本發(fā)明涉及一種米爾貝霉素正調(diào)控基因milR及其過(guò)表達(dá)基因工程菌、制備方法和應(yīng)用

背景技術(shù)：
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米爾貝霉素屬于十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物，與阿維菌素具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。米爾貝霉素首先被日本Sankyo公司1967年發(fā)現(xiàn)，由土壤放線菌Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus發(fā)酵液產(chǎn)生。米爾貝霉素組分A3和A4的混合物比目前使用最廣泛的高效生物農(nóng)藥阿維菌素殺螨活性還要高，對(duì)大鼠的毒性比阿維菌素低40倍。因此，被美國(guó)環(huán)保署認(rèn)定為危險(xiǎn)性小的殺蟲劑，荷蘭批準(zhǔn)成為“GNO”(作物生產(chǎn)中的天然產(chǎn)物)，屬生態(tài)友好型農(nóng)藥，適用于有機(jī)農(nóng)業(yè)蟲害綜合防治，在發(fā)達(dá)國(guó)家中已成為一種受歡迎的殺蟲殺螨劑，被認(rèn)為是當(dāng)今世界上最優(yōu)良的殺螨劑，具有良好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)。現(xiàn)已在美國(guó)、日本等43個(gè)國(guó)家和地區(qū)登記，在蘋果、柑橘、草莓、茶葉等24種植物上用于防治對(duì)阿維菌素、有機(jī)磷農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的螨、斑潛蠅、蚜蟲、粉虱。在米爾貝霉素系列藥物中，由于米爾貝霉素A3和A4具有較強(qiáng)的殺蟲活性，因此米爾貝霉素產(chǎn)品的商業(yè)化大多圍繞著米爾貝霉素米爾貝霉素A3/A4而進(jìn)行。除米爾貝霉素A3和A4的混合物被廣泛用作殺螨外，米爾貝霉素A3/A4的肟化物米爾貝肟(Milbemycin oxime)是歐美評(píng)價(jià)最安全的抗寄生蟲藥物，在歐美市場(chǎng)抗寄生蟲藥物銷售額排名第2位。此外，米爾貝霉素半合成樂(lè)平霉素(Lepimectin)在日本登記用于防治蔬菜、水果的鱗翅目、半翅類等害蟲；半合成Latidectin也商品化用于抗動(dòng)物寄生蟲。

盡管米爾貝霉素系列產(chǎn)品有巨大的商業(yè)價(jià)值，世界各國(guó)也爭(zhēng)相研發(fā)產(chǎn)米爾貝霉素菌株，但都沒(méi)有成功，近半個(gè)世紀(jì)來(lái)全球現(xiàn)僅日本Sankyo公司壟斷生產(chǎn)米爾貝霉素原藥。1999年課題組篩選出了產(chǎn)米爾貝霉素新菌株(授權(quán)發(fā)明專利4項(xiàng)：CN101100651B、CN10046743C、CN100467472C、CN100490648C)，新菌株不僅生物合成米爾貝霉素，而且生物合成12個(gè)未報(bào)道的米爾貝新化合物和1個(gè)新聚醚類化合物(日本用于產(chǎn)業(yè)化的米爾貝霉素菌株Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus未見(jiàn)報(bào)道生物合成聚醚類化合物)。通過(guò)對(duì)新菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、細(xì)胞壁化學(xué)成分及16S rDNA序列(DQ449953)分析鑒定，命名為冰城鏈霉菌(Streptomyces bingchenggensis)。這一菌株為我國(guó)工業(yè)化生產(chǎn)米爾貝霉素提供了前提基礎(chǔ)。到目前為止，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)完成冰城鏈霉菌全基因組測(cè)序，確定了米爾貝霉素的生物合成基因簇，分析了米爾貝霉素生物合成途徑(Wang X,Yan Y,Zhang B,An J,Wang J,Tian J,Jiang L,Chen Y,Huang S,Yin M et al.Genome sequence of the milbemycin-producing bacterium Streptomyces bingchenggensis.J Bacteriol.2010；192:4526-7)。通過(guò)基因敲除與互補(bǔ)、體外蛋白質(zhì)表達(dá)與酶促分析、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析闡明了C5-O-甲基轉(zhuǎn)移酶、C5-酮基還原酶、聚醚類化合物南昌霉素生物合成起始模塊基因的功能，并構(gòu)建了不產(chǎn)雜質(zhì)5-甲氧基米爾貝霉素類和南昌霉素的優(yōu)良、高產(chǎn)基因工程菌，70T發(fā)酵罐上單位產(chǎn)量達(dá)到2300±74g/ml，比野生菌株的27±12g/ml提高85倍(Zhang J,An J,Wang J,Yan Y,He H,Wang X,Xiang W.Genetic engineering of Streptomyces bingchenggensis to produce milbemycins A3/A4as main components and eliminate the biosynthesis of nanchangmycin.Appl Microbiol Biotechnol.2013；97:10091-101.)。進(jìn)一步建立了冰城鏈霉菌基因組芯片分析技術(shù)，明確了冰城鏈霉菌在不同生長(zhǎng)時(shí)期的基因表達(dá)情況(Wang X,Zhang B,Yan Y,An J,Zhang J,Liu C,Xiang W.Characterization and analysis of an industrial strain of Streptomyces bingchenggensis by genome sequencing and gene microarray.Genome.2013；56:677-689)，為下一步研究冰城鏈霉菌米爾貝霉素生物合成代謝調(diào)控，開展冰城鏈霉菌的分子育種奠定了基礎(chǔ)。

