本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種來(lái)源于速生且木材品質(zhì)優(yōu)良的美洲黑楊(Populus deltoides Marsh.)的伸展蛋白基因，命名為PdEXT。本發(fā)明還涉及PdEXT基因編碼的蛋白，利用PdEXT基因和植物維管組織特異啟動(dòng)子proNAC068載體構(gòu)建的融合表達(dá)載體，以及利用該基因培育優(yōu)良木材品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因楊樹的方法。

背景技術(shù)：

楊樹在我國(guó)是一個(gè)栽培歷史悠久、種類繁多、分布廣泛的重要經(jīng)濟(jì)樹種以及重要的短輪伐期工業(yè)用材樹種之一，楊樹材性的育種一直是林木育種工作的重點(diǎn)。2002年毛果楊基因組測(cè)序工作的順利完成，促進(jìn)了樹木基因分離和應(yīng)用的研究。一些與木材性狀相關(guān)基因的陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)、克隆和驗(yàn)證，為從基因水平上改善林木材性提供了基礎(chǔ)。

伸展蛋白(Extensin)是第一個(gè)被鑒定作為細(xì)胞壁的疏松蛋白，參與胞壁多聚糖的伸展作用，具有能在植物體外誘導(dǎo)細(xì)胞壁擴(kuò)展，導(dǎo)致細(xì)胞壁松弛、細(xì)胞膨大的功能。伸展蛋白或細(xì)胞壁松弛蛋白是植物細(xì)胞壁的重要的糖蛋白，其羥脯氨酸(Hyp)含量比例高，兩者呈正相關(guān)關(guān)系。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分析，細(xì)胞壁松弛蛋白expansin可分為α、β、γ和δ四個(gè)亞家族，它們可能來(lái)源于共同的祖先。過(guò)量表達(dá)和反義RNA干涉試驗(yàn)表明，通過(guò)內(nèi)源導(dǎo)入expansin基因與外源施用expansin蛋白導(dǎo)致細(xì)胞壁變化和細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)類似。已有研究表明，expansin的表達(dá)具有細(xì)胞、組織和器官的特異性，expansin在次生木質(zhì)部有高豐度的表達(dá)，expansin基因與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、根系發(fā)生、果實(shí)成熟、授粉受精等生理活動(dòng)密切相關(guān)，調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育。由上可知，研究伸展蛋白對(duì)改善楊樹木材性狀具有重要的意義。然而，目前對(duì)美洲黑楊(Populus deltoides Marsh.)伸展蛋白基因還未見(jiàn)相關(guān)的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有有效改良樹木材性的基因美洲黑楊伸展蛋白基因-PdEXT。通過(guò)對(duì)該基因的應(yīng)用，有利于改良木材的品質(zhì)，提高以該木材為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品的質(zhì)量。

本發(fā)明提供了一種美洲黑楊伸展蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明還提供了一種基于上述基因編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，包含上述美洲黑楊伸展蛋白基因。

優(yōu)選地，所述表達(dá)載體包含維管組織特異啟動(dòng)子proNAC068。

本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞，所述細(xì)胞為將宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化后的包含上述表達(dá)載體的細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞包括但不限于：大腸桿菌或農(nóng)桿菌細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種包含上述美洲黑楊伸展蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

A、克隆美洲黑楊伸展蛋白基因；

B、將步驟A所述的基因連接到pGEM-T Easy載體中，得到連接產(chǎn)物PGEM-PdEXT；

C、將步驟B所得的連接產(chǎn)物PGEM-PdEXT和維管組織特異啟動(dòng)子proNAC068載體分別進(jìn)行Xba I和Sac I雙酶切后，連接得到一個(gè)雙元表達(dá)載體；

D、將所述雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中。

本發(fā)明還提供了一種利用美洲黑楊伸展蛋白基因獲得轉(zhuǎn)基因山新楊植株的方法，包括以下步驟：

構(gòu)建包含權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體；

用所述構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化山新楊細(xì)胞；

將所述轉(zhuǎn)化的山新楊細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因山新楊植株。

本發(fā)明還提供了一種基于美洲黑楊伸展蛋白基因轉(zhuǎn)化植物獲得轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)所述植物為單子葉植物時(shí)，所述植物至少包括但不限于以下其一：水稻、小麥、玉米、牧草；

