本發(fā)明屬于分子免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2的單克隆抗體及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，VEGFR2)是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子的受體，又稱作KDR或FLK1。目前發(fā)現(xiàn)的VEGFR主要有5種：VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、NP-1和NP-2，其中VEGFR-1和VEGFR2主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，VEGFR3主要存在于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。NP-1和NP-2不僅在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，還表達(dá)于某些腫瘤細(xì)胞內(nèi)。但VEGF促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等生物活性的發(fā)揮主要是通過與VEGFR2結(jié)合實(shí)現(xiàn)。新生血管的形成在人類的多種疾病中發(fā)揮重要作用，如視網(wǎng)膜病變、關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位癥等。腫瘤的生長(zhǎng)通常也會(huì)伴隨著新生血管的形成，早在1971年，J.Folkman就提出可通過阻斷腫瘤血管的生成來抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，近年來，研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的惡性腫瘤如前列腺癌、肝癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌等，其發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其受體家族相關(guān)，因此，以VEGF及其受體為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療再次受到關(guān)注，在受體家族中，以對(duì)VEGFR-2為靶點(diǎn)的研究最為廣泛。單克隆抗體以其特異性強(qiáng)、安全性高和效果好等優(yōu)點(diǎn)成為此類抗腫瘤藥物開發(fā)的首選。美國(guó)禮來公司研發(fā)的Cyramza(Ramucirumab)即是一種阻斷KDR功能的單克隆抗腫瘤藥物。2014年4月美國(guó)FDA批準(zhǔn)Cyramza治療經(jīng)一線化療(包含鉑類或氟尿嘧啶類藥物)疾病進(jìn)展的晚期或轉(zhuǎn)移性胃或胃食管結(jié)合部腺癌患者。Cyramza成為美國(guó)FDA首個(gè)被批準(zhǔn)治療此類患者的藥物。目前乳腺癌、大腸癌、肝癌、肺癌也已處于III期臨床試驗(yàn)階段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一類抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2的單克隆抗體及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明的抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2的單克隆抗體，其特征在于，包括重鏈和輕鏈，重鏈包括重鏈恒定區(qū)和重鏈可變區(qū)，輕鏈包括輕鏈恒定區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述的重鏈恒定區(qū)為小鼠抗體的重鏈恒定區(qū)或人抗體的重鏈恒定區(qū)，所述的輕鏈恒定區(qū)為小鼠抗體的輕鏈恒定區(qū)或人抗體的輕鏈恒定區(qū)；所述的重鏈可變區(qū)為蛋白PCABH、H3、H6、H11、H14或H15中的任意一種，所述的輕鏈可變區(qū)為蛋白PCABL、L3、L5、L7、L8、L11或L14中的任意一種；所述的蛋白PCABH的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示，所述的蛋白L3的氨基酸序列如SEQIDNO:24所示，所述的蛋白L5的氨基酸序列如SEQIDNO:26所示，所述的蛋白L7的氨基酸序列如SEQIDNO:28所示，所述的蛋白L8的氨基酸序列如SEQIDNO:30所示，所述的蛋白L11的氨基酸序列如SEQIDNO:32所示，所述的蛋白L14的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示，所述的蛋白H3的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，所述的蛋白H6的氨基酸序列如SEQIDNO:14所示，所述的蛋白H11的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示，所述的蛋白H14的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示，所述的蛋白H15的VH氨基酸序列如SEQIDNO:20所示，所述的蛋白PCABL的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示。優(yōu)選，所述的重鏈可變區(qū)為蛋白PCABH，所述的輕鏈可變區(qū)為蛋白L3、L5、L7、L8、L11或L14中的任意一種；或所述的重鏈可變區(qū)為蛋白H3、H6、H11、H14或H15中的任意一種，所述的輕鏈可變區(qū)為蛋白PCABL。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的重鏈可變區(qū)為蛋白PCABH，所述的輕鏈可變區(qū)為蛋白L3、L5或L14中的任意一種；或所述的重鏈可變區(qū)為蛋白H14，所述的輕鏈可變區(qū)為蛋白PCABL。