本發(fā)明涉及基因工程領域，更具體地說涉及CRISPR-Cas9特異性敲除人RecQL4基因的方法以及用于特異性靶向RecQL4基因的sgRNA。
背景技術：
乳腺癌是女性最常見的癌癥，主要包括導管癌和小葉癌。2011年美國CA(A Cancer Journal化r Clinicians)公布的最新統(tǒng)計數據顯示，美國2011年預計將有230480例女性患乳腺癌，占女性新發(fā)惡性腫瘤的30％，居女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位，并且死亡人數將達39520例。更為嚴重的是全球的乳腺癌發(fā)病率正在逐年增長。乳腺癌的診斷方法主要包括乳腺鋼祀X線攝影、乳腺彩色多譜勒超聲檢查、乳腺導管內視鏡檢查、乳腺導管灌洗、CT和磁共振。但是該些檢測方法主要是基于形態(tài)學標準，依然缺乏與乳腺癌相關的特異性標志。乳腺癌的治療主要包括手術切除、化療及放療或者幾者綜合治療等方式。但是傳統(tǒng)化療、放療的方式由于缺乏腫瘤細胞的祀向性導致非常嚴重的副作用。近年來發(fā)展的單克隆抗體雖然具有較高的特異性和親和力，但是抗體本身所具有的一些缺陷，如免疫原性、不穩(wěn)定性、批次間的差異性等使其在臨床上的實際應用中具有一定的局限性。因此，找到乳腺腫瘤細胞的特異性祀標，在腫瘤的診斷和治療中都具有重要意義。近些年發(fā)展的核酸適體探針，尤其是細胞祀向的核酸適體，能夠特異性識別包括全血樣品的復雜樣品中的癌細胞，將給腫瘤的早期特異性快速診斷和祀向治療帶來新的希望和解決途徑。目前沒有用于治療或預防乳腺癌的普遍成功的方法。
目前乳腺癌的治療依賴于早期診斷(例如，通過常規(guī)的乳腺篩查方法)和侵入性治療的組合，其可包括多種治療例如手術、放射療法、化學療法和激素療法中的一種或多種。通?；谠S多預后參數(包括特異性腫瘤標記的分析)來選擇特定乳腺癌的療程。
RecQL4是RecQ解旋酶家族中的一員。它是由Kitao等人在1998年克隆并以大腸桿菌(E.Coli)RecQ蛋白來命名的。其主要功能是打開DNA雙螺旋結構用于DNA轉錄、復制以及損傷修復(見Genetics in Medicine,2006,The versatile RecQL4,8(4):213-216)，因此，RecQL4對于維持基因組的穩(wěn)定性是非常重要的。而基因的不穩(wěn)定性在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中起重要作用。RecQL4功能缺失可引起人類基因組不穩(wěn)定性疾?。絉othmund-Thomson綜合癥(RTQ，表現為皮膚紅斑、骨骼異常、早衰和腫瘤特別是骨肉瘤高發(fā)。除了RTS，RecQL4功能缺失也與RAPADILINO和BALLER-GEROLD綜合癥相關。這三種臨床疾病癥候群的共同特征是個矮和骨骼異常，然而腫瘤高發(fā)只存在于RTS及RAPADILINO疾病癥候群。使用RecQL4基因敲除小鼠模型進一步證實了在人類中的發(fā)現。小鼠在RecQL4基因功能缺失之后，表現為生長遲緩、早死、以及其它的類似于人類Rothmund-Thomson綜合癥的缺陷。
CN 101476163 A中公開了抑制人RecQL4基因表達的siRNA能夠用于抗乳腺腫瘤。但是siRNA的使用具有藥物的遞送效率低，要持續(xù)給藥，并不能夠徹底根治，而且用藥復雜，不適宜大規(guī)模推廣。
CRISPR是一個特殊的DNA重復序列家族，廣泛分布于細菌和古細菌基因組中。CRISPR位點通常由短的高度保守的重復序列(repeats)組成，重復序列的長度通常21～48bp，重復序列之間被26～72bp間隔序列(spacer)隔開。CRISPR就是通過這些間隔序列與靶基因進行識別。Cas(CRISPRassociated)存在于
CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在導向RNA(guideRNA，gRNA)的引導下對革EU立點進行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。
這一技術由于能快速、簡便、高效地靶向基因組任何基因，從而引起了廣泛的關注，在2012年開始像爆炸一般流行開來。由于其容易操作、可以同時靶向多個基因，可以高通量制備、造價低等優(yōu)勢，Cas9已經成為一種發(fā)展最快的技術(Pennisi，2013)。正是由于其優(yōu)越性，這一技術在Nature推薦的2013十大進展中位列第一。
Cas9靶向切割DNA是通過兩種小RNA--crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)和革E序列互補識別的原理實現的?，F在已經把兩種小RNA融合成一條RNA鏈，簡稱sgRNA(single guide RNA)。因此，sgRNA能否做到特異性、精確祀向目標基因是CRISPR-Cas9能否特異性敲除目標基因的先決條件，無論是脫靶還是錯誤靶向，都會影響CRISPR-Cas9對目標基因的特異性敲除。因此，能夠設計、制備出精確性和特異性靶向目標基因的sgRNA成為CRISPR-Cas9基因敲除的關鍵技術。
與ZFN相比，CRISPR-Cas9具有更快速、簡便、高效、多位點、特異性靶向敲除基因的優(yōu)勢。為高效靶向敲除RecQL4,實現艾滋病及其相關疾病的治療提供了一種可能的選擇。本發(fā)明的目的就是要驗證利用CRISPR-Cas9高效靶向敲除RecQL4提供相應的技術方案，以達到特異性敲除RecQL4的目的。
技術實現要素：