鏈霉菌中抗生素生物合成基因簇一般成簇存在，簇內(nèi)通常具有數(shù)量不等的調(diào)控基因(正調(diào)控和負(fù)調(diào)控基因)，而高表達(dá)簇內(nèi)正調(diào)控基因是一種有效的提高抗生素產(chǎn)量的方法。在天藍(lán)色鏈霉菌中，增加一個(gè)拷貝的正調(diào)控基因actII-orf4，可以使得放線紫紅素產(chǎn)量提高30倍以上。在可可鏈霉菌中，增加一個(gè)拷貝的polR后，多氧霉素終產(chǎn)量提高2-3倍。而在龜裂鏈霉菌中，增加兩個(gè)拷貝的otcR，并且用組成型啟動(dòng)子SF14進(jìn)行啟動(dòng)，土霉素產(chǎn)量能夠提高5-6倍。因此，在代謝工程育種中，在不影響細(xì)胞生長(zhǎng)的前提下，最大量的進(jìn)行正調(diào)控基因的過(guò)表達(dá)，被認(rèn)為是一種有效的提高抗生素產(chǎn)量的方法。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)米爾貝霉素生物合成基因簇中唯一正調(diào)控基因milR進(jìn)行研究，闡明了其在米爾貝霉素生物合成中的功能，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)提高milR基因拷貝數(shù)，提高了米爾貝霉素產(chǎn)量，并因此構(gòu)建了米爾貝霉素高產(chǎn)工程菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種米爾貝霉素正調(diào)控基因milR、該基因的過(guò)表達(dá)基因工程菌、菌株的制備方法及應(yīng)用該菌株生產(chǎn)米爾貝霉素的方法。

本發(fā)明提供的米爾貝霉素正調(diào)控基因milR，其序列如SEQ ID NO.1所示，該基因編碼一個(gè)由964個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，正向調(diào)控米爾貝霉素產(chǎn)量。

本發(fā)明提供的高產(chǎn)米爾貝霉素基因工程菌過(guò)表達(dá)米爾貝霉素正調(diào)控基因milR，高產(chǎn)米爾貝霉素。所述米爾貝霉素正調(diào)控基因milR序列如SEQ ID NO.1所示，該基因編碼一個(gè)由964個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，正向調(diào)控米爾貝霉素產(chǎn)量；該菌株表達(dá)體系中，載體為pSET152，宿主為冰城鏈霉菌BC-120-4。所述冰城鏈霉菌米爾貝霉素正調(diào)控基因milR來(lái)源于冰城鏈霉菌。所述冰城鏈霉菌為Streptomyces bingchengsis X-7、treptomyces bingchenggensis BC-109-6、Streptomyces bingchenggensis BC-101-4、Streptomyces bingchenggensis BC-102-26、Streptomyces bingchenggensis BC-103-46、Streptomyces bingchenggensis BC-104-28、Streptomyces bingchenggensis X-4、Streptomyces bingchenggensis BC-X-1、Streptomyces bingchenggensis BCJ13、Streptomyces bingchenggensis BCJ36、Streptomyces bingchenggensis BC-120-4、Streptomyces bingchenggensis BCJ60或Streptomyces bingchenggensis BCJ60/pCMF中的一種或二種以上。