這些單克隆抗體在與抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2結(jié)合時(shí)體現(xiàn)出了大大好于上市抗體的解離速率。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的重鏈可變區(qū)為蛋白PCABH，所述的輕鏈可變區(qū)為蛋白L3、L5、L7、L8或L14中的任意一種；或所述的重鏈可變區(qū)為蛋白H3、H11或H15中的任意一種，所述的輕鏈可變區(qū)為蛋白PCABL。這些單克隆抗體抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖的效果大大好于上市抗體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼上述抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2的單克隆抗體的基因。優(yōu)選，所述的編碼蛋白PCABH的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:7所示，所述的編碼蛋白L3的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:23所示，所述的編碼蛋白L5的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:25所示，所述的編碼蛋白L7的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:27所示，所述的編碼蛋白L8的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:29所示，所述的編碼蛋白L11的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:31所示，所述的編碼蛋白L14的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:9所示，所述的編碼蛋白PCABL的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:21所示，所述的編碼蛋白H3的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:11所示，所述的編碼蛋白H6的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:13所示，所述的編碼蛋白H11的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:15所示，所述的編碼蛋白H14的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:17所示，所述的編碼蛋白H15的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:19所示。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種單克隆抗體偶聯(lián)物，其特征在于，包括上述任意一種抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2的單克隆抗體以及與其偶聯(lián)的偶聯(lián)部分，所述的偶聯(lián)部分選自放射性核素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、酶、熒光素和生物素中的一種或多種。進(jìn)一步優(yōu)選，所述偶聯(lián)部分為蓖麻毒素。更進(jìn)一步優(yōu)選，所述偶聯(lián)部分為蓖麻毒素A鏈。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2的單克隆抗體或上述單克隆抗體偶聯(lián)物在制備與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2特異性結(jié)合，從而阻斷VEGF與VEGFR2結(jié)合的藥物中的應(yīng)用。所述的藥物為預(yù)防和/或治療和/或輔助治療腫瘤的藥物。所述的腫瘤選自直結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、惡性膠質(zhì)瘤和腎癌。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2特異性結(jié)合，從而阻斷VEGF與VEGFR2結(jié)合的藥物，其特征在于，包括上述抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2的單克隆抗體或上述單克隆抗體偶聯(lián)物作為活性成份和藥學(xué)上可以接受的載體或輔料。所述的藥物為預(yù)防和/或治療和/或輔助治療腫瘤的藥物。所述的腫瘤選自直結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、惡性膠質(zhì)瘤和腎癌。本發(fā)明新發(fā)現(xiàn)了一類抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2的單克隆抗體及其編碼基因，這些單克隆抗體能夠特異的與VEGFR2結(jié)合，并且十分有效的阻斷VEGF與VEGFR2的結(jié)合；細(xì)胞生物學(xué)活性分析表明，本發(fā)明的抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2的單克隆抗體對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。因此，可以將本發(fā)明的抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2的單克隆抗體應(yīng)用于制備阻斷VEGFR2功能的藥物，從而成為一種抗腫瘤的新藥物。