1.一種米爾貝霉素正調控基因milR,其特征在于:其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的調控基因milR,其特征在于:該基因編碼一個由964個氨基酸組成的蛋白質,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,正向調控米爾貝霉素產量。
3.一種高產米爾貝霉素基因工程菌,其特征在于:該菌株過表達米爾貝霉素正調控基因milR,高產米爾貝霉素。
4.根據(jù)權利要求3所述的高產米爾貝霉素基因工程菌,其特征在于:所述米爾貝霉素正調控基因milR核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,該基因編碼一個由964個氨基酸組成的蛋白質,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,正向調控米爾貝霉素產量。
5.一種權利要求3-5任一所述的高產米爾貝霉素基因工程菌的制備方法,其特征在于:包括以下步驟:
1)構建米爾貝霉素正調控基因milR過表達質粒,其含有完整的米爾貝霉素正調控基因milR編碼序列和上游啟動子序列;
2)將1)所得的米爾貝霉素正調控基因milR過表達質粒轉化大腸桿菌宿主細胞,得到含有米爾貝霉素正調控基因milR過表達質粒的轉化子;
3)以冰城鏈霉菌為受體,將步驟2)得到的轉化子與冰城鏈霉菌進行接合轉移,挑取具有安普霉素抗性的接合子,即得到目標菌株。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備方法,其特征在于:所述米爾貝霉素正調控基因milR,其序列如SEQ ID NO.1所示,編碼一個由964個氨基酸組成的蛋白質,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根據(jù)權利要求5所述的制備方法,其特征在于:所述步驟1)具體為:
使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物從冰城鏈霉菌基因組上PCR擴增得到包含米爾貝霉素正調控基因milR完整編碼區(qū)和自身啟動子的片段,用XbaI進行酶切處理,然后連接入經XbaI和EcoRV雙酶切處理的pSET152載體,得到重組質粒pSET152::milR即為米爾貝霉素正調控基因milR過表達質粒。
8.根據(jù)權利要求5或7所述的制備方法,其特征在于:所述冰城鏈霉菌為Streptomyces bingchengsis X-7、Streptomyces bingchenggensis BC-109-6、Streptomyces bingchenggensis BC-101-4、Streptomyces bingchenggensis BC-102-26、Streptomyces bingchenggensis BC-103-46、Streptomyces bingchenggensis BC-104-28、Streptomyces bingchenggensis X-4、Streptomyces bingchenggensis BC-X-1、Streptomyces bingchenggensis BCJ13、Streptomyces bingchenggensis BCJ36、Streptomyces bingchenggensis BC-120-4、Streptomyces bingchenggensis BCJ60或Streptomyces bingchenggensis BCJ60/pCMF中的一種或二種以上。
9.一種利用權利要求3-5任一所述的高產米爾貝霉素基因工程菌發(fā)酵生產米爾貝霉素A3/A4的方法。
10.根據(jù)權利要求9所述的發(fā)酵生產米爾貝霉素A3/A4的方法,其特征在于:具體步驟如下:
1)構建米爾貝霉素正調控基因milR過表達質粒,其含有完整的米爾貝霉素正調控基因milR編碼序列和上游啟動子序列;
2)將1)所得的米爾貝霉素正調控基因milR過表達質粒轉化大腸桿菌宿主細胞,得到含有米爾貝霉素正調控基因milR過表達質粒的轉化子;
3)以冰城鏈霉菌為受體,將步驟2)得到的轉化子與冰城鏈霉菌進行接合轉移,挑取具有安普霉素抗性的接合子,即米爾貝霉素正調控基因milR過表達菌株;
4)以步驟3)得到的菌株發(fā)酵生產米爾貝霉素A3/A4。