本發(fā)明還提供上述高產(chǎn)米爾貝霉素基因工程菌的制備方法，包括以下步驟：

1)構(gòu)建米爾貝霉素正調(diào)控基因milR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，其含有完整的米爾貝霉素正調(diào)控基因milR編碼序列和上游啟動(dòng)子序列；

2)將1)所得的米爾貝霉素正調(diào)控基因milR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞，得到含有米爾貝霉素正調(diào)控基因milR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子；

3)以冰城鏈霉菌為受體，將步驟2)得到的轉(zhuǎn)化子與冰城鏈霉菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，挑取具有安普霉素抗性的接合子，即得到目標(biāo)菌株。

上述方法中所述米爾貝霉素正調(diào)控基因milR，其序列如SEQ ID NO.1所示，編碼一個(gè)由964個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述方法中所述步驟1)具體為：使用引物RCOMF(5’ACATATGCAACCTGTGGACCTCCGTGGCA 3’)和RCOMR(5’GCTCTAGACGAGACCGTCCCTATGTCCGATG 3’)從冰城鏈霉菌基因組上PCR擴(kuò)增得到包含米爾貝霉素正調(diào)控基因milR完整編碼區(qū)和自身啟動(dòng)子的片段。PCR反應(yīng)體系：10×KOD Buffer 5μL，dNTPs(2mM)5μL，模板DNA(冰城鏈霉菌基因組)10pg-1000ng,上下游引物(RCOMF，RCOMR；10μM)各2μL，25mM MgSO₄ 2μL,KOD plus DNApolymerase(1U/μL)1μL,DMSO 3μL,ddH₂O補(bǔ)足到50μL。反應(yīng)條件：94℃4min，94℃1min，65℃30sec，68℃3min，31個(gè)循環(huán)，68℃10min。PCR產(chǎn)物切膠回收后，用XbaI進(jìn)行酶切處理(酶切體系：milR片段1-2μg，10×M buffer 10μL，BSA 10μL，XbaI 3μL，ddH₂O補(bǔ)足到100μL)，然后連接入(連接體系：載體pSET152 10-20ng，片段milR 50-100ng，10×T4DNA ligase buffer 1μL，PEG 1μL，T4DNA ligase 0.8μL，ddH₂O補(bǔ)足到10μL)經(jīng)XbaI和EcoRV雙酶切處理(酶切體系：質(zhì)粒pSET152 1-2μg，10×M buffer 10μL，BSA 10μL，XbaI 3μL，EcoRV 3μL，ddH₂O補(bǔ)足到100μL)的pSET152載體，將以上的連接產(chǎn)物在22℃水浴3h后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單克隆，37℃小試管培養(yǎng)，提質(zhì)粒后得到重組質(zhì)粒pSET152::milR即為米爾貝霉素正調(diào)控基因milR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；所述冰城鏈霉菌為Streptomyces bingchengsis X-7、Streptomyces bingchenggensis BC-109-6、Streptomyces bingchenggensis BC-101-4、Streptomyces bingchenggensis BC-102-26、Streptomyces bingchenggensis BC-103-46、Streptomyces bingchenggensis BC-104-28、Streptomyces bingchenggensis X-4、Streptomyces bingchenggensis BC-X-1、Streptomyces bingchenggensis BCJ13、Streptomyces bingchenggensis BCJ36、Streptomyces bingchenggensis BC-120-4、Streptomyces bingchenggensis BCJ60或Streptomyces bingchenggensis BCJ60/pCMF中的一種或二種以上。

本發(fā)明還提供利用上述高產(chǎn)米爾貝霉素基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)米爾貝霉素A3/A4的方法，包括培養(yǎng)產(chǎn)米爾貝霉素A3/A4的高產(chǎn)米爾貝霉素的基因工程菌株，從培養(yǎng)物中分離米爾貝霉素A3/A4。具體步驟如下：

1)構(gòu)建米爾貝霉素正調(diào)控基因milR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，其含有完整的米爾貝霉素正調(diào)控基因milR編碼序列和上游啟動(dòng)子序列；