附圖說明圖1是VEGF-his的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，從左至右的泳道樣品及其上樣量依次為：Reduced：還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；Non-reduced：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；BSA，1μg；Marker，10μl。圖2是VEGFR2ECD-TEV-mFc的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，從左至右的泳道樣品及其上樣量依次為：Non-reduced：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；Reduced：還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；Marker，10μl；BSA，1μg。圖3是VEGFR2候選抗體的PCABHL3的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，從左至右的泳道樣品及其上樣量依次為：Non-reduced：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；Reduced：還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；Marker，10μl；BSA，1μg。圖4是VEGFR2ECD-TEV-hFc的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，從左至右的泳道樣品及其上樣量依次為：Non-reduced：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；Reduced：還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；Marker，5μl；BSA，1μg。圖5是11個(gè)人源抗體與抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc的結(jié)合活性。圖6是11個(gè)人源抗體阻斷VEGF-His與生物素標(biāo)記的VEGFR2ECD-TEV-mFc的結(jié)合。圖7是9個(gè)人源抗體與抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc的分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析，HL3、HL5、HL7、HL11、HL14、H3L、H6L、H11L、H14L和PCAB分別表示抗體PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL11、PCABHL14、H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL和PCABHPCABL。圖8是另外2個(gè)人源抗體與抗原VEGFR2ECD-hFc的分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析，HL8、H15L和PCAB分別表示抗體PCABHL8、PCABH15L和PCABHPCABL。圖9是不同濃度VEGF誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞增殖的效果。圖10是11個(gè)人源抗體對(duì)VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制效果，在處理階段，空白組不加其他任何物質(zhì)，20nMVEGF組加入終濃度為20nM的VEGF，PcAb、HL14、HL3、HL5、HL7、HL8、HL11、H3L、H6L、H11L、H14L、H15L組加入終濃度為20nM的VEGF，同時(shí)分別加入三個(gè)不同濃度(1μg/ml、5μg/ml和25μg/ml)的對(duì)應(yīng)的單克隆抗體PCABHPCABL、PCABHL14、PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL11、H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL或H15PCABL。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市場(chǎng)購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1：人源VEGF-his6融合蛋白的設(shè)計(jì)和制備1.基因VEGF-his6的合成對(duì)人源VEGF(NCBIReferenceSequence:NP_001020539.2)氨基酸序列與his6進(jìn)行融合設(shè)計(jì)。將獲得的融合蛋白VEGF-his6所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(如SEQIDNO:1所示)進(jìn)行DNA密碼子使用頻率優(yōu)化，并委托金斯瑞生物科技有限公司(以下簡(jiǎn)稱金斯瑞公司)合成優(yōu)化后的相對(duì)應(yīng)的融合蛋白基因VEGF-his6，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2.pcDNA3.1-VEGF-his6質(zhì)粒的獲得2.1由金斯瑞公司將合成的VEGF-his6融合基因(SEQIDNO:2)利用EcoRV平末端插入到pUC57simple(金斯瑞公司提供)載體中，獲得pUC57simple-VEGF-his6質(zhì)粒。2.2將質(zhì)粒pUC57simple-VEGF-his6進(jìn)行酶切后(XbaI和BamHI)，電泳回收得到的融合基因片段VEGF-his6并與pcDNA3.1載體進(jìn)行連接反應(yīng)，重組構(gòu)建獲得pcDNA3.1-VEGF-his6(pcDNA3.1表達(dá)載體購(gòu)自Invitrogen公司)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌(購(gòu)自TIANGEN公司)并篩選得到陽性的pcDNA3.1-VEGF-his6克隆菌落，按照常規(guī)方法擴(kuò)增大腸桿菌，然后采用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自TIANGEN公司，操作步驟參照試劑盒說明書)提取獲得pcDNA3.1-VEGF-his6重組質(zhì)粒。