當(dāng)所述植物為雙子葉植物時(shí)，所述植物至少包括但不限于以下其一：楊樹、擬南芥、煙草、油菜。

綜上所述，本發(fā)明提供一種具有有效改良樹木材性的基因PdEXT。通過(guò)對(duì)該基因的應(yīng)用，有利于增強(qiáng)木材的強(qiáng)度，提高以該木材為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品的質(zhì)量。

附圖說(shuō)明

圖1.PdEXT植物表達(dá)載體pBI121-proNAC068-PdEXT構(gòu)建圖；

圖2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染PdEXT的楊樹分化出的叢生芽；

圖3.轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基的PdEXT轉(zhuǎn)基因楊樹植株；

圖4.移栽的PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊植株和對(duì)照植株；

圖5.PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊植株的PCR檢測(cè)；

圖6.PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊及其對(duì)照植株的PdEXT和木材微纖絲角相關(guān)基因的熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析；

圖7.PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊及其對(duì)照植株的莖橫切面解剖特征和微纖絲角匯總圖；

圖8.PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊及其對(duì)照植株的莖橫切面解剖結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例中所用試劑如下：

RQ-Dnase(Promega，美國(guó))、RNase Inhibitor(Promega，美國(guó))、MM-LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國(guó))、dNTP(天根，中國(guó))、Plant TotalRNA Isolation Kit(Autolabtech，中國(guó))、MM-LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國(guó))、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)試劑盒、pGEM-T Easy試劑盒(Promega，美國(guó))、水飽和酚(Autolabtech，中國(guó))、氯仿(北京化工，中國(guó))。

以下，對(duì)本文的實(shí)施方式進(jìn)行具體說(shuō)明。

實(shí)施例1、美洲黑楊PdEXT基因的克隆

從中國(guó)林科院的美洲黑楊未成熟木質(zhì)部和木質(zhì)部組織中提取總RNA?？俁NA的提取采用奧萊博生物技術(shù)有限公司(Autolabtech，中國(guó))生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒(Cat#：AL-BRE-004-100)，具體操作過(guò)程參照其說(shuō)明書?？俁NA提取后，用RNase-free DNase(Promega，上海)處理15分鐘，酚/氯仿抽提去除DNase，70％乙醇沉淀回收RNA。采用TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并利用MM-LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國(guó))進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。

選擇樹干通直、生長(zhǎng)旺盛的15年生美洲黑楊成年樹木，用鉆子、斧頭去除胸徑處樹皮，暴露韌皮部組織，形成層和未成熟木質(zhì)部等組織，用刮紙刀刮取未成熟木質(zhì)部和木質(zhì)部于液氮速凍后，保存于-80℃超低溫冰箱?？俁NA的提取采用奧萊博生物技術(shù)有限公司(Autolabtech，中國(guó))生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒(Cat#：AL-BRE-004-100)，具體操作過(guò)程參照其說(shuō)明書。總RNA提取后，用RNase-free DNase(Promega，美國(guó))處理15min，氯仿/酚抽提去除DNase，70％乙醇沉淀回收RNA。采用TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。以帶Oligo(dT)₁₅的引物，利用MM-LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國(guó))進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

Oligo(dT)₁₅引物序列如下：

TTTTTTTTTTTTTTT

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如下

1、RNA樣品2～6μl(0.05～1μl)，加入CDS PrimerⅡA Oligo(dT)15-30 2μl，加水補(bǔ)足到總體積10μl，混合并短暫離心。

2、72℃溫育2min，立即置于冰上2min，并短暫離心。

用PCR儀72℃溫育2.5min。

3、加入下列成份：

4μl 5×First-Strand Buffer；

2μl DTT(20mM)；

2μl dNTP Mix(10mM of each dNTP)；

2μl Reverse Transcriptase。

4、輕輕混勻并短暫離心，42℃溫育1.5h。

5、將離心管放于冰上終止反應(yīng)，－20℃保存。

取適量上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以進(jìn)行PCR擴(kuò)增分離基因。

正向引物(含Xba I位點(diǎn)，其識(shí)別序列以下劃線表示)：

5'-GGCCTCTAGAATGGCTCCCAAAAGAACC-3'

反向引物(含Sac I位點(diǎn)，其識(shí)別序列以下劃線表示)：

5'-GGCGAGCTCTTAAGGACATTGGAAGTCTT-3'