2)將1)所得的米爾貝霉素正調(diào)控基因milR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞，得到含有米爾貝霉素正調(diào)控基因milR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子；

3)以冰城鏈霉菌為受體，將步驟2)得到的轉(zhuǎn)化子與冰城鏈霉菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，挑取具有安普霉素抗性的接合子，即米爾貝霉素正調(diào)控基因milR過(guò)表達(dá)菌株；

4)以步驟3)得到的菌株發(fā)酵生產(chǎn)米爾貝霉素A3/A4。

上述步驟3)所述冰城鏈霉菌為Streptomyces bingchengsis X-7、Streptomyces bingchenggensis BC-109-6、Streptomyces bingchenggensis BC-101-4、Streptomyces bingchenggensis BC-102-26、Streptomyces bingchenggensis BC-103-46、StreptomyceS bingchenggensis BC-104-28、Streptomyces bingchenggensis X-4、Streptomyces bingchenggensis BC-X-1、Streptomyces bingchenggensis BCJ13、Streptomyces bingchenggensis BCJ36、Streptomyces bingchenggensis BC-120-4、Streptomyces bingchenggensis BCJ60或Streptomyces bingchenggensis BCJ60/pCMF中的一種或二種以上。

上述的米爾貝霉素正調(diào)控基因milR在冰城鏈霉菌基因組中對(duì)應(yīng)于基因SBI_00734，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SEQ ID NO.1。MilR編碼一個(gè)由964個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為序列表中的SEQ ID NO.2。生物信息學(xué)分析顯示其與已知的調(diào)控蛋白AveR(Genbank登錄號(hào)BAA84600)一致性為49％，與PikD(Genbank登錄號(hào)ALO10672)一致性為37％。通過(guò)基因功能研究表明milR破壞株失去了產(chǎn)米爾貝霉素的能力，而重新引入一個(gè)拷貝的milR可使米爾貝霉素重新產(chǎn)生，這表明該基因是一個(gè)正調(diào)控基因。同時(shí)將milR的一個(gè)拷貝導(dǎo)入出發(fā)菌株BC-120-4中，構(gòu)建得到一個(gè)米爾貝霉素高產(chǎn)工程菌株，使得米爾貝霉素A3/A4產(chǎn)量由出發(fā)菌株BC-120-4產(chǎn)量的3833mg/l提高到4978mg/l，提高百分比約為30％。

本發(fā)明中涉及的Streptomyces bingchengsis X-7保藏編號(hào)為CGMCC1734，保藏日期為2006年6月12日，保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center)；Streptomyces bingchenggensis,公開于Wang X-J,Yan Y-J,Zhang B,et al.Genome sequence of the milbemycin-producing bacterium Streptomyces bingchenggensis.Journal of Bacteriology 2010,192(17):4526-4527；Streptomyces bingchenggensis BC-109-6、Streptomyces bingchenggensis BC-101-4、Streptomyces bingchenggensis BC-102-26、Streptomyces bingchenggensis BC-103-46、Streptomyces bingchenggensis BC-104-28都公開于Wang X-J,Wang X-C,Xiang W-S.Improvement of milbemycin-producing Streptomyces bingchenggensis by rational screening of ultraviolet and chemically induced mutants.World J Microbiol Biotechnol 2009,25:1051-1056；Streptomyces bingchenggensis X-4公開于Zhang B-X,Zhang H,Wang X-J,et al.New milbemycins from mutant Streptomyces bingchenggensis X-4.J Antibiot 2011,64,753-756；Streptomyces bingchenggensis BC-X-1公開于Zhang B,Wang X,Xiang W.Optimization of fermentation medium for enhanced production of milbemycin by a mutant of Streptomyces bingchenggensis BC-X-1using response surface methodology.2011,10(37):7225-7235；Streptomyces bingchenggensis BCJ13、Streptomyces bingchenggensis BCJ36公開于Zhang J,An J,Wang J-J,et al.Genetic engineering of Streptomyces bingchenggensis to produce milbemycins A3/A4as main components and eliminate the biosynthesis of nanchangmycin.Appl Microbiol Biotechnol 2013,97:10091–10101；Streptomyces bingchenggensis BC-120-4、Streptomyces bingchenggensis BCJ60、Streptomyces bingchenggensis BCJ60/pCMF公開Wang H-Y,Zhang J,Zhang Y-J,et al.Combined application of plasma mutagenesis and gene engineering leads to 5-oxomilbemycins A3/A4as main components from Streptomyces bingchenggensis.Appl Microbiol Biotechnol 2014,98:9703–9712。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.本發(fā)明通過(guò)同源重組雙交換考察了milR的功能，并通過(guò)milR過(guò)表達(dá)提高了米爾貝霉素A3/A4的產(chǎn)量。