3.融合蛋白VEGF-his6的表達(dá)、純化將上面構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VEGF-his6分別轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞(購(gòu)自Invitrogen公司)7天后，將培養(yǎng)液進(jìn)行高速離心、微孔濾膜抽真空過濾，根據(jù)廠家提供的操作方法采用HisTrapHP柱(購(gòu)自GE公司)，使用蛋白純化液相色譜系統(tǒng)(AKTAPurifier10，GE)進(jìn)行純化，純化后的蛋白分別加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液和非還原型蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，還原型蛋白樣品在20kD處，非還原型蛋白樣品在40kD處，如圖1所示。還原型電泳條帶與理論大小符合，由此得到純化的人源VEGF-his6融合蛋白。實(shí)施例2：VEGFR2ECD-TEV-mFc蛋白的表達(dá)和純化1.基因VEGFR2ECD-TEV-mFc的合成將人源VEGFR2(NCBIReferenceSequence:NM_002253.2)ECD(胞外區(qū))部分的氨基酸序列與TEV-mFc進(jìn)行融合設(shè)計(jì)。將獲得的融合蛋白所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(如SEQIDNO:3所示)進(jìn)行DNA密碼子使用頻率優(yōu)化，并委托金斯瑞公司合成優(yōu)化后的相對(duì)應(yīng)的融合蛋白基因VEGFR2ECD-TEV-mFc，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。2.pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc質(zhì)粒的獲得2.1由金斯瑞公司將合成的VEGFR2ECD-TEV-mFc融合基因(SEQIDNO:4)利用EcoRV平末端插入到pUC57simple(金斯瑞公司提供)載體中，獲得pUC57simple-VEGFR2ECD-TEV-mFc質(zhì)粒。2.2將質(zhì)粒pUC57simple-VEGFR2ECD-TEV-mFc進(jìn)行酶切(XbaI和BamHI)后，電泳回收得到的融合基因片段VEGFR2ECD-TEV-mFc并與pcDNA3.1載體進(jìn)行連接反應(yīng)，重組構(gòu)建獲得pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc(pcDNA3.1表達(dá)載體購(gòu)自Invitrogen公司)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌(購(gòu)自TIANGEN公司)并篩選得到陽性的pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc克隆菌落，按照常規(guī)方法擴(kuò)增大腸桿菌，然后采用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自TIANGEN公司，操作步驟參照試劑盒說明書)提取獲得pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc重組質(zhì)粒。3.融合蛋白VEGFR2ECD-TEV-mFc的表達(dá)、純化將上面構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-mFc分別轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞(購(gòu)自Invitrogen公司)7天后，將培養(yǎng)液進(jìn)行高速離心、微孔濾膜抽真空過濾，根據(jù)廠家提供的操作方法采用HiTrapProteinAHP柱(購(gòu)自GE公司)，使用蛋白純化液相色譜系統(tǒng)(AKTAPurifier10，GE)進(jìn)行純化，純化后的蛋白分別加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液和非還原型蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，還原型蛋白樣品在125kD處，如圖2所示。與理論大小符合，由此得到純化的人源VEGFR2ECD-TEV-mFc融合蛋白。實(shí)施例3：VEGFR2ECD-TEV-hFc蛋白的表達(dá)和純化1.基因VEGFR2ECD-TEV-hFc的合成將人源VEGFR2(NCBIReferenceSequence:NM_002253.2)ECD(胞外區(qū))部分的氨基酸序列與TEV-hFc進(jìn)行融合設(shè)計(jì)。將獲得的融合蛋白所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(如SEQIDNO:5所示)進(jìn)行DNA密碼子使用頻率優(yōu)化，并委托金斯瑞公司合成優(yōu)化后的相對(duì)應(yīng)的融合蛋白基因VEGFR2ECD-TEV-hFc，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。2.pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc質(zhì)粒的獲得2.1由金斯瑞公司將合成的VEGFR2ECD-TEV-hFc融合基因(SEQIDNO:6)利用EcoRV平末端插入到pUC57simple(金斯瑞公司提供)載體中，獲得pUC57simple-VEGFR2ECD-TEV-hFc質(zhì)粒。