針對現有使用siRNA靶向RecQL4進行乳腺癌疾病治療所存在的問題：為了解決上述技術問題，本申請的技術方案如下:
一、sgRNA寡核普酸的設計和選擇
1.靶向RecQL4基因的sgRNA的設計:
因為沒有使用體外轉錄，只是構建普通載體的方式制作。所以如無特殊說明，文中的sgRNA序列指的是sgRNA對應DNA序列。
首先在Z38基因上選擇5’-GGN(19)GG的序列，如果沒有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。sgRNA在STAT6基因上的靶向位點位于基因的外顯子。在UCSC數據庫中用BLAT或NCBI數據庫中用BLAST，確定sgRNA的靶序列是否唯一。同時根據其他的sgRNA的設計規(guī)則，共設計了57個sgRNA，然而通過最后的實驗證實，其中只有17個具有靶向修飾的功能，在此，沒有功能的序列就不一一列舉，僅僅給出2個反例，這也充分說明在現有技術中，sgRNA的設計并不不能僅僅根據設計規(guī)則不需要實驗即可得到有功能的sgRNA，本發(fā)明涉及的sgRNA序列如下：
RecQL4-sg1：gcaagcgcggaggccgggcgggcg(SEQ ID NO:2)
RecQL4-sg2：ggcgtgggagcgcgcgttccgac(SEQ ID NO:3)
RecQL4-sg3：acgtggaggcggcgccggaggaga(SEQ ID NO:4)
RecQL4-sg4：cagcggctcaaggccaatctgaaa(SEQ ID NO:5)
RecQL4-sg5：ccaaggccaggccggctccagc(SEQ ID NO:6)
RecQL4-sg6：cagtgaggtcccagattttctggg(SEQ ID NO:7)
RecQL4-sg7：aacttctgatccctggtgagtc(SEQ ID NO:8)
RecQL4-sg8：agtggaggcgagaagcggagat(SEQ ID NO:9)
RecQL4-sg9：gagccctgggagagccccgcaca(SEQ ID NO:10)
RecQL4-sg10：caagctagggctgggaaggctga(SEQ ID NO:11)
RecQL4-sg11：ctactccctggggccctcagggcag(SEQ ID NO:12)
RecQL4-sg12：gccggctgaggtgttccaggccct(SEQ ID NO:13)
RecQL4-sg13：gtgcagtcatgcggatcctgtct(SEQ ID NO:14)
RecQL4-sg14：actcatggatgaccaggtgtct(SEQ ID NO:15)
RecQL4-sg15：caaggcggcctgcatacactc(SEQ ID NO:16)
RecQL4-sg16：gcaaccggcgcgaggacacagagc(SEQ ID NO:17)
RecQL4-sg17：ggcctttgggatggggctggacc(SEQ ID NO:18)
RecQL4-sg18：gcggcggccgaagaggcgccagag(SEQ ID NO:19)
RecQL4-sg19：gcaggcctgatctaggctcaga(SEQ ID NO:20)
二、構建sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈
根據選擇的sgRNA,在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)(如果序列本身在5’端已經有1或者2個G，那么就對應的省略1或者2個G)；根據選擇的sgRNA，獲得其對應DNA的互補鏈，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火,退火之后形成可以連入U6真核表達載體的雙鏈,如下:
針對RecQL4-sg1：gcaagcgcggaggccgggcgggcg，設計的正向寡核苷酸(Forward oligo)為：ccggcaagcgcggaggccgggcgggcg(SEQ ID NO：21)；反向寡核苷酸(Reverse oligo)為aaacgcccgcccggcctccgcgcttgc(SEQ ID NO：22)。
三、sgRNA寡聚核苷酸質粒的構建
1.線性化pGL3-U6-sgRNA質粒。
2.將退火的sgRNA寡聚核普酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質粒連接獲得pGL3-U6-RecQL4-sg1質粒。
3.轉化并涂Amp+平板(50微克/ml)。
4.用通用引物U6測序的方法鑒定陽性克隆，所述引物為
atggactatcatatgcttaccgta。
5.37度搖床搖菌過夜并用質粒抽提試劑盒抽提pGL3-U6-RecQL4sg質粒。
四、轉染細胞獲得RecQL4基因敲除細胞
1、按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手冊，將分別帶有對應sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-RecQL4-sg1質粒與pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質?；靹?，共轉染細胞。
2、用T7EN1酶切檢測和TA克隆測序確認RecQL4基因己經被敲除。
有益的效果
本發(fā)明利用CRISPR_Cas9系統(tǒng)進行哺乳動物基因打靶，其優(yōu)點是：