PCR條件

以反轉(zhuǎn)錄合成的第1鏈cDNA為模板，經(jīng)94℃預(yù)變性3分鐘后采用94℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘的反應(yīng)條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，并于72℃延伸7分鐘后置于4℃冰箱中備用。

PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy(Promega，美國(guó))載體上用于測(cè)序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTN核酸序列的同源性分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝MegaBlast&PROGRAM＝bla stn&BLAST_PROGR)，確定通過(guò)上述PCR反應(yīng)克隆到的是EXT的同源基因。

該基因含有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框架，全長(zhǎng)為423bp，見(jiàn)SEQ ID NO：1，該基因編碼的蛋白的氨基酸序列，見(jiàn)SEQ ID NO：2。我們將這個(gè)來(lái)源于美洲黑楊的EXT的同源基因命名為PdEXT。

實(shí)施例2、用于轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體的構(gòu)建

利用上述的正向引物和反向引物，以克隆在pGEM-T Easy載體上的PGEM-PdEXT質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出特異的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物純化回收后，與毛白楊(Popuplus tomentosa Carr.)維管組織特異啟動(dòng)子

proNAC068載體分別進(jìn)行Xba I和Sac I雙酶切后，連接得到一個(gè)雙元表達(dá)載體，其圖譜如圖1所示，經(jīng)測(cè)序鑒定插入片段無(wú)誤后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。PCR篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切驗(yàn)證后，證明成功轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，該表達(dá)載體可直接用于植物，如楊樹、擬南芥、煙草等植物的轉(zhuǎn)化。維管組織特異啟動(dòng)子proNAC068序列為880bp，見(jiàn)SEQ ID NO：3。

其中，本實(shí)施例可以使用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的表達(dá)載體。這些植物表達(dá)載體包括但不限于，雙元農(nóng)桿菌載體，例如Pbin19、pBI121、pBI 221，以及用于單子葉植物微彈轟擊的植物表達(dá)載體。本實(shí)施例的載體也可含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子。在實(shí)施例中可使用任何一種強(qiáng)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV 35S)、Ubiqutin和Actin啟動(dòng)子。它可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。

為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，包括加入植物可選擇性標(biāo)記?？墒褂玫倪x擇性標(biāo)記包括對(duì)抗生素抗性的酶，抗生素包括卡那霉素、潮霉素、慶大霉素等。同樣，可使用產(chǎn)生通過(guò)顏色變化(例如GUS)或發(fā)光(例如熒光酶或GFP)來(lái)識(shí)別化合物的酶，或抗化學(xué)試劑(例如除萎劑)。另外，也可不用任何篩選標(biāo)記。

本發(fā)明的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體，直接的DNA轉(zhuǎn)化，微注射，基因槍等導(dǎo)入植物細(xì)胞。

實(shí)施例3、PdEXT基因的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法對(duì)山新楊組培苗進(jìn)行PdEXT基因的遺傳轉(zhuǎn)化，具體操作步驟如下：

(1)在超凈臺(tái)中，從培養(yǎng)瓶中取出健壯生長(zhǎng)的山新楊組培苗，用手術(shù)刀片沿與主脈垂直每隔5mm左右劃刀口，使葉片產(chǎn)生傷口。

(2)將葉片在含目的基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10-15min，立即用無(wú)菌滅菌水沖洗一遍；將接菌后的葉片平鋪于1/2MS固體培養(yǎng)基表面，室溫暗共培養(yǎng)2-4d。

(3)將共培養(yǎng)葉片轉(zhuǎn)移至含頭孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的MS分化培養(yǎng)基中，如圖2所示，其中a表示：轉(zhuǎn)基因楊樹植株分化培養(yǎng)30天；b表示：轉(zhuǎn)基因楊樹植株分化培養(yǎng)45天，將其在光照周期16h/8h，25℃條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。

(4)繼代選擇培養(yǎng)：每2-3周后，外植體更換一次選擇培養(yǎng)基使其誘導(dǎo)分化。

(5)待不定芽長(zhǎng)到1cm以上時(shí)，將其切下并插入含頭孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，如圖3所示，其中，a表示：轉(zhuǎn)基因楊樹植株生根培養(yǎng)20天；b表示：轉(zhuǎn)基因楊樹植株生根培養(yǎng)30天，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

分化培養(yǎng)基組成：

含6-BA 1.0mg/L，NAA 0.05mg/L，頭孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的MS培養(yǎng)基。