2.2將質(zhì)粒pUC57simple-VEGFR2ECD-TEV-hFc進(jìn)行酶切(XbaI和BamHI)后，電泳回收得到的融合基因片段VEGFR2ECD-TEV-hFc并與pcDNA3.1載體進(jìn)行連接反應(yīng)，重組構(gòu)建獲得pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc(pcDNA3.1表達(dá)載體購(gòu)自Invitrogen公司)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌(購(gòu)自TIANGEN公司)并篩選得到陽性的pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc克隆菌落，按照常規(guī)方法擴(kuò)增大腸桿菌，然后采用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自TIANGEN公司，操作步驟參照試劑盒說明書)提取獲得pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc重組質(zhì)粒。3.融合蛋白VEGFR2ECD-TEV-hFc的表達(dá)、純化將上面構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VEGFR2ECD-TEV-hFc分別轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞(購(gòu)自Invitrogen公司)7天后，將培養(yǎng)液進(jìn)行高速離心、微孔濾膜抽真空過濾，根據(jù)廠家提供的操作方法采用HiTrapProteinAHP柱(購(gòu)自GE公司)，使用蛋白純化液相色譜系統(tǒng)(AKTAPurifier10，GE)進(jìn)行純化，純化后的蛋白分別加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液和非還原型蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，非還原型蛋白樣品在125kD處，還原型蛋白樣品在125kD處，如圖4所示。與理論大小符合，由此得到純化的人源VEGFR2ECD-TEV-hFc融合蛋白。實(shí)施例4：候選抗體重鏈和輕鏈序列的設(shè)計(jì)、表達(dá)和純化1.抗體的設(shè)計(jì)本發(fā)明人根據(jù)已有的VEGFR2蛋白序列(SEQIDNO:3)及其蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)等，創(chuàng)造性地人工設(shè)計(jì)了一系列的抗體序列。通過大量的篩選和檢測(cè)，最終得到了多個(gè)與VEGFR2特異性結(jié)合的單克隆抗體：PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL11、PCABHL14、H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL、H15PCABL。上述單克隆抗體：PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL11、PCABHL14、H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL、H15PCABL包括重鏈和輕鏈，重鏈包括重鏈恒定區(qū)和重鏈可變區(qū)，輕鏈包括輕鏈恒定區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述的重鏈恒定區(qū)為人抗體的重鏈恒定區(qū)，所述的輕鏈恒定區(qū)為人抗體的重鏈恒定區(qū)。各個(gè)單克隆抗體只是可變區(qū)不同。具體如下：?jiǎn)慰寺】贵wPCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL11、PCABHL14，其重鏈可變區(qū)都為蛋白PCABH，輕鏈可變區(qū)分別為蛋白L3、L5、L7、L8、L11和L14。單克隆抗體H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL、H15PCABL，其重鏈可變區(qū)分別為蛋白H3、H6、H11、H14、H15，輕鏈可變區(qū)都為蛋白PCABL。所述的PCABH的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:7所示。蛋白H3的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:11所示。蛋白H6的氨基酸序列如SEQIDNO:14所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:13所示。蛋白H11的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:15所示。蛋白H14的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:17所示。蛋白H15的氨基酸序列如SEQIDNO:20所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:19所示。蛋白PCABL的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:21所示。蛋白L3的氨基酸序列如SEQIDNO:24所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:23所示。蛋白L5的氨基酸序列如SEQIDNO:26所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:25所示。蛋白L7的氨基酸序列如SEQIDNO:28所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:27所示。蛋白L8的氨基酸序列如SEQIDNO:30所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:29所示。蛋白L11的氨基酸序列如SEQIDNO:32所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:31所示。