l、sgRNA特異性識別DNA序列中的NGG三個堿基對，識別規(guī)則簡單且易分析，在靶基因中可以同時找到多個sgRNA識別位點，從而可以根據打靶要求進行選擇，適用性廣泛；
2、相比于ZFNs和TALENs的復雜表達結構，siRNA的使用復雜以及效率低下，CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的Cas9表達結構是固定不變的，針對不同基因只需要將的識別序列插入sgRNA表達結構中即可完成系統(tǒng)組建，操作簡單，成本低，適用于大規(guī)模的哺乳動物基因打靶工作；
3、利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)繼續(xù)細胞轉染時，由于sgRNA表達結構很短，所以可以大大提高轉染效率，也可以將Cas9和sgRNA表達結構整合到一個載體中，進一步提高轉染效率，這都是ZFNs和TALENs很難做到的；
4、針對同一家族的不同基因或不同物種的同一基因進行基因打靶時，可以選擇基因中的保守區(qū)進行sgRNA設計，從而實現同一條sgRNA對多個基因的打靶或修飾，相比其他技術更加簡便、高效；
5、可以通過向哺乳動物中同時導入一個Cas9表達結構和多個sgRNA的方式輕松實現多基因同時打靶，無論從打靶效率還是操作簡便程度上都是其他技術無法比擬的；
6、使用CRISPR打靶，能夠從根源性上將基因進行敲除，從而使得治療效果更穩(wěn)定。
具體實施方式
下面結合附圖和具體的實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步介紹。
實施例1sgRNA的設計
首先根據SEQ ID NO：1所示的RecQL4基因上選擇5’-GGN(19)GG的序列，如果沒有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。sgRNA在STAT6基因上的靶向位點位于基因的外顯子。在UCSC數據庫中用BLAT或NCBI數據庫中用BLAST，確定sgRNA的靶序列是否唯一。同時根據其他的sgRNA的設計規(guī)則，共設計了57個sgRNA，然而通過最后的實驗證實，其中只有17個具有靶向修飾的功能，在此，沒有功能的序列就不一一列舉，僅僅給出2個反例，這也充分說明在現有技術中，sgRNA的設計并不不能僅僅根據設計規(guī)則不需要實驗即可得到有功能的sgRNA，本發(fā)明涉及的sgRNA序列如下：
RecQL4-sg1：gcaagcgcggaggccgggcgggcg(SEQ ID NO:2)
RecQL4-sg2：ggcgtgggagcgcgcgttccgac(SEQ ID NO:3)
RecQL4-sg3：acgtggaggcggcgccggaggaga(SEQ ID NO:4)
RecQL4-sg4：cagcggctcaaggccaatctgaaa(SEQ ID NO:5)
RecQL4-sg5：ccaaggccaggccggctccagc(SEQ ID NO:6)
RecQL4-sg6：cagtgaggtcccagattttctggg(SEQ ID NO:7)
RecQL4-sg7：aacttctgatccctggtgagtc(SEQ ID NO:8)
RecQL4-sg8：agtggaggcgagaagcggagat(SEQ ID NO:9)
RecQL4-sg9：gagccctgggagagccccgcaca(SEQ ID NO:10)
RecQL4-sg10：caagctagggctgggaaggctga(SEQ ID NO:11)
RecQL4-sg11：ctactccctggggccctcagggcag(SEQ ID NO:12)
RecQL4-sg12：gccggctgaggtgttccaggccct(SEQ ID NO:13)
RecQL4-sg13：gtgcagtcatgcggatcctgtct(SEQ ID NO:14)
RecQL4-sg14：actcatggatgaccaggtgtct(SEQ ID NO:15)
RecQL4-sg15：caaggcggcctgcatacactc(SEQ ID NO:16)
RecQL4-sg16：gcaaccggcgcgaggacacagagc(SEQ ID NO:17)
RecQL4-sg17：ggcctttgggatggggctggacc(SEQ ID NO:18)
RecQL4-sg18：gcggcggccgaagaggcgccagag(SEQ ID NO:19)
RecQL4-sg19：gcaggcctgatctaggctcaga(SEQ ID NO:20)
實施例2、構建sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈
根據選擇的sgRNA：RecQL4-sg1,在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸
(Forward oligo)(如果序列本身在5’端已經有1或者2個G，那么就對應的省略1或者2個G)；根據選擇的sgRNA，獲得其對應DNA的互補鏈，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，設計的正向寡核苷酸(Forward oligo)為：
ccggcaagcgcggaggccgggcgggcg(SEQ ID NO：21)；反向寡核苷酸(Reverse oligo)為aaacgcccgcccggcctccgcgcttgc(SEQ ID NO：22)。
