶移渚幋a氧化還原酶，該氧化還原酶具有每mg蛋白質(zhì)超過1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羥基丁酸的反應(yīng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的分離的DNA-序列，特征在于80％-99.5％，特別是90％-99.5％，更特別是99％-99.5％的核酸堿基與根據(jù)SEQ IDNO8的DNA-序列是相同的。
18.分離的DNA-序列，特征在于其是具有10-50個核酸堿基的核酸序列，該核酸序列具有對應(yīng)于根據(jù)SEQ ID NO8的DNA-序列的一部分或幾部分或?qū)?yīng)其互補(bǔ)鏈的序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的分離的DNA-序列，特征在于其是具有15-45個核酸堿基，特別是20-40個堿基或30-40個核酸堿基的核酸序列。
20.克隆載體，特征在于其包含一個或幾個根據(jù)權(quán)利要求14-19的核酸或DNA序列。
21.表達(dá)載體，特征在于其包含一個或幾個根據(jù)權(quán)利要求14-19的核酸或DNA序列并且以適當(dāng)?shù)姆绞竭B接到表達(dá)控制序列上。
22.宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌，酵母，昆蟲，植物或哺乳動物細(xì)胞并且已經(jīng)用根據(jù)權(quán)利要求21的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
23.羰基化合物選擇性還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物的方法，其特征在于a)在根據(jù)權(quán)利要求1-9的一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，和b)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，特征在于具有下式I的化合物用作羰基化合物R1-C(O)-R2(I)包含來自以下的R1部分1)-(C1-C20)-烷基，其中烷基是線性鏈的或分支的，2)-(C2-C20)-烯基，其中烯基是線性鏈的或分支的并包含一個，二個，三個或四個雙鍵，取決于鏈長，3)-(C2-C20)-炔基，其中炔基是線性鏈的或分支的并任選包含一個，二個，三個或四個三鍵，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(C1-C8)-烷基-(C6-C14-)-芳基，6)-(C5-C14)-雜環(huán)，其是未取代的或被鹵素，羥基，氨基或硝基取代一至三次，或7)-(C3-C7)-環(huán)烷基，其中在1)-7)下提到的R1部分是未取代的或彼此獨(dú)立地被以下基團(tuán)取代一，二或三次a)-OH，b)鹵素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2和包含來自以下的R2部分1)-(C1-C6)-烷基，其中烷基是線性鏈的或分支的，2)-(C2-C6)-烯基，其中烯基是線性鏈的或分支的并包含一個，二個或三個雙鍵，取決于鏈長，3)-(C2-C6)-炔基，其中炔基是線性鏈的或分支的并任選包含一個或二個三鍵，4)-(C0-C10)-烷基-C(O)-O-(C1-C6)-烷基，其中烷基是線性的或分支的并且是未取代的或被鹵素，羥基，氨基或硝基取代一至三次，其中在1)-4)下提到的R2部分是未取代的或彼此獨(dú)立地被以下基團(tuán)取代一，二或三次a)-OH，b)鹵素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，特征在于a)在根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，b)通過氧化還原酶形成的NAD用共底物還原成NADH，和c)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，特征在于a)在根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，b)通過氧化還原酶形成的NAD用脫氫酶和共底物還原成NADH，和c)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，特征在于a)在根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，b)在有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行該反應(yīng)，和c)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，特征在于a)在根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，b)在有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行該反應(yīng)，c)通過氧化還原酶形成的NAD用共底物還原成NADH，和d)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，特征在于a)在根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NADH和水存在的條件下羰基化合物還原成對應(yīng)的(S)-羥基化合物，b)通過氧化還原酶形成的NAD同時用脫氫酶和共底物還原成NADH，c)在有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行該反應(yīng)，和d)分離形成的手性(S)-羥基化合物。