蛋白L14的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示，其編碼基因的DNA序列如SEQIDNO:9所示。2.抗體的表達(dá)和純化將候選單克隆抗體的重鏈編碼基因的DNA序列(包括恒定區(qū)和可變區(qū)，其中的可變區(qū)編碼序列如SEQIDNO：7、11、13、15、17、19所示)和輕鏈編碼基因的的DNA序列(包括恒定區(qū)和可變區(qū)，其中的可變區(qū)編碼序列如SEQIDNO：21、23、25、27、29、31、9所示)分別克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)載體中，分別獲得pUC57simple-PCABH，，pUC57simple-H3，pUC57simple-H6，pUC57simple-H11，pUC57simple-H14，pUC57simple-H15和pUC57simple-PCABL，pUC57simple-L3，pUC57simple-L5，pUC57simple-L7，pUC57simple-L8，pUC57simple-L11，pUC57simple-L14質(zhì)粒。分別將以上質(zhì)粒進(jìn)行酶切(HindIII&EcoRI)，電泳回收得到的重鏈、輕鏈分別亞克隆到表達(dá)載體pcDNA3.1中(購(gòu)自Invitrogen公司)，提取重組質(zhì)粒，按pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-PCABL，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L3，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L5，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L7，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L8，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L11，pcDNA3.1-PCABH+pcDNA3.1-L14，pcDNA3.1-H3+pcDNA3.1-PCABL，pcDNA3.1-H6+pcDNA3.1-PCABL，pcDNA3.1-H11+pcDNA3.1-PCABL，pcDNA3.1-H14+pcDNA3.1-PCABL，pcDNA3.1-H15+pcDNA3.1-PCABL進(jìn)行組合共轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)7天后，將培養(yǎng)液通過高速離心、上清濃縮后上樣至HiTrapMabSelectSuRe柱，使用蛋白純化液相色譜系統(tǒng)(AKTAPurifier10，GE)進(jìn)行純化。將純化后的樣品(此處以抗體PCABHL3為例)分別加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液和非還原型蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，還原型蛋白樣品目標(biāo)蛋白在45kD和30KD處，非還原型蛋白樣品(單個(gè)抗體)目標(biāo)蛋白在150kD處，如圖3所示。與理論大小符合，由此得到純化的單克隆抗體。實(shí)施例5：11個(gè)人源抗體與抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc的結(jié)合活性分析1.采用ELISA夾心法分別測(cè)定人源抗體與抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc(實(shí)施例2制備)的結(jié)合活性每孔加50μl2μg/mlGoatAntiMouseFc(羊抗鼠Fc，Jackson，貨號(hào)：115-005-071)包被酶標(biāo)板4℃過夜，將包被的酶標(biāo)板用磷酸緩沖鹽溶液溶解的1％BSA37℃封閉2小時(shí)，PBST洗滌1次后甩干，每孔加入50μl1μg/ml的VEGFR2ECD-TEV-mFc于37℃預(yù)孵育30min，PBST洗滌3次后甩干，每孔分別加入100μl從0.333μg/ml(終濃度0.001μg/ml)起作1:3梯度稀釋的11個(gè)人源抗體：PCABHL3，PCABHL5，PCABHL7，PCABHL8，PCABHL11，PCABHL14，H3PCABL，H6PCABL，H11PCABL，H14PCABL，H15PCABL(實(shí)施例4制備)，共6個(gè)抗體梯度濃度組，第7和8組加稀釋緩沖液做空白對(duì)照，37℃孵育30min，每孔加入50μlHRP標(biāo)記羊抗人IgG二抗(1:5000)(Jackson，貨號(hào)：109-035-088)，用TMB(Neogen，貨號(hào)：308177)進(jìn)行顯色反應(yīng)5min，并在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450nm波長(zhǎng)吸光度，吸光度檢測(cè)結(jié)果見表1。表1ELISA夾心法測(cè)定11個(gè)人源抗體與抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc的結(jié)合活性結(jié)果根據(jù)表1結(jié)果，以抗體濃度(nM)為橫坐標(biāo)，以450nm波長(zhǎng)吸光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，作4-parameter曲線回歸擬合圖，結(jié)果圖5所示。由圖5可見，11個(gè)人源抗體均能有效地結(jié)合VEGFR2ECD-TEV-mFc蛋白，并且其結(jié)合效率呈劑量依賴關(guān)系。通過對(duì)結(jié)合的不同濃度的人源抗體進(jìn)行吸光強(qiáng)度定量分析，曲線模擬得到結(jié)合效率EC50，如表2所示。