2.降低了生產(chǎn)成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說(shuō)明

圖1為卡那霉素抗性基因質(zhì)粒pUC119::neo(a)、基因阻斷用質(zhì)粒pKC1139(b)和過(guò)表達(dá)用質(zhì)粒pSET152(c)的物理譜圖；

圖2是milR阻斷突變株構(gòu)建示意圖；

圖3為milR基因過(guò)表達(dá)菌株構(gòu)建示意圖。

具體實(shí)施方式

下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1milR基因功能的研究

1、構(gòu)建用于基因破壞的重組質(zhì)粒

利用引物RD-LF(5’CGGAATTCCAGCGACACCATCACCGAGAACA3’,下劃線為EcoRI位點(diǎn))和RD-LR(5’CGGGGTACCGACTGAGCGAGTCGGAAATT3’,下劃線為KpnI位點(diǎn))從冰城鏈霉菌Streptomyces bingchengsis X-7基因組上PCR擴(kuò)增得到milR基因同源重組左臂片段。PCR反應(yīng)總體系為100μl，反應(yīng)條件為：94℃，4min；94℃，1min，68℃，3min，31個(gè)循環(huán)；68℃，10min。PCR產(chǎn)物上樣電泳后，回收長(zhǎng)度為2.2kb的目的條帶，然后回收片段再經(jīng)EcoRI和KpnI酶切。

利用引物RD-RF(5’CGGGATCCCAGCAGTCGGCTCAGCAACG3’,下劃線為BamHI位點(diǎn))和RD-RR(5’GCTCTAGACTCGAAATCCTTCTGGGTCAGGT3’),下劃線為XbaI位點(diǎn))從冰城鏈霉菌Streptomyces bingchengsis X-7基因組上PCR擴(kuò)增得到milR基因同源重組右臂片段。PCR反應(yīng)總體系為100μl，反應(yīng)條件為：94℃，4min；94℃，1min，68℃，3min，31個(gè)循環(huán)；68℃，10min。PCR產(chǎn)物上樣電泳后，回收長(zhǎng)度為2.2kb的目的條帶，然后回收片段再經(jīng)BamHI和XbaI酶切。

用BamHI和KpnI酶切質(zhì)粒puc119::neo(該質(zhì)粒的物理譜圖如圖1a),回收約1kb的卡那霉素抗性基因片段；將以上三個(gè)經(jīng)過(guò)酶切的片段連接入經(jīng)EcoRI和XbaI酶切的pKC1139(該質(zhì)粒的物理譜圖如圖1b)，得到milR敲除質(zhì)粒pKC1139::milR::neo。

2、milR基因阻斷突變株的構(gòu)建

首先將質(zhì)粒pKC1139::milR::neo轉(zhuǎn)化E.coli ET12567/pUZ8002感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)而通過(guò)接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入冰城鏈霉菌BC-120-4。篩選具有安普霉素或卡那霉素抗性的接合轉(zhuǎn)移子。將得到的接合子轉(zhuǎn)接至含有卡那霉素和安普霉素的液體培養(yǎng)基SSPY中培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒提取和酶切驗(yàn)證的接合子挑取6個(gè)轉(zhuǎn)接至含有卡那霉素的SSPY平板上，28℃培養(yǎng)7天，制備孢子懸液，以每個(gè)平皿約10⁴個(gè)孢子的濃度涂布在含有卡那霉素的SSPY平板上，于37℃培養(yǎng)。pKC1139具有溫度敏感型復(fù)制子，在高于34℃條件下培養(yǎng)不能自主復(fù)制，重組質(zhì)粒只有與冰城鏈霉菌染色體DNA發(fā)生同源重組，才能在含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。若發(fā)生雙交換，則kan^r正確地插入到靶基因內(nèi)部，此時(shí)菌落表現(xiàn)為Kan^rApr^s。將表現(xiàn)Kan^rApr^s的菌落同時(shí)影印到SSPY/Kan和SSPY/Apr平板上，于28℃培養(yǎng)。隨機(jī)挑選突變株，接種在沒(méi)有任何選擇壓力的SSPY培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接3代后重新接種到分別含有卡那霉素和安普霉素的SSPY培養(yǎng)基上，結(jié)果仍然表現(xiàn)Kan^rApr^s，說(shuō)明通過(guò)雙交換得到了遺傳穩(wěn)定的milR阻斷突變株(圖2)。