將合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火,退火之后形成可以連入U6真核表達載體的雙鏈,如下:
所述條件為：2.5μl forward Oligo(100μM)，2.5μl reverse Oligo(100μM)，1u 1NEB buffer，4μl滅菌水。在PCR儀中按照以下touch down程序運行:95度,5min；95-83度at-1.8度/s；85-24度at-0.1度/s；hold at4度。
實施例3、sgRNA寡聚核苷酸質粒的構建
1.線性化pGL3-U6-sgRNA質粒。酶切體系和條件如下:2μg pGL3-U6-sgRNA(400ng/u 1)；1μ1CutSmart Buffer；1μ1BsaI(NEB,R0535L)；補水至50μ1,37度孵育3-4小時，每隔一段時間振蕩一下并離心以防液滴蒸發(fā)至管蓋上。
2.將退火的sgRNA寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質粒連接獲得pGL3-U6-RecQL4-sg1質粒。
3.轉化并涂Amp+平板(50微克/ml)。
4.用通用引物U6測序的方法鑒定陽性克隆，所述引物為
atggactatcatatgcttaccgta。
5.37度搖床搖菌過夜并用質粒抽提試劑盒抽提pGL3-U6-RecQL4-sg1質粒。
實施例4、轉染細胞獲得RecQL4基因敲除細胞
(1)乳腺癌細胞T47D接種培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)液中，其中含10％FBS，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100微克/ml)。(2)在轉染前分至12孔板中，待80％密度時進行轉染。按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手冊，將分別帶有對應sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-RecQL4-sg1質粒1微克與pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質粒2微克混勻，共轉染至每孔細胞中，6.5h換液，加入Blasticidin和Puromycin藥篩，48小時后收集細胞。
T7EN1酶切檢測
將收集的細胞在裂解液(10u M Tris-HCl,0.4M NaCl,2u M EDTA,1％SDS)中用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50u 1去離子水中。(2)使用引物，上游序列為：ctggacgatcgcaagcgcgg，下游引物為：gcacgtagctctcgaagctt(2440bp擴增大小)進行PCR擴增，純化獲得PCR回收產物，取200ng統(tǒng)一稀釋到20u 1,在20u 1體系中加入T7EN1 0.3u 1,37 0C酶切30分鐘后，加入2u 1lOXLoading Buffer，用2.5％的瓊脂糖膠電泳檢測。結果顯示，通過瓊脂糖膠電泳可以發(fā)現:發(fā)生斷裂末端連接修復的基因組因為與原基因組不完全匹配，而被T7EN1切割。顯示出較小的條帶。說明基因敲除成功。
將上述步驟獲得的PCR回收產物用rTaq進行加A反應。加A反應體系為:800ng PCR回收產物，5u 1lOX Buffer(Mg2+free)，3u 1Mg2+，4u 1dNTP，0.5u 1rTaq(TAKARA,ROOlAM)，補水至50u 1體系。
37度溫育30分鐘后，取lul產物與pMD19-T vector連接并轉化感受態(tài)細胞DH5a。挑取單克隆以通用引物U6序列atggactatcatatgcttaccgta測序，根據測序結果發(fā)現:靶基因RecQL4缺失了sgRNA靶序列，基因敲除成功。
實施例5
將乳腺癌細胞T47D細胞敲除前后的各取1X 106細胞，收獲后，用新鮮加入了各種抑制劑(1mM Na orthovanadate,1mMPMSF,10μg/ml Aprotinin,
Leupeptin,胃酶抑素)的2Oμl裂解液(5OmMHEPES[pΗ7.0],1％NP-40,5mM EDTA,450mM NaCl,IOmM Na pyrophosphate和50mM NaF)在室溫下超聲處理后，加入I％β巰基乙醇，100℃中放置5分鐘。在SDS-PAGE膠中，每孔上樣10μ1樣品。電泳后轉膜將蛋白樣品轉移到硝酸纖維素膜上。轉膜結束后用TTBS洗膜一次，用5％脫脂奶粉封閉膜1小時，用TTBS洗膜一次，將稀釋后的一抗與膜室溫雜交2小時或4℃過夜。用TTBS洗滌三次后將稀釋后的二抗與膜室溫雜交1小時，用TTBS洗滌后加入底物顯色，暗室曝光，其中以actin作為內參蛋白對照。
結果顯示，敲除了RecQL4基因的細胞中的RecQL4蛋白的表達相對于原始細胞，蛋白的表達量顯著下降95.8％，這也充分的說明，通過敲除RecQL4的目的已經達到。
實施例6其它sgRNA效果驗證
sgRNA選擇RecQL4-sg2～19，按照實施例2-5相同的實驗方法進行相應的基因敲除以及蛋白水平檢測，在此，由于步驟基本相同，具體的操作條件就不一一贅述。通過實驗發(fā)現，STAT6-sg2～17，這16個sgRNA可以實現基因的敲除，其敲除效率達到了88％以上，而RecQL4-sg18、RecQL4-sg19都沒有實現基因的敲除，這也說明sgRNA的選擇并非簡單容易的。
另外蛋白表達水平檢測的結果如下：