30.根據(jù)權(quán)利要求25，26，28或29的方法，特征在于用作共底物的是乙醇，2-丙醇，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。
31.根據(jù)權(quán)利要求26或29的方法，特征在于來自博伊丁氏假絲酵母或近平滑假絲酵母的面包酵母用作脫氫酶。
32.根據(jù)權(quán)利要求26或29的方法，特征在于依賴于NADH的甲酸脫氫酶用作脫氫酶并且甲酸的鹽，例如甲酸銨，甲酸鈉或甲酸鈣用作共底物。
33.根據(jù)權(quán)利要求27或29的方法，特征在于乙醚，叔丁基甲基醚，二異丙基醚，二丁基醚，乙酸丁酯，庚烷，己烷或環(huán)己烷用作有機(jī)溶劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求27或29的方法，特征在于有機(jī)相占總反應(yīng)體積的5％-80％，優(yōu)選10％-40％。
35.具有下式II的手性(R)-羥基化合物的回收方法，R1-C(OH)-R2 (II)其包含來自以下的R1部分1)-(C1-C20)-烷基，其中烷基是線性鏈的或分支的，2)-(C2-C20)-烯基，其中烯基是線性鏈的或分支的并包含一個，二個，三個或四個雙鍵，取決于鏈長，3)-(C2-C20)-炔基，其中炔基是線性鏈的或分支的并任選包含一個，二個，三個或四個三鍵，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(C1-C8)-烷基-(C6-C14-)-芳基，6)-(C5-C14)-雜環(huán)，其是未取代的或被鹵素，羥基，氨基或硝基取代一至三次，或7)-(C3-C7)-環(huán)烷基，其中在1)-7)下提到的R1部分是未取代的或彼此獨(dú)立地被以下基團(tuán)取代一，二或三次a)-OH，b)鹵素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2和包含來自以下的R2部分1)-(C1-C6)-烷基，其中烷基是線性鏈的或分支的，2)-(C2-C6)-烯基，其中烯基是線性鏈的或分支的并包含一個，二個或三個雙鍵，取決于鏈長，3)-(C2-C6)-炔基，其中炔基是線性鏈的或分支的并任選包含一個或二個三鍵，4)-(C0-C10)-烷基-C(O)-O-(C1-C6)-烷基，其中烷基是線性的或分支的并且是未取代的或被鹵素，羥基，氨基或硝基取代一至三次，其中在1)-4)下提到的R1部分是未取代的或彼此獨(dú)立地被以下基團(tuán)取代一，二或三次a)-OH，b)鹵素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2，特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NAD和水培養(yǎng)，和b)分離殘余的具有式II的手性(R)-羥基化合物。
36.根據(jù)權(quán)利要求35具有式II的手性(R)-羥基化合物的回收方法，特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NAD和水培養(yǎng)，b)通過氧化還原酶形成的NADH用共底物氧化成NAD，和c)分離殘余的具有式II的手性(R)-羥基化合物。
37.根據(jù)權(quán)利要求35具有式II的手性(R)-羥基化合物的回收方法，特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NAD和水培養(yǎng)，b)通過氧化還原酶形成的NADH用脫氫酶和共底物氧化成NAD，和c)分離殘余的具有式II的手性(R)-羥基化合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求35具有式II的手性(R)-羥基化合物的回收方法，特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NAD和水培養(yǎng)，b)在有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行該反應(yīng)，和c)分離殘余的具有式II的手性(R)-羥基化合物。
39.根據(jù)權(quán)利要求35具有式II的手性(R)-羥基化合物的回收方法，特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或幾項(xiàng)的氧化還原酶，NAD和水培養(yǎng)，b)在有機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行該反應(yīng)，c)通過氧化還原酶形成的NADH用脫氫酶和共底物氧化成NAD，和d)分離殘余的具有式II的手性(R)-羥基化合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求36，37或39的方法，特征在于丙酮用作共底物。
全文摘要
本發(fā)明涉及由畢赤氏酵母屬的酵母，更特別的由莢膜畢赤氏酵母獲得的依賴于NADH的氧化還原酶。所說的氧化還原酶之后用于有機(jī)酮化合物到對應(yīng)的(S)－羥基化合物的對映體選擇性還原的酶促方法和用于在兩相體系中使用來自莢膜畢赤氏酵母的分離的，重組過表達(dá)的氧化還原酶對映體選擇性制備(S)－羥基化合物的酶促方法。
文檔編號C07K16/40GK1839153SQ200480023830
公開日2006年9月27日 申請日期2004年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日
發(fā)明者A·吉普塔, A·齊默, M·博布科瓦 申請人:Iep 有限責(zé)任公司