3、milR阻斷突變株的驗(yàn)證

挑取6株以上的Kan^rApr^s菌株，提取其基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證。上游插入位置驗(yàn)證使用引物為conR1F(5’GCTCCACGGCTTCGATATGCG 3’)和conR1F(5’ATGCTCATTGACCGGAGCGCTCAC 3’)，下游插入位置驗(yàn)證使用引物為conR1F(5‘AATGAATTCGAGCTCGGTACCCGAAC 3’)和conR1R(5’CGGCAATAGGTGATTCCAGGACAAC 3’)。PCR反應(yīng)條件為94℃，4min；94℃，1min，64℃,35sec，68℃,3min，31個(gè)循環(huán)；68℃,10min。

發(fā)生雙交換之后，上游插入位置驗(yàn)證用引物conR1F/R對(duì)擴(kuò)增得到的理論大小的片段約為4.5kb，而野生型菌株大小應(yīng)為5.3kb，下游插入位置驗(yàn)證用引物對(duì)conR2F/R擴(kuò)增得到的理論大小片段約為3.5kb，而野生型則擴(kuò)增不出條帶。

4、米爾貝霉素的HPLC分析

將驗(yàn)證正確的milR阻斷突變株和野生型分別接種在液體SSPY種子液中，28℃培養(yǎng)46h后，以6％的接種量在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)9d后，發(fā)酵液和3倍體積甲醇混合浸泡12h，離心后取上清液進(jìn)行HPLC分析。HPLC條件，流動(dòng)相A：乙腈：水：甲醇＝350:50:100，流動(dòng)相B：甲醇，梯度洗脫：15min內(nèi)流動(dòng)相B的濃度從0升至100％，流速：1.0ml/min,柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：242nm，進(jìn)樣量：20μl，分析柱NOVA-PAK^R C18(3.9×150mm,5μm,Waters)。結(jié)果表明milR阻斷突變株中沒(méi)有米爾貝霉素產(chǎn)生，說(shuō)明milR基因是米爾貝霉素生物合成所必需的。

5、milR阻斷突變株的互補(bǔ)分析

為了排除milR阻斷突變株表型是由于染色體其它位置突變導(dǎo)致，進(jìn)行了milR的遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，使用引物RCOMF(5’ACATATGCAACCTGTGGACCTCCGTGGCA 3’)和RCOMR(5’GCTCTAGACGAGACCGTCCCTATGTCCGATG 3’)從冰城鏈霉菌Streptomyces bingchengsis X-7基因組上PCR擴(kuò)增(PCR反應(yīng)體系：10×KOD Buffer 5μL，dNTPs(2mM)5μL，模板DNA(冰城鏈霉菌Streptomyces bingchengsis X-7基因組)10pg-1000ng,上下游引物(RCOMF，RCOMR；10um)各2μL，25mM MgSO₄ 2μL,KOD plus DNA polymerase(1U/μL)1μL,DMSO 3μL,ddH₂O補(bǔ)足到50μL。反應(yīng)條件：94℃4min，94℃1min，65℃30sec，68℃3min，31個(gè)循環(huán)，68℃10min)得到包含milR完整編碼區(qū)和自身啟動(dòng)子的3278bp片段。用XbaI進(jìn)行酶切處理(酶切體系：milR片段1-2μg，10×M buffer 10μL，BSA 10μL，XbaI 3μL，ddH₂O補(bǔ)足到100μL)，然后連接(連接體系：載體pSET152 10-20ng，片段milR 50-100ng，10×T4DNA ligase buffer 1μL，PEG 1μL，T4DNA ligase 0.8μL，ddH₂O補(bǔ)足到10μL)入經(jīng)XbaI和EcoRV雙酶切(酶切體系：質(zhì)粒pSET152 1-2μg，10×M buffer 10μL，BSA 10μL，XbaI 3μL，EcoRV 3μL，ddH₂O補(bǔ)足到100μL)處理的pSET152載體(pSET物理譜圖見(jiàn)圖1a)上(Bierman M,Logan R,O'Brien K,Seno ET,Rao RN,Schoner BE.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.Gene.1992；116:43-9.)，(將以上的連接產(chǎn)物在22℃水浴3h后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單克隆，37℃小試管培養(yǎng)，提質(zhì)粒后)得到重組質(zhì)粒pSET152::milR(圖3)。