生根培養(yǎng)基組成：

含IBA 0.05mg/L，NAA 0.02mg/L，頭孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的1/2MS培養(yǎng)基。

實(shí)施例4、PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊植株的PCR檢測(cè)

如圖4所示，為將在生根培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株移栽到溫室，正常水肥管理，4個(gè)月后的培養(yǎng)結(jié)果，比例標(biāo)尺Scale bar為12.42cm。其中a為非轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)照植株，b為轉(zhuǎn)基因楊樹植株。轉(zhuǎn)基因山新楊植株的DNA提取采用CTAB法(王關(guān)林和方宏筠，2002)。根據(jù)pBI121載體上的NPTII序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化后的再生植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。引物序列為:

正向引物：

5'-ATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCT-3'

反向引物：

5'-GAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3'

PCR結(jié)果如圖5所示，可見(jiàn)在所檢測(cè)的抗卡那霉素的100株山新楊中，14株擴(kuò)增出約0.7kb的DNA片段，從而可以初步推斷這些植株為PdEXT基因的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。M為DL2000Marker；1-14:PdEXT轉(zhuǎn)基因楊樹植株；CK-:非轉(zhuǎn)基因楊樹植株。

實(shí)施例5、PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊及其對(duì)照植株的PdEXT和木材微纖絲角相關(guān)基因的熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析

轉(zhuǎn)基因山新楊植株的RNA提取按照實(shí)施例1描述的方法進(jìn)行，利用MM-LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega,美國(guó))進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物，根據(jù)PdEXT、PtrFRA1(易脆纖維基因)、PtrTUB7(微管蛋白基因)、PtrSuS1(蔗糖合成酶基因)、PtrC4H1(肉桂酸4-羥基化酶基因)、PtrCAD10(肉桂醇脫氫酶基因)、PtrCCR7(肉桂酰輔酶A還原酶基因)的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)1對(duì)能夠擴(kuò)增200bp左右片段的引物，并以微管蛋白基因Tubulin作為內(nèi)參基因。PdEXT基因、內(nèi)參基因和微纖絲角相關(guān)基因的熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物序列如下：

PdEXT正向引物：

5'-CGAGGCTGCTATTTGTCT-3'

PdEXT反向引物：

5'-TTGGAAGTCTTTGGGAAC-3'

Tubulin正向引物：

5'-CTGCCCGTTGCTCTGATGATTCA-3'

Tubulin反向引物：

5'-CCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCT-3'

PtrFRA1正向引物：

5'-CAGCAGAACTGTTATGATAGC-3'

PtrFRA1反向引物:

5'-TGTTGCGGGCACGATTTG-3'

PtrTUB7正向引物:

5'-TTGAGCCATACAACGCCAC-3'

PtrTUB7反向引物:

5'-CGGAAGCAGATGTCATACAAA-3'

PtrSuS1正向引物:

5'-TTTCCCTCGCCCAACTCTT-3'

PtrSuS1反向引物:

5'-GATGCAGGCTTTCCTTGTCA-3'

PtrC4H1正向引物：

5'-CCCTCTTGGGTTCTTTCGTT-3'

PtrC4H1反向引物:

5'-CAAACACGGGGACAGGTATA-3'

PtrCAD10正向引物:

5'-CAGCACTTTGTACTCCGTATTCC-3'

PtrCAD10反向引物:

5'-TGCTTCCCTGGTTCTGTCATT-3'

PtrCCR7正向引物:

5'-GGCTAAGGAGAAAGGGGTGG-3'

PtrCCR7反向引物:

5'-GCCGGTGAGGTACTTGAGGA-3'

PCR反應(yīng)按照SYBR Premix Ex Taq^TM(TaKaRa，日本)試劑盒提供的方法進(jìn)行：在PCR 8連管中依次加入10μL SYBR Premix Ex Taq^TM、0.4μL PCR Forward primer、0.4μL PCR Reverse primer、0.4μL ROX Reference dye II、2μL cDNA和6.8μL滅菌蒸餾水，終體積為20μL，輕微離心，收集到管底。PCR反應(yīng)在ABI 7500Real-time PCR儀上按照下列程序進(jìn)行：95℃10秒；然后95℃5秒，59℃34秒，共40個(gè)循環(huán)。