從以上結果可以看出，RecQL4-sg1～17都能夠實現基因的敲除，并且都能夠達到相似的降低RecQL4蛋白表達的效果。
實施例7敲除后細胞的腫瘤致病性驗證
將RecQL4基因敲除前后的乳腺癌細胞T47D細胞進行小鼠致病性檢測：以每只小鼠200μI PBS中200萬個細胞的劑量，經皮下注射入基因分別敲除前后的小鼠中，每個敲除后的細胞設置10個重復。通過每周測量腫瘤大小、體重和生物光學成像來監(jiān)測癌癥生長、侵入和轉移。8周后，檢測結果如下：
從以上結果可以看出，敲除了RecQL4的癌細胞在致病性上得到了顯著的降低。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表
〈110〉李蒙
〈120〉一種CRISPR-Cas9系統(tǒng)及其用于治療乳腺癌疾病的應用
〈160〉22
〈210〉1
〈211〉3840
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4
1 ctggacgatc gcaagcgcgg aggccgggcg ggcgcgcgcg ccatggagcg gctgcgggac
61 gtgcgggagc ggctgcaggc gtgggagcgc gcgttccgac ggcagcgcgg gcggcgaccg
121 agccaggacg acgtggaggc ggcgccggag gagacccgcg cgctctaccg ggaataccgc
181 actctgaagc gtaccacggg ccaggccggc ggcgggctcc gcagctccga gtcgctcccc
241 gcggcggccg aagaggcgcc agagccccgc tgctgggggc cccatctgaa tcgggctgcg
301 accaagagtc cacagcctac gccagggcgg agccgccagg gctcggtgcc ggactacggg
361 cagcggctca aggccaatct gaaaggcacc ctgcaggccg gaccagccct gggccgcaga
421 ccgtggcctc taggaagagc ctcatctaag gcatccaccc caaagccccc aggtacaggg
481 cctgtcccct cctttgcaga aaaagtcagt gatgagcctc cacagctccc tgagccccag
541 ccaaggccag gccggctcca gcatctgcag gcatccctga gccagcggct gggctcccta
601 gatcctggct ggttacagcg atgtcacagt gaggtcccag attttctggg ggcccccaaa
661 gcctgcaggc ctgatctagg ctcagaggaa tcacaacttc tgatccctgg tgagtcggct
721 gtccttggtc ctggtgctgg ctcccagggc ccagaggctt cagccttcca agaagtcagc
781 atccgtgtgg ggagccccca gcccagcagc agtggaggcg agaagcggag atggaacgag
841 gagccctggg agagccccgc acaggtccag caggagagca gccaagctgg acccccatcg
901 gagggggctg gggctgtagc agttgaggaa gaccctccag gggaacctgt acaggcacag
961 ccacctcagc cctgcagcag cccatcgaac cccaggtacc acggactcag cccctccagt
1021 caagctaggg ctgggaaggc tgagggcaca gcccccctgc acatcttccc tcggctggcc
1081 cgccatgaca ggggcaatta cgtacggctc aacatgaagc agaaacacta cgtgcggggc
1141 cgggcactcc gtagcaggct cctccgcaag caggcatgga agcagaagtg gcggaagaaa
1201 ggggagtgtt ttgggggtgg tggtgccaca gtcacaacca aggagtcttg tttcctgaac
1261 gagcagttcg atcactgggc agcccagtgt ccccggccag caagtgagga agacacagat
1321 gctgttgggc ctgagccact ggttccttca ccacaacctg tacctgaggt gcccagcctg
1381 gaccccaccg tgctgccact ctactccctg gggccctcag ggcagttggc agagacgccg
1441 gctgaggtgt tccaggccct ggagcagctg gggcaccaag cctttcgccc tgggcaggag
1501 cgtgcagtca tgcggatcct gtctggcatc tccacgctgc tggtgctgcc tacaggtgcc
1561 ggcaagtccc tgtgctacca gctcccagcg ctgctctaca gccggcgcag cccctgcctc
1621 acgttggtcg tctctcccct gctgtcactc atggatgacc aggtgtctgg cctgccaccg
1681 tgtctcaagg cggcctgcat acactcgggc atgaccagga agcaacggga atctgtcctg