表2ELISA夾心法分析人源抗體與抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc的結(jié)合效率EC50抗體EC50(nM)PCABHL30.034PCABHL50.030PCABHL70.034PCABHL80.070PCABHL110.038PCABHL140.026H3PCABL0.044H6PCABL0.043H11PCABL0.037H14PCABL0.046H15PCABL0.048表2結(jié)果表明，11個(gè)人源抗體均能有效地結(jié)合抗原VEGFR2ECD-TEV-mFc。2.采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定11個(gè)人源抗體阻斷VEGF-His6與生物素標(biāo)記的VEGFR2ECD-TEV-mFc的結(jié)合用VEGF-His6(實(shí)施例1制得)包被酶標(biāo)板4℃過夜，用磷酸緩沖鹽溶液溶解的1％BSA37℃封閉2小時(shí)，PBST洗滌1次后甩干作為樣品板。提前預(yù)備稀釋板：將磷酸緩沖鹽溶液溶解的1％BSA以每孔300μl加入到新的酶標(biāo)板中，37℃孵育2小時(shí)，PBST洗滌3次后甩干作為稀釋板。在稀釋板中分別將11個(gè)人源抗體：PCABHL3，PCABHL5，PCABHL7，PCABHL8，PCABHL11，PCAbHL14，H3PCABL，H6PCABL，H11PCABL，H14PCABL，H15PCABL(實(shí)施例4制備)，從1μg/ml(終濃度0.001μg/ml)起作1:3梯度稀釋7個(gè)組，第8組加稀釋緩沖液做空白對(duì)照，每孔準(zhǔn)備60μl，分別同60μl的0.04μg/ml的生物素標(biāo)記的VEGFR2ECD-TEV-mFc在稀釋板中進(jìn)行抗原抗體混合，混勻后室溫靜置15分鐘后轉(zhuǎn)移至樣品板中，每孔轉(zhuǎn)移100μl抗原抗體混合液。37℃孵育30分鐘后用PBST洗滌3次后甩干，加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素(KPL，貨號(hào)：14-30-00)37℃孵育30分鐘。PBST洗滌4次后甩干，每孔加入50μl的TMB(Neogen，貨號(hào)：308177)進(jìn)行顯色，室溫遮光反應(yīng)5分鐘。每孔加入50μl的終止液終止反應(yīng)并迅速在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450nm的吸光值，檢測(cè)結(jié)果見表3。表3檢測(cè)11個(gè)人源抗體阻斷VEGF-His與生物素標(biāo)記的VEGFR2ECD-TEV-mFc的結(jié)合結(jié)果通過對(duì)結(jié)合的不同濃度的人源抗體進(jìn)行吸光強(qiáng)度定量分析，曲線模擬得到結(jié)合效率EC50，如表4所示。由圖6可見，11個(gè)人源抗體均能有效地阻斷VEGFR2ECD-TEV-mFc蛋白與VEGF-His的結(jié)合，并且其阻斷兩者結(jié)合的效率呈劑量依賴關(guān)系。通過對(duì)VEGFR2ECD-TEV-mFc蛋白與VEGF-His的結(jié)合進(jìn)行吸光強(qiáng)度定量分析，曲線模擬得到11個(gè)人源抗體阻斷兩者結(jié)合效率EC50，結(jié)果見表4。表411個(gè)人源抗體阻斷VEGF-His與生物素標(biāo)記的VEGFR2ECD-TEV-mFc的結(jié)合EC50抗體EC50(nM)PCABHL30.236PCABHL50.162PCABHL70.213PCABHL80.568PCABHL110.385PCABHL140.245H3PCABL0.228H6PCABL0.285H11PCABL0.288H14PCABL0.222H15PCABL0.444表4結(jié)果表明，11個(gè)人源抗體通過與生物素標(biāo)記的VEGFR2ECD-TEV-mFc結(jié)合，能有效地阻斷其與VEGF-His的結(jié)合，并且阻斷效率呈劑量依賴關(guān)系。實(shí)施例6：分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析使用Fortebio分子相互作用儀測(cè)定抗體9個(gè)人源抗體與抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc的分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)圖譜參數(shù)?？乖璙EGFR2ECD-TEV-hFc的產(chǎn)生參見實(shí)施例3。采用氨基偶聯(lián)的方式固化抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc于AR2G傳感器表面，經(jīng)乙醇胺封閉，于PBST中平衡后，與人源抗體結(jié)合，人源抗體濃度從200nM往下三倍稀釋，于PBST中解離。分兩批共檢測(cè)了11個(gè)人源抗體與抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。其中9個(gè)抗體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表5，2個(gè)抗體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表6，對(duì)應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)檢測(cè)結(jié)果分別如圖7和圖8所示。