PCR結(jié)束后，制作熔解曲線檢查是否有非特異擴(kuò)增，然后應(yīng)用ABI sequence detection system分析軟件分析定量PCR結(jié)果。

結(jié)果見(jiàn)圖6，PdEXT轉(zhuǎn)基因植株P(guān)dEXT1、PdEXT2和PdEXT3中木材微纖絲角相關(guān)基因如易脆纖維基因PtrFRA1、微管蛋白基因PtrTUB7、蔗糖合成酶基因PtrSuS1、肉桂酸4-羥基化酶基因PtrC4H1、肉桂醇脫氫酶基因PtrCAD10和肉桂酰輔酶A還原酶基因PtrCCR7的表達(dá)水平，與對(duì)照相比提高了2.22-7.31倍，表明PdEXT調(diào)控木材微纖絲角相關(guān)基因的表達(dá)。圖6的對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因植株；PdEXT1、PdEXT2、PdEXT3分別為轉(zhuǎn)基因楊樹的3個(gè)植株。

實(shí)施例6、PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊植株的解剖結(jié)構(gòu)分析和微纖絲角測(cè)定

采用石蠟切片技術(shù)進(jìn)行莖橫切面解剖并制作切片，以觀察韌皮部、形成層和木質(zhì)部的細(xì)胞層數(shù)、數(shù)目變化及次生生長(zhǎng)情況。微纖絲角的測(cè)定采用偏光顯微鏡方法，將20μm厚的弦切面切片，經(jīng)脫木素、染色和固定處理，使用偏光顯微鏡測(cè)量2–3個(gè)切片，隨機(jī)測(cè)量25根纖維的微纖絲角，取平均值，得出樣品的微纖絲角數(shù)據(jù)，并采用SPSS軟件(IBM公司)對(duì)測(cè)定的解剖特征指標(biāo)分別進(jìn)行單因素方差分析(One-Way Anova)。

對(duì)莖橫切面進(jìn)行組織切片，解剖特征進(jìn)行匯總分析。如圖7所示，其中的圖a-c分別示出了非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?、轉(zhuǎn)基因植株P(guān)dEXT1、PdEXT2和PdEXT3的木質(zhì)部、韌皮部和形成層的寬度和層數(shù)。其中，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)dEXT1、PdEXT2和PdEXT3的木質(zhì)部、韌皮部和形成層的寬度相比對(duì)照分別提高了36.55％-51.71％、22.81％-29.68％和22.72％-35.16％。單因素方差分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)部、韌皮部和形成層的寬度與對(duì)照相比均有顯著性差異，具體的，sig值分別為0.003、0.001和0.006，如圖7d，示出了轉(zhuǎn)基因植株P(guān)dEXT1、PdEXT2和PdEXT3及其對(duì)照的節(jié)間均長(zhǎng)和木質(zhì)部寬度/韌皮部寬度比值。其中，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)dEXT3的木質(zhì)部寬度/韌皮部寬度比值最高，達(dá)到2.11。如圖8，示出了轉(zhuǎn)基因植株P(guān)dEXT1、PdEXT2和PdEXT3及其對(duì)照植株的莖橫切面解剖結(jié)構(gòu)。其中，圖a、b分別示出了非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓旰娃D(zhuǎn)基因楊樹植株的韌皮部和形成層的解剖結(jié)構(gòu)。其中，X、CZ、P分別指木質(zhì)部、形成層、韌皮部。圖c、d分別示出了非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓旰娃D(zhuǎn)基因楊樹植株的木質(zhì)部和形成層的解剖結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺Scale bar為70μm。

微纖絲角是指木材細(xì)胞壁S2層中微纖絲方向與細(xì)胞主軸之間的夾角，或者可以理解為細(xì)胞壁中纖維素鏈的螺旋卷鎖與纖維軸之間的夾角。如圖7e所示，為轉(zhuǎn)基因植株P(guān)dEXT1、PdEXT2、PdEXT3及其對(duì)照植株的微纖絲角進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者差異明顯。與對(duì)照株相比，轉(zhuǎn)基因植株的微纖絲角下降了12.48％-15.86％(sig＝0.001)。本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因植株的微纖絲角相比對(duì)照明顯下降，表明PdEXT轉(zhuǎn)基因植株的纖維彈性模量和強(qiáng)度增強(qiáng)，木材強(qiáng)度大，縱向收縮小，利用該原料制出理想紙品的潛力較大。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。