1741 cagaagattc gggcagccca ggtacacgtg ctgatgctga cacctgaggc actggtgggg
1801 gcgggaggcc tccctccagc cgcacagctg cctccagttg cttttgcctg cattgatgag
1861 gcccactgcc tctcccagtg gtcccacaac ttccggccct gctacctgcg cgtctgcaag
1921 gtgcttcggg agcgcatggg cgtgcactgc ttcctgggcc tcacagccac agccacacgc
1981 cgcactgcca gtgacgtggc acagcacctg gctgtggctg aagagcctga cctccacggg
2041 ccagccccag ttcccaccaa cctgcacctt tccgtgtcca tggacaggga cacagaccag
2101 gcactgttga cgctgctgca aggcaaacgt tttcaaaacc tcgattccat tatcatttac
2161 tgcaaccggc gcgaggacac agagcggatc gctgcgctcc tccgaacctg cctgcacgca
2221 gcctgggtcc cagggtctgg aggtcgtgcc cccaaaacca cagccgaggc ctaccacgcg
2281 ggcatgtgca gccgggaacg gcggcgggta cagcgagcct tcatgcaggg ccagttgcgg
2341 gtggtggtgg ccacggtggc ctttgggatg gggctggacc ggccagatgt gcgggctgtg
2401 ctgcatctgg ggctgccccc aagcttcgag agctacgtgc aggccgtggg ccgggccggg
2461 cgtgacgggc agcctgccca ctgccacctc ttcctgcagc cccagggcga agacctgcga
2521 gagctgcgca gacatgtgca cgccgacagc acggacttcc tggctgtgaa gaggctggta
2581 cagcgcgtgt tcccagcctg cacctgcacc tgcaccaggc cgccctcgga gcaggaaggg
2641 gccgtgggtg gggagaggcc tgtgcccaag tacccccctc aagaggctga gcagcttagc
2701 caccaagcag ccccaggacc cagaagggtc tgcatgggcc atgagcgggc actcccaata
2761 cagcttaccg tacaggcttt ggacatgccg gaggaggcca tcgagacttt gctgtgctac
2821 ctggagctgc acccacacca ctggctggag ctgctggcga ccacctatac ccattgccgt
2881 ctgaactgcc ctgggggccc tgcccagctc caggccctgg cccacaggtg tccccctttg
2941 gctgtgtgct tggcccagca gctgcctgag gacccagggc aaggcagcag ctccgtggag
3001 tttgacatgg tcaagctggt ggactccatg ggctgggagc tggcctctgt gcggcgggct
3061 ctctgccagc tgcagtggga ccacgagccc aggacaggtg tgcggcgtgg gacaggggtg
3121 cttgtggagt tcagtgagct ggccttccac cttcgcagcc cgggggacct gaccgctgag
3181 gagaaggacc agatatgtga cttcctctat ggccgtgtgc aggcccggga gcgccaggcc
3241 ctggcccgtc tgcgcagaac cttccaggcc tttcacagcg tagccttccc cagctgcggg
3301 ccctgcctgg agcagcagga tgaggagcgc agcaccaggc tcaaggacct gctcggccgc
3361 tactttgagg aagaggaagg gcaggagccg ggaggcatgg aggacgcaca gggccccgag
3421 ccagggcagg ccagactcca ggattgggag gaccaggtcc gctgcgacat ccgccagttc
3481 ctgtccctga ggccagagga gaagttctcc agcagggctg tggcccgcat cttccacggc
3541 atcggaagcc cctgctaccc ggcccaggtg tacgggcagg accgacgctt ctggagaaaa
3601 tacctgcacc tgagcttcca tgccctggtg ggcctggcca cggaagagct cctgcaggtg
3661 gcccgctgac tgcactgcat tgggggatgt cgggtagagc tggggttgtc agaggctagg
3721 gcagtgactg aggacctggg caaaacctgc cacagggtgt gggaacgagg aggctccaaa