將pSET152::milR轉(zhuǎn)化E.coli ET12567/pUZ8002感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入milR阻斷突變株中。用安普霉素的抗性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子，pSET152為整合型載體，不能在鏈霉菌中自主復(fù)制，只能通過(guò)噬菌體ФC31attP位點(diǎn)與鏈霉菌基因組attB位點(diǎn)發(fā)生特異性重組而整合到染色體上。進(jìn)而得到milR阻斷突變株的互補(bǔ)株。隨機(jī)篩選10株轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行米爾貝霉素產(chǎn)素發(fā)酵，并進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果milR互補(bǔ)之后的突變株恢復(fù)了米爾貝霉素的產(chǎn)生能力。這說(shuō)明milR是米爾貝霉素生物合成所必需的。

實(shí)施例2、米爾貝霉素高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建

將實(shí)施例1中互補(bǔ)使用的重組載體pSET152::milR轉(zhuǎn)化E.coli ET12567/pUZ8002感受態(tài)細(xì)胞，得到含有pSET152::milR的E.coli ET12567/pUZ8002單克隆，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入Streptomyces bingchenggensis BC-120-4菌株中，過(guò)程為挑取單克隆接種于加有相應(yīng)抗性的液體LB培養(yǎng)基中(培養(yǎng)時(shí)添加100μg/ml安普霉素和25μg/ml氯霉素)；37℃過(guò)夜培養(yǎng)；過(guò)夜培養(yǎng)物以1:100的比例，接種于加有相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.4～0.6；離心，收集菌體，用等體積液體LB培養(yǎng)基洗滌菌體兩次，用1/10體積的2YT懸?。辉谙礈齑竽c桿菌細(xì)胞的同時(shí)，用2×YT培養(yǎng)基收集鏈霉菌的孢子，每個(gè)接合轉(zhuǎn)移約10⁸個(gè)孢子/500μl，50℃熱激10min，室溫冷卻；將500μl的大腸桿菌細(xì)胞與500μl鏈霉菌的孢子混合，3000rpm離心5min；棄上清，殘留液重懸沉淀，涂布于含有10mM MgCl₂的MS固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)；培養(yǎng)6h后，每板加1ml無(wú)菌水稀釋的萘啶酮酸(用0.15M NaOH配制)至25～30μg/ml和相應(yīng)濃度抗生素(安普霉素至終濃度為4～6μg/ml)，28℃繼續(xù)培養(yǎng)3～5d。由此得到米爾貝霉素工程菌株。

從中篩選3株工程菌，進(jìn)行發(fā)酵分析其米爾貝霉素產(chǎn)生能力，并與野生型菌株BC-120-4進(jìn)行比較，結(jié)果表明3株工程菌米爾貝霉素A3/A4產(chǎn)量平均值為4978mg/l，出發(fā)菌株BC-120-4產(chǎn)量為3833mg/l，產(chǎn)量提高約30％。

實(shí)施例3

與實(shí)施例1的區(qū)別在于：將冰城鏈霉菌Streptomyces bingchengsis X-7替換為Streptomyces bingchenggensis BC-120-4。其他步驟同實(shí)施例1。

實(shí)施例4

與實(shí)施例2的區(qū)別在于：將實(shí)施例1中互補(bǔ)使用的重組載體pSET152::milR替換為實(shí)施例3中互補(bǔ)使用的重組載體pSET152::milR。其他步驟同實(shí)施例2，最終得到米爾貝霉素工程菌株。