表59個(gè)人源抗體與抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)AbNameKD(M)kon(1/Ms)konErrorkdis(1/s)kdisErrorRmaxRangePCABHL32.25E-115.81E+051.38E+041.31E-051.08E-050.0997-0.2354PCABHL52.88E-115.04E+051.71E+041.45E-051.43E-050.0912-0.1504PCABHL72.33E-111.34E+064.39E+043.12E-051.42E-050.0331-0.1512PCABHL116.20E-114.81E+051.28E+042.98E-051.13E-050.0994-0.1818PCABHL144.37E-115.77E+051.37E+042.52E-059.86E-060.0882-0.1523H3PCABL6.93E-116.82E+053.02E+044.73E-051.94E-050.0917-0.179H6PCABL6.36E-117.97E+053.05E+045.06E-051.50E-050.0499-0.1309H11PCABL8.45E-114.78E+051.56E+044.04E-051.30E-050.0683-0.2197H14PCABL3.14E-116.39E+052.48E+042.00E-051.75E-050.0247-0.1268PCABHPCABL4.93E-111.02E+062.70E+045.03E-059.79E-060.0011-0.1457(KD為親和力常數(shù)；kon為抗原抗體結(jié)合速率；kdis為抗原抗體解離速率；KD＝kdis/kon。)表6另外2個(gè)人源抗體與抗原VEGFR2ECD-TEV-hFc結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)AbNameKD(M)kon(1/Ms)konErrorkdis(1/s)kdisErrorRmaxRangePCABHL84.43E-114.90E+051.19E+042.17E-051.16E-050.1287-0.2755H15PCABL9.71E-117.11E+051.64E+046.90E-051.07E-050.2201-0.3615PCABHPCABL2.88E-116.55E+051.91E+041.89E-051.34E-050.0428-0.1439(KD為親和力常數(shù)；kon為抗原抗體結(jié)合速率；kdis為抗原抗體解離速率；KD＝kdis/kon。)表5和表6的結(jié)果表明，4種抗體PCABHL3、PCABHL5、PCABHL14和H14PCABL在與抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2結(jié)合時(shí)體現(xiàn)出了大大好于上市抗體PCABHPCABL(其重鏈可變區(qū)為蛋白PCABH，輕鏈可變區(qū)為蛋白PCABL)的解離速率。實(shí)施例7：細(xì)胞生物學(xué)活性分析VEGF可以特異結(jié)合VEGFR2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的增殖，如果用抗體封閉VEGFR2，即可抑制VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單克隆抗體PCABHL3，PCABHL5，PCABHL7，PCABHL8，PCABHL11，PCABHL14，H3PCABL，H6PCABL，H11PCABL，H14PCABL，H15PCABL對(duì)VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制效果。為了確定適宜的誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的增殖的VEGF濃度，本實(shí)驗(yàn)將HUVEC細(xì)胞鋪于96孔板中，3000cells/well，以含10％FBSHUVEC專用培養(yǎng)基在含5％二氧化碳的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)基換成1640+2％FBS饑餓培養(yǎng)基并加入不同濃度的VEGF，72h后，用MTT方法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見圖9，結(jié)果表明當(dāng)VEGF濃度為20nM時(shí)，誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的增殖的效果最好，因此選用20nMVEGF進(jìn)行后續(xù)抗體活性實(shí)驗(yàn)。將HUVEC細(xì)胞鋪于96孔板中，3000cells/well，以含10％FBSHUVEC專用培養(yǎng)基在含5％二氧化碳的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)基換成1640+2％FBS饑餓培養(yǎng)基并加入相應(yīng)的藥物處理，72h后，用MTT方法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。其中，藥物處理步驟中，空白組不加其他任何物質(zhì)，20nMVEGF組加入終濃度為20nM的VEGF，PcAb、HL14、HL3、HL5、HL7、HL8、HL11、H3L、H6L、H11L、H14L、H15L組加入終濃度為20nM的VEGF，同時(shí)分別加入三個(gè)不同濃度(1μg/ml、5μg/ml和25μg/ml)的對(duì)應(yīng)的單克隆抗體PCABHPCABL、PCABHL14、PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL11、H3PCABL、H6PCABL、H11PCABL、H14PCABL或H15PCABL。MTT檢測(cè)結(jié)果如圖10所示。結(jié)果表明，檢測(cè)的11個(gè)單克隆抗體均能顯著的抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的增殖，1μg/ml濃度的單克隆抗體就表現(xiàn)出抑制HUVEC細(xì)胞的增殖的效果，并且隨著單克隆抗體濃度升高至25μg/ml，這種抑制效果更加明顯。其中，單克隆抗體PCABHL3、PCABHL5、PCABHL7、PCABHL8、PCABHL14、H3PCABL、H11PCABL、H15PCABL抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的增殖的效果最為明顯，大大好于上市抗體PCABHPCABL(其重鏈可變區(qū)為蛋白PCABH，輕鏈可變區(qū)為蛋白PCABL)的活性。當(dāng)前第1頁1 2 3