3781 atgcagaata aaaaatgctc actttgtttt tatgggaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
〈210〉2
〈211〉 24
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg1
gcaagcgcggaggccgggcgggcg(SEQ ID NO:2)
〈210〉3
〈211〉 23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg2
ggcgtgggagcgcgcgttccgac(SEQ ID NO:3)
〈210〉4
〈211〉 24
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg3
acgtggaggcggcgccggaggaga(SEQ ID NO:4)
〈210〉5
〈211〉 24
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg4
cagcggctcaaggccaatctgaaa(SEQ ID NO:5)
〈210〉6
〈211〉 22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg5
ccaaggccaggccggctccagc(SEQ ID NO:6)
〈210〉7
〈211〉 24
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg6
cagtgaggtcccagattttctggg(SEQ ID NO:7)
〈210〉8
〈211〉 22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg7
aacttctgatccctggtgagtc(SEQ ID NO:8)
〈210〉9
〈211〉 22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg8
agtggaggcgagaagcggagat(SEQ ID NO:9)
〈210〉10
〈211〉 23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg9
gagccctgggagagccccgcaca(SEQ ID NO:10)
〈210〉11
〈211〉 23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg10
caagctagggctgggaaggctga(SEQ ID NO:11)
〈210〉12
〈211〉 25
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg11
ctactccctggggccctcagggcag(SEQ ID NO:12)
〈210〉13
〈211〉 24
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg12
gccggctgaggtgttccaggccct(SEQ ID NO:13)
〈210〉14
〈211〉 23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg13
gtgcagtcatgcggatcctgtct(SEQ ID NO:14)
〈210〉15
〈211〉 22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg14
actcatggatgaccaggtgtct(SEQ ID NO:15)
〈210〉16
〈211〉 21
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg15
caaggcggcctgcatacactc(SEQ ID NO:16)
〈210〉17
〈211〉 24
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg16
gcaaccggcgcgaggacacagagc(SEQ ID NO:17)
〈210〉18
〈211〉 23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg17
ggcctttgggatggggctggacc(SEQ ID NO:18)
〈210〉19
〈211〉 24
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg18
gcggcggccgaagaggcgccagag(SEQ ID NO:19)
〈210〉20
〈211〉 22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉RecQL4-sg19
gcaggcctgatctaggctcaga(SEQ ID NO:20)
〈210〉21
〈211〉 27
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉上游引物
ccggcaagcgcggaggccgggcgggcg（SEQ ID NO：21）
〈210〉22
〈211〉 27
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉下游引物
aaacgcccgcccggcctccgcgcttgc（SEQ ID NO：22）